Map7在cn-aml组织样品中表达水平的检测方法及其应用
【专利摘要】MAP7在CN?AML组织样品中表达水平的检测方法及其应用。本发明提供了微管结合蛋白7基因的引物对，其中之一引物对的序列是tcctgggagctgcaattaca(SEQ ID NO：2)和gggtgcttttggtcttctgg(SEQ ID NO：3)或者它们的互补序列。本发明引物对用于通过检测微管结合蛋白7的表达高低而对正常核型急性髓系白血病患者危险度分层或预后评估。本发明还提供了包含所述引物对的基因芯片和试剂盒。
【专利说明】
MAP7在CN-AML组织样品中表达水平的检测方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及正常核型急性髓系白血病基因的检测、危险度分 层和临床预后评估，特别是涉及正常核型急性髓系白血病基因的检测引物、基因芯片和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种异质性极强的恶性血液 病，占成人急性白血病的80%左右（参见MROZEK K，HEEREMA N A，BL00MFIELD C D.， Cytogenetics in acute leukemia[J].Blood reviews,2004，18(2):115_36)，它包括许多 具有不同遗传异常状况和临床特征的实体，预后具有高度的异质性。染色体异位是其中最 常见的诊断和预后标记物，但是在CN-AML中大约一半的患者没有染色体异常，称之为正常 核型急性髓系白血病（cytogenetically normal acute myeloid leukemia，CN_AML)。在 NCCN(National Comprehensive Cancer Network)危险度分层指南中，CN-AML基本上全部 在中危组。但是CN-AML患者是一组内部预后异质性极强的整体，并且缺乏具有判断预后的 特征性染色体，因此，目前临床上CN-AML的分层诊断及个体化治疗非常困难，亟待找到有效 的预后标志物来确认此类患者治疗的强度，以实现精准的个体化治疗，避免一部分预后良 好的患者治疗强度过大，带来众多不必要的并发症，同样也避免另一部分预后不良的患者 治疗强度不足，最终导致白血病复发。
[0003] 现有技术中，CN-AML不具有染色体层面判断其临床预后的遗传标志物，但是有一 部分CN-AML内部存在致病的基因突变，这些基因突变具有对CN-AML患者进行危险度分层和 临床判断预后的价值，例如携带FLT3-ITD(参见WHITMAN S P，MAHARRY K，RADMACHER M D, et al.FLT3 internal tandem duplication associates with adverse outcome and gene-and microRNA-expression signatures in patients 60 years of age or older with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study[J] .Blood,2010,116(18) :3622-6)的CN-AML患者具有不良预后， 而携带NPM1 突变（参见D0HNER K，SCHLENK R F，HABDANK M，et al.Mutant nucleophosmin (NMP1)predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics:interaction with other gene mutation[J] .Blood, 2005,106(12) :3740-6)、CEBPA 双突变（参见 PAST0RE F，KLING D，H0STER E，et al.Long-term follow-up of cytogenetically normal CEBPA-mutated AML[J].Journal of hematology&oncology，2014，7)的患者具有相对良好预后。CN104508143A公开了用于诊 断、预测、治疗和处理急性髓系白血病的方法，该方法涉及预测患有急性髓系白血病患者 的生存率，包括：分析从所述患者分离的遗传样品是否存在细胞遗传学异常，以及在基因 FLT3、NPMI、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WTI、IDHI、IDH2、ΚΙT、RUNXI、MLL-PTD、ASXLI、PHF6、 KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2中的至少一者中是否存在突变。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种敏感性高，通用性好，特异性强的标志物，来检测CN-AML 细胞或组织样品，来帮助判断CN-AML患者的危险度分层或临床预后，是基于以下的考虑： (1)基因突变不能覆盖所有的CN-AML，而基因表达可以覆盖所有的CN-AML患者；（2) CN-AML 发生、发展的分子机理目前仍不清楚，寻求新的临床预后标志物有助于理解CN-AML的发病 机理，并且能为CN-AML的精准靶向治疗奠定基础。
[0005]本发明人发现MAP7(microtubule associated proteins7,微管结合蛋白7)高表 达可提示正常核型急性髓系白血病细胞的存在，并且可提示正常核型急性髓系白血病患者 较高的危险度分层和较差临床预后。因此，本发明提供MAP7作为CN-AML标志物，其敏感性 高，通用性好，特异性强，能用来帮助判断CN-AML患者的危险度分层或临床预后。
[0006] 一方面，本发明提供一种检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高 低的方法，特征在于，使用微管结合蛋白7基因的引物对或者探针。所述检测包括体外检测， 包括非诊断目的检测。基于与正常对照细胞相比差异表达的MAP7的正常核型急性髓系白血 病癌症特异性特征(signature)的鉴定及其应用，设计MAP7基因引物对或探针，来检测正常 核型急性髓系白血病细胞或组织中MAP7的表达高低，通过检测MAP7的表达高低来对CN-AML 患者进行危险度分层并分析临床预后。MAP7高表达的CN-AML样品具有较高的危险度分层和 较差的临床预后。MAP7低表达的CN-AML样品具有较低的危险度分层和较好的临床预后。
