一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的snp标记及其筛选和应用
【专利摘要】本发明涉及一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用，属于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域；本发明从SOD基因中克隆得到一个SNP分子标记，该SNP 标记为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列自5’端起第118位碱基中的R为C或T，该标记与凡纳滨对虾耐低溶氧性状显著相关，可应用于凡纳滨对虾低溶氧抗逆性状的分子标记辅助选择育种；采用本发明技术方案可根据实际育种需求对凡纳滨育种材料进行早期选择，有效提高育种的效率和准确性，提高凡纳滨对虾繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出抗逆性强的凡纳滨对虾品种；本发明方法实用性强、适用性广。
【专利说明】
一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用，属 于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域。
【背景技术】
[0002] 凡纳滨对奸(ZiiOjOaoaeus ra/ioa?ei)也称南美白对奸，隶属节肢动物门，甲壳纲， 十足目，对虾科，滨对虾属，为广温广盐性热带虾类。凡纳滨对虾因具有生长速度快、抗病能 力强、抗逆性强、适应高密度养殖等优良特性，已成为我国最主要的对虾养殖品种之一。近 年来，凡纳滨对虾的高密度养殖模式得到广泛的推广，但在对虾高密度养殖过程中，由于养 殖水体受季节性温度和盐度的变化、水中生物的呼吸代谢、有机物的分解腐烂等因素影响， 到了养殖后期养殖水体极易出现缺氧情况，从而影响对虾的生长、摄食和蜕皮，造成对虾免 疫力、抗病力、消化力下降，出现生长缓慢、对细菌和病毒的敏感性提高、死亡率高等现象。 因此，利用遗传育种技术培育耐低溶氧的凡纳滨对虾新品种是解决以上问题的有效办法。
[0003] 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因组序列中某 一位置上碱基的变异，其中变异的形式包括转换、颠换、插入、缺失等，可发生在DNA的任意 位置上，且任意位置上任一种等位基因在种群中的发生频率高于1%ΑΝΡ作为第三代分子标 记，因其具有数量巨大、分布广泛、共显性、高度稳定、易于自动化规模分析、能显示其他技 术无法检测的隐藏多态性、可能与基因功能相关的众多优点，在分子标记辅助育种中得到 广泛的应用。对动物功能基因 SNPs的研究不仅有助于了解功能基因的作用，而且还可获得 功能基因与经济性状相关联的分子遗传标记。在凡纳滨对虾分子标记辅助育种的研究中， 不少国内外学者利用SNP分子标记技术对凡纳滨对虾重要的功能基因进行SNP位点的筛查 以及相关性分析，如已有学者利用SNP分子标记技术对凡纳滨对虾AMY基因进行的单核苷酸 多态性研究，在凡纳滨对虾AMY基因中共筛查出9个SNP位点;又有学者研究了凡纳滨对虾组 织蛋白酶CTSL基因的多态性并与生长性状相关联，发现2个与生长性状显著相关的SNP位 点；还有学者研究了凡纳滨对虾Hsp70基因 SNPs与抗病毒特性的相关性，结果发现Hsp70基 因不同基因型对凡纳滨对虾的抗病性有显著影响。以上研究多集中于分析凡纳滨对虾生 长、抗病等相关基因的多态性，但未见有与凡纳滨对虾耐低溶氧性状相关基因 SNP分子标记 的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记，该分子标 记可应用于凡纳滨对虾低溶氧抗逆性状的分子标记辅助选择育种，进行凡纳滨对虾耐低溶 氧性状的标记辅助选择及应用。。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记，从S0D基因中克隆得到一个SNP分子 标记，该SNP标记为SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列自5 '端起第118位碱基中的R为C或T; SEQ ID Ν0.1所示核苷酸序列如下：
R[C/T]GAGAGCTTTGGATCATTCCAGTCCTTCAAGGTGGGTTTCTTGTGATGGTCA。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供扩增上述S0D基因片段的引物对，可作为检测该 SNP标记的试剂盒的组成之一，用于本发明SNP标记所在的片段的PCR扩增，并通过测序，判 断待测凡纳滨对虾该SNP标记位点的基因型。本发明所述引物对具体是引物S0D-FP和引物 S0D-RP，是以凡纳滨对虾超氧化物歧化酶S0D基因 （GenBank Accession NO.DQ298206.1)序 列为模板，利用PrimierPremier3.0软件设计所得。所述引物S0D-FP为SEQIDN0.2所示 序列，引物S0D-RP为SEQ ID NO. 3所示序列：
