一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记及其应用
【专利摘要】一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记及其应用。凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因(nLvALF6)与抗WSSV显著相关的SNP标记为SEQIDnLvALF6?g中258bp位置的SNP位点(nLvALF6g?258?A>T)。本发明为对虾抗病分子选育提供了有效的标记，为抗病分子标记在遗传育种中的应用提供了重要指导，在对虾抗WSSV品种选育的研究中具有很好的应用前景。
【专利说明】
一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗 WSSV候选分子标记及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及属于水产动物分子遗传学和水产动物种质创新技术领域，涉及一种来 源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)是来自甲壳动物的一种 小型的抗菌肽，最早从鲎（Limulus polyphemus)血细胞中鉴定出来的，具有明显的抗粗糙 型革兰氏阴性菌和抗内毒素效应。功能研究的结果表明甲壳动物ALF具有广谱、强效的抗菌 效应（Beale K M，Towle D W，Jayasundara N，Smith CM，Shields JD，Small HJ，Greenwood SJ.Anti-lipopolysaccharide factors in the American lobster Homarus americanus:Molecular characterization and transcriptional response to Vibrio fluvialis challenge . Comparative Biochemistry and Physiology D_Genomics& Proteomics，2008,3(4):263-269)，且其在抗病毒免疫中的功能不断得到证实。中国明对虾 的7种ALF均在WSSV潜伏感染期转变为急性感染期后出现显著上调表达(Li S H，Zhang X J,Sun Z et al,2013.Transcriptome Analysis on Chinese Shrimp Fenneropenaeus chinensis during WSSV Acute Infection.Plos One,8(3):e58627)。诸多研究都说明对 虾ALF与WSSV侵染过程具有密切关系。
[0003] 凡纳滨对虾是世界三大经济对虾品种之一，也是中国养殖规模最大的品种。近年 来，频发的各种对虾疾病尤其是白斑综合症严重阻碍了对虾养殖业发展，每年因病害造成 的损失大约有十亿美元(相建海.海水养殖生物病害发生与控制.北京:海洋出版社，2001)， 因此培育抗白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的凡纳滨对奸新品种已 迫在眉睫。由于抗性性状在传统选育过程中较难选择，因此开发抗性相关的分子标记，借助 标记进行辅助选择能显著提高选育的效率并降低育种盲目性。
[0004] 目前，对于凡纳滨对虾抗WSSV分子标记的研究还较少，要实现分子辅助抗病品系 的培育缺乏可用的标记，因此本研究分析了凡纳滨对虾一种ALF基因（nLvALF6)中的SNP标 记，并利用关联分析的方法筛选出该基因中与抗WSSV显著相关的分子标记，为分子标记辅 助抗病群体选育提供有效的标记和技术手段。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗 WSSV候选分子标记及其应用。
[0006] 一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因 ULVALF6)的抗WSSV候选分子标记，凡 纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)与抗WSSV显著相关的SNP标记为SEQIDnLvALF6g中 258bp位置的 SNP位点（nLvALF6g-258-A>T)。
[0007] 所述SNP位标记点nLVALF6g-258-A>T抗性优势基因型为A/T杂合。
[0008] 一种用于检测来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候选分子 标记的引物对，nLvA6F: ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGT
[0009] nLvA6R:TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。
[0010] -种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记的应 用，所述凡纳滨对奸抗性相关的多组合分子标记在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育 种中的应用。
[0011] 本发明的优点：
[0012] 本发明以凡纳滨对虾的ALF基因（nLvALF6)中筛选出与抗WSSV性状显著相关的SNP 标记，并应用该标记指导抗WSSV对奸良种的选育，具体包括：
[0013] 1.本发明筛选获得的抗WSSV相关分子标记能够在分子水平上实现抗病个体的筛 选，在个体较小的时候即可进行选择，从而提高选育的效率。
[0014] 2.通过标记辅助选择，可以避免环境因素导致选育的选育误差，提高选育准确率。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下的实施例内容。
[0016] 本发明首先筛选nLvALF6基因中的SNP位点，通过分析这些位点在凡纳滨对虾WSSV 抗性群体和敏感群体中分布的差异，筛选获得nLvALF6基因中抗WSSV相关SNP位点，并使用 该位点在育种材料中进行分型，辅助抗性选育。
[0017] 上述WSSV抗性群体和敏感群体的获得方式是通过投喂WSSV感染致死的病虾进行 攻毒，确保攻毒成功后，收集最先死亡的虾组成敏感群体，收集最后死亡的虾组成抗性群 体。