[0007] 第二方面，本发明提供一种检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管 结合蛋白7表达高低的试剂盒，特征在于，其中包含微管结合蛋白7基因的引物对或者探针。
[0008] 第三方面，本发明提供一种检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管 结合蛋白7表达高低的基因芯片，特征在于，其中包括固相载体和微管结合蛋白7基因的引 物对或者探针。
[0009] 进一步地，本发明提供了微管结合蛋白7基因的引物对或者探针在制备通过检测 微管结合蛋白7的表达高低而对正常核型急性髓系白血病进行危险度分层或预后评估的基 因芯片或试剂盒中的用途。
[0010] 更进一步地，由于本发明人发现正常核型急性髓系白血病与MAP7差异表达相关， 因此本发明提供了 MAP7基因在设计或制备用于正常核型急性髓系白血病检测、危险度分 层或预后评估的试剂或试剂盒中的用途。
[0011] 本发明还提供了 MAP7在筛选或制备用于治疗正常核型急性髓系白血病的药物中 的用途。
[0012] 在CN-AML细胞或正常细胞中MAP7差异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果 的差异表达允许以许多方法使用该信息。例如，可评估特定的治疗方案(例如，确定化疗药 物是否改善特定患者的长期预后）。此外，MAP7基因表达谱(或个体基因）允许筛选抑制CN-AML表达谱或将不良预后谱转变成更好的预后谱的药物候选物。
[0013] 本发明也提供了测定CN-AML受试者的预后的方法，其包括，测量来自受试者的受 试样品中MAP7基因产物的水平(其与CN-AML的特定预后例如好的或积极的预后、差的或不 利的预后相关）。根据这些方法，与对照样品中相应的MAP7基因产物的水平相比，受试样品 中与特定预后相关的MAP7基因产物水平的改变，指示受试者患有具有特定预后的CN-AML。 MAP7基因产物表达高与不利（即，差)预后相关。不利预后的实例包括、但不限于，低存活率 和疾病快速进展。
[0014] 在本发明的一个具体实施方案中，提供一种检测正常核型急性髓系白血病细胞或 组织中MAP7表达高低的方法，特征在于，使用微管结合蛋白7基因的引物对，所述引物对的 序列是下面的序列或者它们的互补序列：
[0015] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0016] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0017] 在本发明的另一个具体实施方案中，提供一种检测正常核型急性髓系白血病细胞 或组织中MAP7表达高低的方法，特征在于，使用微管结合蛋白7基因的引物对，所述引物对 的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
[0018] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0019] RIGHT PRBffiR agctagctgtttctcccgtt SEQ ID N0:6。
[0020] 在本发明的又一个具体实施方案中，提供一种检测正常核型急性髓系白血病细胞 或组织中MAP7表达高低的方法，特征在于，使用微管结合蛋白7基因的引物对，所述引物对 的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
[0021] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0022] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO：9
[0023] 在本发明提供的一种检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高低 的试剂盒的一个具体实施方案中，所述试剂盒包含微管结合蛋白7基因的引物对，所述引物 对的序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
[0024] 第一组引物对：
[0025] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0026] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0027] 第二组引物对：
[0028] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0029] RIGHT PRBffiR agctagctgtttctcccgtt SEQ ID N0:6。
[0030] 第三组引物对：
[0031] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0032] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。
[0033] 在本发明提供的一种检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高低 的基因芯片的一个具体实施方案中，所述基因芯片包括固相载体和微管结合蛋白7基因的 引物对，所述引物对的序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
[0034] 第一组引物对：
[0035] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0036] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0037] 第二组引物对：
[0038] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0039] RIGHT PRBffiR agctagctgtttctcccgtt SEQ ID N0:6。
[0040] 第三组引物对：
[0041] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0042] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。
[0043] 因此，优选地，本发明也提供了一组引物对，特征在于，其序列是下面任一组的序 列或者它们的互补序列：
[0044] 第一组引物对：