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记的 筛选方法，包括如下步骤： (1) 以经96h低溶氧胁迫实验后死亡和存活的凡纳滨对虾个体的基因组DNA为模板，利 用上述的引物对，即引物S0D-FP和引物S0D-RP进行PCR扩增，获得扩增片段，扩增片段的长 度为169bp; (2) 将步骤(1)获得的扩增片段进行测序，得到SOD基因部分序列以及测序峰图，将序列 结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点； (3) 利用chromas软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在SNP位点处出现双峰是杂 合基因型，单峰则是纯合基因型；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾低溶氧性耐受 性与基因型进行相关性分析。
[0008] 步骤（1)所述基因组DNA的提取方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组 DNA提取方法或试剂盒进行;对基因组DNA进行PCR扩增的条件也不受特别限制，PCR扩增条 件可以由本领域技术人员进行优化选择。
[0009] 由于直接测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。该 方法只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增得到的产物，通过测序即可直接检测到SNP 位点。因此，本发明优选采用直接测序的方法进行SNP标记的检测。
[0010] 经过上述技术方案所述步骤获得的SNP位点可应用于凡纳滨对虾耐低溶氧性的选 育过程，具体是在凡纳滨对虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行SNP位点 分型，再结合其他与抗逆性状相关位点的分型信息，优先选择SNP位点为TT基因型或TC基因 型的个体作为耐低溶氧凡纳滨对虾选育的亲本或者进行规模化养殖，避免选择SNP位点为 CC基因型的凡纳滨对虾个体作为亲本或者进行规模养殖。
[0011] 本发明的有益效果是： (1)经统计发现，本发明所述SNP标记的位点处基因型为TT或TC的凡纳滨对虾的低溶氧 耐受性显著高于基因型为纯合CC的凡纳滨对虾，进而，通过检测凡纳滨对虾的上述SNP位 点，能够有效地确定其低溶氧的耐受性能;本发明的SNP标记与凡纳滨对虾的耐低溶氧性状 紧密相关，能够有效用于凡纳滨对虾的分子标记辅助育种。
[0012] (2)采用本发明技术方案可根据实际育种需求对凡纳滨育种材料进行早期选择， 有效提高育种的效率和准确性，提高凡纳滨对虾繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效 地选育出抗逆性强的凡纳滨对虾品种； (3)方法实用性强、基因组DNA提取、测序方法没有特定要求，适用性广。
【附图说明】
[0013]图！实施例中S0D基因第118位点单倍型为ττ峰值图； 图2实施例中S0D基因第118位点单倍型为TC峰值图； 图3实施例中S0D基因第118位点单倍型为CC峰值图。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限 制本发明的范围。
[0015] 实施例1 本实施例通过对凡纳滨对虾超氧化物歧化酶S0D基因的部分序列进行测序和BLAST比 对，筛查出1个SNP位点，位于凡纳滨对虾S0D基因第118位碱基处，发生了C/T突变。该SNP分 子标记可通过直接测序法，在凡纳滨对虾群体中检测其位点多态性，并分析位点基因型频 率与凡纳滨对虾低溶氧耐受性的相关性。
[0016] 凡纳滨对虾S0D基因中SNP位点118C>T与低溶氧耐受性的相关性分析，按照下列步 骤进行： (A) 实验样品分组； (B) 凡纳滨对虾基因组DNA提取:本实施选择采用常规酚氯仿方法； (C) 凡纳滨对虾S0D基因 SNP位点筛查，位点118C>T分型； (D) 118C>T基因型与低溶氧耐受性性状的相关性分析； (E) 位点118C>T辅助凡纳滨对虾低溶氧耐受性品种的选育。
