一种凡纳滨对虾nLvALF1基因的抗WSSV候选分子标记在对虾遗传育种中的应用
【专利摘要】本发明属于水产动物遗传育种学领域，涉及一种凡纳滨对虾nLvALF1基因的抗WSSV候选分子标记在对虾遗传育种中的应用。通过前期研究，利用关联分析方法筛选出nLvALF1基因中与抗WSSV显著相关的三个SNP标记(P<0.05)。本专利进一步将这三个SNP标记在其他的遗传育种材料中的抗性品系和非抗性品系中进行SNP分型，最终筛选到一个与抗WSSV显著相关的SNP标记nLvALF1g?114–T>C，该位点的CC型在抗性品系中的基因型频率显著高于非抗性品系，利用该标记建立了一套分子标记辅助抗WSSV遗传选育的方法。本发明为分子标记辅助抗病育种提供了一种候选的技术手段，为对虾抗WSSV品种选育的研究中提供了基础。
【专利说明】
-种凡纳滨对邮nLvALH基因的抗WSSV候选分子标巧在对邮 遗传育种中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于水产动物遗传育种学领域，设及一种凡纳滨对邮化vALFl基因的抗 WSSV候选分子标记在对邮遗传育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国是对邮养殖大国，对邮养殖的产量达150多万吨，位居世界首位，其中养殖规 模和产量最大的对邮品种是凡纳滨对邮，产量在120万吨左右。近年来，随着养殖规模的扩 大和养殖模式的日益精细化，对于高产、抗病良种的需求越来越大，因此通过遗传选育方法 培育高产、抗病的凡纳滨对邮良种对于促进凡纳滨对邮产业的健康发展具有重要的意义。
[0003] 凡纳滨对邮的遗传选育工作已经进行了近30年，在数量遗传学理论的指导下，凡 纳滨对邮生长性状的遗传选育工作取得了显著进步，多个商品化苗种和人工培育新品种的 生长速度有了很大的提高。但是对于抗WSSV性状的遗传选育，遗传进展十分有限。WSSV自上 世纪90年代暴发W来一直对我国乃至世界对邮养殖业造成极大危害，世界每年因该病毒造 成的损失达10亿美元(相建海，海水养殖生物病害发生与控制.北京:海洋出版社，2001)。由 于WSSV具有很强的致病性和致死性，且病毒携带者会将病毒垂直传播给子代，因此用传统 的数量遗传学理论指导的传统选育工作进展缓慢。利用分子标记技术，筛选出抗WSSV相关 的分子标记，通过分子标记辅助抗病选育被认为是一种行之有效的育种手段。
[0004] 抗脂多糖因子(anti-1 ipopolysaccharide factor ,ALF)作为一种小型的抗菌肤， 具有显著的抗粗糖型革兰氏阴性菌和抗内毒素效应(Tanaka S,化kamura T,Mo;rita T,et al.1982.Limulus Anti-Lps Factor-an Anticoagulant Which Inhibits the Endotoxin-Mediated Activation of Limulus Coagulation System.Biochemical and Bio曲ysical Research Communications, 105(2):717-723.)功能研究的结果表明，甲壳动 物的ALF具有广谱、强效的抗菌活性（Beale K M,Towle D W,Jayasundara N,et al.2008.Anti-1ipopolysaccharide factors in the American lobster Homarus americanus:Molecular characterization and transcriptional response to Vibrio fluvialis challenge . Comparative Biochemistry and Physiology D-Genomics& Proteomics,3(4) :263-269.)，且其在抗病毒免疫中的功能不断得到证实。小龙邮注射活 性WSSV或UV灭活WSSV都引起ALF上调表达，但注射灭活病毒的群体死亡率低于注射活病毒 的群体，对ALF进行沉默后小龙邮体内WSSV繁殖速率显著提高化iu et al. ,2006)。另外，前 期的对于ALF基因的多态性分析发现其具有较高的遗传多样性(Yu Y，Wei J，Zhang X，et al.2014.SNP Discovery in the Transcriptome of White Pacific Shrimp Litopenaeus vannamei by Next Generation Sequencing.PLoS One ,9( 1).)，探究ALF基 因的遗传多样性与抗WSSV性状之间的关系，有助于筛选出抗WSSV相关的SNP位点，为辅助抗 WSSV品种的选育提供技术手段，能够为加快抗病品种的培育提供帮助。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是一种凡纳滨对邮化vALFl基因的抗WSSV候选分子标记及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
[0007] 一种凡纳滨对邮化vALFl基因的抗WSSV候选分子标记的应用，分子标记在遗传多 样性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用；所述分子标记为SEQUnLvALFlg中第114个位 置化vALFlg-114-T乂位点，在该位点中CC基因型在抗性群体中的基因型频率显著高于敏感 群体。
[000引一种辅助抗WSSV品种的选育方法：
[0009] 1)提取待分析材料的基因组的DNA;
[0010 ] 2 ) W待检测分析材料的基因组的D Μ为模板，使用如下引物对η L V A 1 F : TTTGTCTGAAGAGGAACTCGTGAAG;和 nLvAlR: TTGCTCAGGGTTGGACAGGTCA 进行 PCR 扩增，根据扩增 产物获得SNP位点进行分型，获得分型信息；
[0011] 3)将上述获得的分型信息中选择CC基因型型个体进行留种和建立家系育种。