[0045] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0046] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3
[0047] 第二组引物对：
[0048] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0049] RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6
[0050] 或者
[0051 ] 第三组引物对：
[0052] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0053] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。
[0054] 在本发明更优选的技术方案中，提供了一组引物对，所述引物对是SEQ ID N0:2和 SEQ ID NO :3的序列或者它们的互补序列：
[0055] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0056] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0057]
[0058] 优选地，本发明提供了一种基因芯片，特征在于，其包括固相载体和上述引物对 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补序列。本发明也提供了一种试剂盒，其 包含上述引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补序列。本发明上述引物 对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒用于检测 细胞或组织中MAP7表达高低。在本发明的一个优选具体实施方案中，上述引物对、基因芯 片、试剂盒用于检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高低。在本发明的一 个优选的具体实施方案中，上述引物对、基因芯片、试剂盒用于非诊断目的检测正常核型急 性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高低。
[0059]优选地，本发明提供了一种检测细胞或组织样品中MAP7表达高低的方法，特征在 于，使用本发明的上述引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补序列、其 基因芯片或试剂盒。在本发明的一个更优选具体实施方案中，本发明提供了一种检测正常 核型急性髓系白血病细胞或组织样品中MAP7表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上 述引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。 在本发明的一个优选具体实施方案中，本发明提供了一种非诊断目的的检测正常核型急性 髓系白血病细胞或组织样品中MAP7表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。所述检测 MAP7表达高低是对离体细胞或组织样品的检测。
[0060] 优选地，本发明提供了引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补 序列在制备通过检测MAP7的表达高低而对正常核型急性髓系白血病患者进行危险度分层 或临床预后评估的基因芯片中的用途；以及引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者 它们的互补序列在制备通过检测MAP7的表达高低而对正常核型急性髓系白血病患者进行 危险度分层或临床预后评估的试剂盒中的用途。
[0061] 更优选地，本发明提供了用于检测细胞或组织样品中MAP7的表达高低的一组引物 对，其序列是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它们的互补序列：
[0062] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0063] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0064] 在一个具体实施方案中，所述MAP7的序列是SEQ ID NO: UPCR扩增产物大小是 216,产物序列是SEQ ID N0:4。优选地，所述细胞或组织样品是CN-AML细胞或组织样品，所 述检测是非诊断目的的检测。所述检测是对离体细胞或组织进行的。
[0065] 更优选地，本发明还提供了一种用于检测MAP7的表达高低的基因芯片，特征在于， 其包括固相载体和上述引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它们的互补序列。本发明也 提供了一种用于检测MAP7的表达高低的试剂盒，其包含上述引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它们的互补序列。在本发明的一个优选具体实施方案中，上述引物对SEQ ID N0:2 和SEQ ID N0:3或者它们的互补序列、基因芯片、试剂盒用于检测正常核型急性髓系白血病 细胞或组织中MAP7表达高低。在本发明的一个优选的具体实施方案中，上述引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它们的互补序列、基因芯片、试剂盒用于非诊断目的检测正常核型 急性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高低。
[0066] 更优选地，本发明还提供了一种非诊断目的的检测细胞或组织样品中MAP7表达高 低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它 们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。更优选地，其中所述细胞或组织样品是正常核型急性 髓系白血病细胞或组织样品。所述检测MAP7表达高低是非诊断目的的，是对离体组织样品 的检测。在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于通过检测MAP7的表达高低而对正常 核型急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的一组引物对，其序列是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3或者它们的互补序列：