[0017] 具体操作如下： (A)实验样品分组 通过低溶氧胁迫试验将64尾凡纳滨对虾进行分组:将经96h低溶氧胁迫试验后死亡对 虾归入低溶氧应激敏感组，存活的对虾归入低溶氧应激耐受组，其中应激敏感组的凡纳滨 对虾数为31尾，应激耐受组的凡纳滨对虾数为33尾。
[0018] (B)凡纳滨对虾DNA提取 取凡纳滨对虾肌肉30-40mg，加入400yL 1 XTE裂解液剪碎，依次加入200yL 10%的SDS、 8yL蛋白酶K(20mg/mL)，37°C裂解30min，再至于55°C消化至澄清透明，约l_2h;往澄清的裂 解液中加入等体积酸/氯仿/异戊醇（25: 24:1)溶液，颠倒充分混勾，12000rpm/min离心 20min;小心移取上清液至新的离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒充分混 勾，离心15min，抽提2到3次;小心移取上清液至新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙 醇，颠倒充分混勾，放入-20°C冰箱内静置30min; 12000rpm/min离心15min，弃上清，加入70% 乙醇洗涤2-3次，每次离心2min，室温晾干，加入150yLl X TE Buf f er保存。用1%琼脂糖凝胶 检测样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
[0019] (C)凡纳滨对虾SOD基因 SNP位点筛选及位点118C>T分型。
[0020] 在NCBI网站中得到凡纳滨对4下超氧化物歧化酶S0D基因 （GenBank Accession N0.DQ298206.1)序列，通过Primier Premier 3.0软件设计得到特异性引物对S0D-FP和 S0D-RP。以经低溶氧胁迫96小时实验后死亡群体和存活群体凡纳滨对虾(64尾)基因组DNA 为模板，利用上述引物在PCR条件下进行扩增。PCR反应体系为25yL: DNA模板40ng，10 X PCR Buffer(Mg2+plus) 2.5yL，dNTP s 2yL，上游引物2yL，下游引物2yL，Taq酶（5U/yL) 0·2μ L，补双蒸水至总体积为25μΙ^Ρ0Κ扩增反应程序如下：95°C预变性5min，95°C变性30S，58°C 退火35s，72°C延伸lmin，共进行35个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。将PCR产物直接送 于上海生工进彳丁测序。
[0021] 利用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对，筛选S0D基因的SNP位点。通过Chromas 软件查看测序图谱，通过人工校对判断出每个凡纳滨对虾个体SNP位点的基因型，出现双峰 则说明是杂合型，单峰则是纯合型，并统计低溶氧应激敏感组与耐受组各基因型和等位基 因的个体数。图1为本实施例中S0D基因第118位点单倍型为TT峰值图；图2为本实施例中S0D 基因第118位点单倍型为TC峰值图；图3为本实施例中SOD基因第118位点单倍型为CC峰值 图。
[0022] (D)118C>T基因型与耐低溶氧性状的相关性分析。
[0023] 据测序结果，统计经低溶氧胁迫实验96小时后死亡凡纳滨对虾个体(31尾)和存活 群体凡纳滨对虾个体(33尾），共64尾凡纳滨对虾个体118C>T位点基因型的情况，计算各组 中该多态位点的基因型频率及等位基因频率，统计结果见表1。
[0024] 表1 S0D基因型和等位基因频率
利用SPSS19.0软件的卡方检验方法分析位点118C>T与凡纳滨对虾低溶氧耐受性的相 关性，结果表明：在位点118C>T中，TT、TC和CC3种不同基因型的分布与低溶氧耐受性有显著 关联性(妒=6.515，？ = 0.038)，2种等位基因(：和1'也显示出与低溶氧耐受性的关联性(妒 =6.874，P = 0.009)。结果表明：500基因位点11801'点的基因型多态性对凡纳滨对虾低溶 氧耐受性有极显著的影响，TT和TC基因型个体耐低溶氧性能优于CC基因型。优先选择位点 118C>T为TT型或TC型的个体，作为耐低溶氧凡纳滨对虾选育的亲本或者进行规模养殖，尽 量避免选择118C>T位点为CC型作为亲本或者进行规模养殖。
[0025] 序列表 〈110>广东海洋大学 〈120>-种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用
【主权项】