[0018] 上述nLvALF6基因中SNP位点的获得是通过如下方式：1、通过转录组和基因组信息 获得nLvALF6基因组全长序列；2、在抗性和敏感群体材料中随机各选择8个个体进行DNA提 取并对该序列进行分别测序;3、根据测序结果筛选出nLvALF6基因的SNP位点。
[0019] 上述所述的筛选nLvALF6基因中与抗WSSV性状相关的SNP方式如下：对筛选到ALF 基因中的SNP位点在抗性材料和敏感材料中进行基因分型，统计两组材料中每个SNP位点的 基因频率和基因型频率，通过卡方检验，筛选出两组材料中呈现显著差异的位点441^68-2584>1'(?〈0.05)，这个差异位点可以通过如下引物对扩增?0?产物后通过一代测序实现基 因分型：nLvA6F: ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGT
[0020] nLvA6R:TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。
[0021] 上述所述的分子标记的抗性相关基因型为:A/T杂合基因型。
[0022] 实施例1:
[0023] 对虾抗WSSV相关的SNP标记的获得
[0024] 1. WSSV易感和抗性材料的获得
[0025] WSSV易感和抗性材料来源于"科海一号"多家系的混合群体。选取500尾健康凡纳 滨对虾置于12个50L的水族箱中，实验前随机取10尾对虾检测无 WSSV感染，实验水温为(23 ± 1) °C。经饥饿处理后，投喂WSSV感染致死的病虾(WSSV病毒含量为104-106copy/ng DNA)。 攻毒后每天检查3次(每次间隔6h)并收集死虾，随机取样提取基因组DNA，最早死亡的48尾 对奸作为WSSV易感组（susceptive group，sus)。至攻毒后第14天，凡纳滨对奸存活情况稳 定，取存活的48尾对奸作为胃33￥抗性组(代8丨8丨311丨81'〇即，代8)。
[0026] 2.基因组DNA提取
[0027] 凡纳滨对虾DNA的提取按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒说明进行。分别提 取上述抗性组和易感组的个体DNA，将提取获得的DNA使用NanoDrop 1000检测DNA浓度和纯 度，将经检测DNA浓度>50ngAU和纯度0D26Q/28()为1.7-1.9的个体DNA再经1 %的琼脂糖凝胶 电泳检测，电泳检测DNA片段完整性的个体，即为合格的DNA样品，在-20°C保存待用。。
[0028] 3.nLvALF6基因组序列的获得
[0029] 利用转录组注释信息获得nLvALF6的cDNA序列，之后将该cDNA序列与本课题组获 得的凡纳滨对虾基因组数据进行序列比对，获得nLvALF6基因的基因组DNA序列。
[0030] 4.nLvALF6基因 SNP检测和分型
[0031] 针对nLvALF6的基因组序列，以16尾对虾DNA作为模板，对nLvALF6基因的外显子区 域进行SNP筛查。PCR反应体系如下：
[0034] PCR扩增程序:94°C预变性5min，l个循环；94°C变性20s，54°C退火20s，72°C延伸 3〇8,38个循环;之后72°(：延伸1〇1^11 (^財广增产物经1%琼脂糖电泳检测合格后送至华大基 因公司进行双向测序。通过多序列比对和读测序峰图获得该片段SNP分布。
[0035] 采用直接测序的方法对保守区的11个位点在抗性组和易感组的总计96尾个体中 进行SNP分型，PCR引物、反应体系、扩增程序均同上所述。依据测序图记录每个个体的基因 型。
[0036] 5.nLvALF6基因抗WSSV相关SNP位点的获得
[0037] 通过SPSS 16.0中的非参数检验方法(卡方检验，x2)对易感组和抗性组中各SNP基 因频率、基因型频率及单倍型分布进行差异检验，发现在nLvALF6基因序列SEQID nLvALF6g 中位点nLvALF6g-258-A>T与抗WSSV性状显著相关(Ρ〈0·05)。在nLvALF6g-258-A>T位点基因 型A/T杂合为抗性优势基因型。
[0038] SIQ ID nLvALF6g
[0040] (a)序列特征
[0041 ] *长度：373碱基对
[0042] *类型:核酸
[0043] *链型：双链
[0044] *拓扑结构:线性
[0045] (b)分子类型：DNA
[0046] (c)假设:否
[0047] ⑷反义:否
[0048] (e)最初来源:凡纳滨对虾。
【主权项】
1. 一种来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候选分子标记，其特 征在于：凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)与抗WSSV显著相关的SNP标记为 SEQIDnLvALF6-g中 258bp位置的SNP位点（nLvALF6g-258-A>T)。2. 按权利要求1所述的来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候选 分子标记，其特征在于:所述SNP位标记点nLvALF6g-258-A>T抗性优势基因型为A/T杂合。3. -种用于检测权利要求1所述的来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的 抗WSSV候选分子标记的引物对，其特征在于:nLvA6F: ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGT nLvA6R:TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。4. 一种权利要求1所述的来源于凡纳滨对虾抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候 选分子标记的应用，其特征在于:所述凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记在遗传多样 性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105969870SQ201610402109
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】于洋, 李富花, 刘敬文, 相建海, 张晓军
【申请人】中国科学院海洋研究所