[0067] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0068] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3
[0069] PCR扩增产物大小是216,扩增产物序列是SEQ ID N0:4。
[0070] 在本发明一个具体实施方案中，提供了用于通过检测MAP7的表达高低而对正常核 型急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的基因芯片，其包括固相载体和引 物，所述引物是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它们的互补序列。本发明还提供了 序列是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它们的互补序列的引物在制备通过检测MAP7的表 达高低而对正常核型急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的基因芯片中 的用途。
[0071] 在本发明一个具体实施方案中，提供了用于通过检测MAP7的表达高低而对正常核 型急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的试剂盒，其包含序列是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的引物或者它们的互补序列。本发明还提供了序列是SEQ ID N0:2和 SEQ ID NO: 3或者它们的互补序列的引物在制备通过检测MAP7的表达高低而对正常核型 急性髓系白血病患者进行危险度分层或预后的试剂盒中的用途。
[0072] 在上面的具体实施方案中，使用的引物对可以用SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6代 替，PCR扩增产物大小是194,扩增产物序列是SEQ ID N0:7。使用的引物对还可以是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，PCR扩增产物大小是224,扩增产物序列是SEQ ID NO:10 JEQ ID NO:1 是所述MAP7的序列，4536bp。
[0073]进一步地，本发明提供了 MAP7在筛选或制备用于治疗急性髓系白血病的药物中的 用途。
[0074]进一步地，本发明还提供了 MAP7基因在设计或制备用于正常核型急性髓系白血病 检测、危险度分层或预后评估的试剂或试剂盒中的用途。
[0075]本发明MAP7的引物对序列或者它们的互补序列、包含载体和MAP7引物对的基因芯 片、包含MAP7引物对的试剂盒、检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高低 的方法，可以用于临床或非临床检测MAP7表达水平，可以用于诊断或非诊断目的。可以利用 本发明提供的检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织中MAP7表达高低的方法、MAP7基因 引物对、基因芯片、试剂盒，通过对CN-AML患者的细胞或组织样品检测MAP7的表达高低来对 CN-AML患者进行危险度分层并分析临床预后。MAP7高表达的CN-AML患者具有较高的危险度 分层和较差的临床预后。MAP7低表达的CN-AML患者具有较低的危险度分层和较好的临床预 后。本发明所述MAP7基因引物、基因芯片、试剂盒还可以用于非临床或非诊断目的，包括但 不限于实验室研究，细胞培养或组织培养中MAP7的检测，血液制品检测、标准控制等等。 [0076]本发明MAP7基因的引物对或者探针可以通过本领域技术人员公知的方法进行设 计，通过本领域公知的生物或化学合成技术来制备本发明的引物对或探针。可使用多种本 领域技术人员熟知的技术测量基因产物的表达水平。例如使用RNA印迹分析，Northern Blot，Southern Blot，Western Blot，或者荧光定量PCR检测，检测受试样品中基因产物的 水平低于对照样品中相应的基因产物的水平，或者受试样品中基因产物的水平高于对照样 品中相应的基因产物的水平。
[0077]附图简要描述
[0078]图1所示是MAP7在CN-AML患者和正常人样本中的表达及与其它预后标志物之间的 比较图。
[0079] 图1A所示是CN-AML患者骨髓标本VS正常人骨髓标本MAP7表达增高显示图。
[0080] 图1B所示是CN-AML患者外周血标本VS正常人外周血标本MAP7表达增高显示图。
[0081 ] 图1C所示是MAP7在FLT-ITD、NPM1突变、CEBPA突变患者中表达高低的比较结果图。 MAP7的表达与FLT3-ITD成正相关，与双突变CEBPA成负相关。
[0082]图1D所示是其它预后标志物中MAP7表达高低情况的结果图。其它预后不良标志物 更容易在MAP7高表达中出现，预后良好标志物更容易在MAP7低表达中出现。
[0083]图2所示是MAP7在CN-AML患者样品中的检测及预后生存分析显示图。
[0084]图2A所示是对全部CN-AML骨髓样品进行MAP7表达水平检测与总生存率(0S)分析 结果显示图。MAP7是CN-AML及CN-AML患者的不良预后标志物。MAP7high具有较短的0S(p = 0.0441)。图2B所示是对全部CN-AML骨髓样品进行MAP7表达水平检测与无事件生存率(EFS) 分析结果显示图。MAP7是CN-AML及CN-AML患者的不良预后标志物。MAP7high具有较短的EFS (p = 0.0114) 〇
[0085]图2C所示是对CN-AML欧洲白血病协作组危险度分层中（ELN)低危患者进行0S预后 分析的结果显示图（P = 〇. 8856)。
[0086]图2D所示是对ELN分类中低危CN-AML患者进行EFS预后分析的结果显示图（p = 0.9389)。
[0087] 图2E所示是对ELN分类中中危-1患者进行预后分析的结果显示图，MAP7hlgh具有较 短的 0S(p = 0.0344)。
[0088] 图2F所示是对ELN分类中中危-1患者进行预后分析的结果显示图，MAP7hlgh具有较 短的 EFS(p = 0.0052)。
【具体实施方式】