1. 一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记，其特征在于：从凡纳滨对虾SOD基 因中克隆得到一个SNP分子标记，该SNP标记为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列自5'端起第 118位碱基中的1?为(：或1'; SEQ ID N0.1所示核苷酸序列如下： CCTAGCTTCTCAGCTATCAGTTCATGGAGGCGGCCACTTGAACCACACCATCTTCTGGACCAACATGGCTCCC GATGCTGGTGGCGAGCCGCAAGGAGCTGTTGCACAAGCCATTGA C/TGAGAGCTTTGGATCATTCCAGTCCTTCAAGGTGGGTTTCTTGTGATGGTCA。2. 根据权利要求1所述的一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记，其特征在 于:所述的凡纳滨对虾SOD基因，其基因片段扩增的引物对为引物S0D-FP和引物S0D-RP，可 作为检测该SNP标记试剂盒的组成之一，用于SNP标记所在片段的PCR扩增，并通过测序，判 断待测凡纳滨对奸该SNP标记位点的基因型。3. 根据权利要求2所述一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记，其特征在于： 所述引物对是以凡纳滨对虾超氧化物歧化酶SOD基因 GenBank Accession N0.DQ298206.1 序列为模板，利用PrimierPremier3.0软件设计所得，所述引物S0D-FP为SEQIDN0.2所 示序列，引物S0D-RP为SEQ ID NO. 3所示序列： SEQ ID N0.2：AGGCAGCCAATGACGTAAGCG； SEQ ID N0.3:GACCATCACAAGAAACCCACC。4. 一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记的筛选方法，其特征在于:包括如下 步骤： (1) 以经96小时低溶氧胁迫实验后死亡和存活的凡纳滨对虾个体的基因组DNA为模板， 利用引物对S0D-FP和S0D-RP进行PCR扩增，获得扩增片段； (2) 将步骤（1)获得的扩增片段进行测序，得到SOD基因部分序列以及测序峰图，将序列 结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点； (3) 利用chromas软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在SNP位点处出现双峰则说 明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾低溶氧性耐受性 与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾低溶氧耐受性显著相关的SNP标记。5. 根据权利要求4所述一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记的筛选方法，其 特征在于:步骤（1)所述基因组DNA的提取方法不受特别限制，采用任何已知的基因组DNA提 取方法或试剂盒进行;对基因组DNA进行PCR扩增的条件也不受特别限制，PCR扩增条件由本 领域技术人员进行选择。6. 根据权利要求4所述一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记的筛选方法，其 特征在于:步骤(1)所述扩增片段的长度为169bp。7. 根据权利要求4所述一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记的筛选方法，其 特征在于:步骤(2)对扩增片段的测序采用直接测序的方法，在SNP位点的两侧设计一对引 物，扩增得到的产物，通过测序即可直接检测到SNP位点。8. -种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记的应用，其特征在于:利用权利要求 4所述方法获得的SNP位点应用于凡纳滨对虾低溶氧耐受性的选育过程，具体是在凡纳滨对 虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行SNP位点分型，再结合与低溶氧耐受 性状相关位点的分型信息，选择SNP位点为TT基因型或TC基因型的个体作为耐低溶氧凡纳 滨对虾选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择SNP位点为CC基因型的凡纳滨对虾个体作 为亲本或者进行规模养殖。
【文档编号】C12N15/11GK105936937SQ201610467855
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】刘建勇, 陈晓敏, 吴勇
【申请人】广东海洋大学