[0012] 本发明所具有的优点：
[0013] 本发明筛选凡纳滨对邮ALF基因（nLvALFl)中与抗WSSV性状显著相关的SNP标记， 并建立分子标记辅助抗WSSV选育的技术手段，指导抗WSSV对邮品种的选育。
[0014] 本发明分子标记选择育种操作简单，周期短，针对性强;而且通过标记辅助选择， 可W避免环境因素导致的选育误差，提高选育准确率。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于W下的实施例内容。
[0016] 本发明在前期研究的基础上，对通过关联分析获得的化vALFl基因组中与抗WSSV 相关的Ξ个SNP标记在另一育种群体中进行验证和筛选，最终获得了一个在不同群体中均 与抗WSSV显著相关的SNP标记化vALF 1 g-114- T乂，该位点的CC型在抗性品系中的基因型频 率显著高于非抗性品系。
[0017] 实施例1 :nLvALFlg-114-T〉C标记的获得
[0018] 投喂WSSV感染致死的病邮进行攻毒，确保攻毒成功后，收集最先死亡的邮作为敏 感群体，收集最后死亡的邮作为抗性群体，利用基因组数据获得化vALFl基因的序列全长， 并设计引物扩增基因组DNA序列，获得该序列中的SNP位点，获得化vALFl基因中的SNP位点， 并通过测序技术对运些SNP位点在抗性群体和敏感群体中进行基因分型，比较SNP标记在抗 性群体和敏感群体基因型和基因频率分布差异，筛选出两组间差异显著的位点（参见参考 文南犬Jin邑wen Liu, Yang Yu,Fuhua Li* ,Xiao jun Zhan邑，Jianhai Xian邑，2014. A new anti-1ipopolysaccharide factor(ALF)gene with its SNP polymorphisms related to WSSV resistance of L.vannamei.Fish and shellfish immunology,39:24-33)。
[0019] 通过上述方法获得Ξ个与WSSV抗性相关的位点，在本方案中，将上述Ξ个差异位 点进一步在另一选育群体中进行验证，筛选出在不同育种群体中均适合的标记用于指导遗 传选育，通过将Ξ个标记在的抗性育种材料和非抗性育种材料中进行验证，最终筛选获得 化vALFl基因中一个抗WSSV相关分子标记化vALFl-g-T/C，其中扩增该标记所在序列的引物 为 nLvAlF: TTTGTCTGAAGAGGAACTCGTGAAG 和 nLvAlR: TTGCTCAGGGTTGGACAGGTCA，SNP 位置为 SEQID化vALFl-g中第114个核巧酸，该SNP位置中CC基因型在抗性群体中的基因型频率显著 高于敏感群体(P<〇.05)，提示该标记可W作为一种候选的辅助WSSV抗性品系选育的分子标 记。
[0020] 实施例2
[0021] 在抗病育种中的应用
[0022] 1.选育材料DNA的提取
[0023] 在育种群体中，剪取候选亲邮的一条游泳足，使用天根植物基因组DNA提取试剂盒 (天根，中国）提取每尾亲邮的基因组DNA并标记。将提取获得的DNA使用化no化op 1000检测 DNA浓度和纯度，将经检ilDNA浓度巧OngAU和纯度OD260/28日为1.7-1.9的个体DNA再经1 %的 琼脂糖凝胶电泳检测，选取电泳结果DNA片段完整的个体，待用。
[0024] 2.标记序列的扩增
[0025] 将按照上述方式获得个体采用化vAlF和化vAlR引物进行扩增具体：
[0026] 扩增体系如下：
[0027]
[002引 PCR反应程序为：94°C预变性5min，然后按下列程序94°C30s，55°C30s，72°C30s扩 增35个循环。最后72°C延伸lOmin。
[0029] 3.抗性标记基因分型
[0030] 扩增产物使用引物化vAlF在ABI 3730 xl测序仪上进行测序，获得测序文件后使 用Bioedit软件打开，找到化vALF序列的第114个核巧酸序列，查看该位置的测序峰图，根据 测序峰图将个体分为CC纯和型、CT杂合型和TT纯合型(测序峰图中SEQI化LvALFl-g中第114 个位置仅有T峰，则该个体基因型为TT，若为T和C双峰，则该个体基因型为T/C，若仅有C峰， 则该个体基因型为CC);而后将该位置为CC纯和的个体留种并用该邮建立后代家系。
[0031] 沈QID nLvALFlg:
[0032]
[0033] (a)序列特征
[0034] *长度:298碱基对
[00对 *类型：核酸
[0036] *链型：双链
[0037] *拓扑结构:线性
[0038] (b)分子类型：DNA
[0039] (C)假设：否
[0040] (d)反义:否
[0041 ] (e)最初来源:凡纳滨对邮。
【主权项】
1. 一种凡纳滨对虾nLvALFl基因的抗WSSV候选分子标记的应用，其特征在于:分子标记 在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用;所述分子标记为SEQIDnLvALFlg中第 114个位置nLvALFlg-114-T>C位点，在该位点中CC基因型在抗性群体中的基因型频率显著 高于敏感群体。2. -种辅助抗WSSV品种的选育方法，其特征在于： 1) 提取待分析材料的基因组的DNA; 2) 以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，使用如下引物对nLvAlF: TTTGTCTGAAGAGGAACTCGTGAAG;和 nLvAIR: TTGCTCAGGGTTGGACAGGTCA 进行 PCR 扩增，根据扩增 产物获得SNP位点进行分型，获得分型信息； 3) 将上述获得的分型信息中选择CC基因型型个体进行留种和建立家系育种。
【文档编号】C12Q1/68GK106011252SQ201610401917
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】李富花, 于洋, 刘敬文, 相建海, 张晓军
【申请人】中国科学院海洋研究所