[0089] MAP7引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以实时荧光定量PCR检测 MAP7表达高低。实时荧光定量PCR常用的荧光染料有Taqman探针、SYBR Green I等。SYBR Green I是一种荧光染料，可以和任意的双链DNA结合，通过荧光信号的收集，反映模板拷贝 数的多少。本发明主要采用SYBR Green I进行实时荧光定量PCR检测。
[0090] 实施例1总RNA的提取
[0091] 实验操作中，与RNA提取及检测有关的微量移液器、Tip枪尖、EP管等均需经过无 RNase处理。
[0092] 1、裂解细胞：向收集的细胞沉淀中加入lml的QIAZ0L试剂，振荡器震荡混匀，室温 作用15分钟以上使其充分裂解。若加入QIAZ0L试剂后不能立刻提取RNA，可将其放入-20°C 保存，短期内可用。
[0093] 2、按照氯仿:QIAZ0L体积比为1:4的比例，加入约300μ1氯仿，上下颠倒混匀1分钟， 室温静置5-10分钟，低温离心:4°C，12600rpm离心10分钟。
[0094] 3、离心完毕后，EP管内液体分三层，上层为含有RNA的上清液，中下层为DNA和蛋白 质。然后，将上清液转移至新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，低温静置10 分钟，离心:4°C，12600rpm离心15分钟。
[0095] 4、弃上清，白色沉淀即为RNA，加入lml的75 %乙醇(DEPC水配制），轻轻颠倒混匀， 常温离心:8000rpm离心5分钟。
[0096] 5、溶解RNA:去上清，并将EP管倒扣于吸水纸上，吸干管口。再于离心机上空甩几 秒，用加样枪将剩余的酒精全部吸出，风干3 - 5分钟。加入一定体积的无核酸酶的水溶解 RNA〇
[0097] 6、紫外分光光度计检测RNA浓度。提取得到的RNA放-20 °C保存，一个月内可用；置 于-80°C则可保存相对较长时间。
[0098] 实施例2RNA反转录
[0099] 1、按照表1配制反转录体系，总反应体积为25μ1(总RNA量为lyg)。以下操作均在冰 上进行：
[0100]表1反转录体系的配制
[0102] 2、将以上各反应组分配制到0.2ml的PCR反应管中后，放入PCR仪中进行逆转录反 应，程序为37°C，2h; 4°C，forever。反应结束后得到的产物即为cDNA，将反应产物取出后放 于-20 °C保存待用。
[0103] 实施例3实时荧光定量PCR检测
[0104] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0105] 2、反应管中先配制2倍体积的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXΠ 混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因 SEQ ID N0:l的引物对SEQIDN0:2和3或内参GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的引物，轻轻混勾。
[0106] 3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95°C，1分钟;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40个循环。然后95°C，1分钟;60°C，1分钟，95°C，30s。荧光收集点在60 。(：，反应结束后取出PCR产物SEQ ID N0:4。
[0107] 4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
[0108] 表2 real time PCR mix的配制
[0110] 实施例4实时荧光定量PCR检测
[0111] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0112] 2、反应管中先配制2倍体积的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXΠ 混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因 SEQ ID NO: 1的引物对SEQ ID NO: 5和6或内参GAPDH的引物，轻轻混匀。
[0113] 3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95°C，1分钟;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40个循环。然后95°C，1分钟;60°C，1分钟，95°C，30s。荧光收集点在60 。(：，反应结束后取出PCR产物SEQ ID N0:7。
[0114] 4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
[0115]表2 real time PCR mix的配制
[0117] 实施例5实时荧光定量PCR检测
[0118] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0119] 2、反应管中先配制2倍体积的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXΠ 混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因 SEQ ID NO: 1的引物对SEQ ID NO: 8和9或内参GAPDH的引物，轻轻混匀。
[0120] 3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95°C，1分钟;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40个循环。然后95°C，1分钟;60°C，1分钟，95°C，30s。荧光收集点在60 。(：，反应结束后取出PCR产物SEQ ID N0:10。
[0121] 4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
[0122] 表2 real time PCR mix的配制
[0124] 实施例6 MAP7在CN-AML患者和正常人骨髓或外周血中的表达检测和比较分析及 与其它CN-AML预后标志物之间的比较
[0125] 对原始细胞在70-97 %的CN-AML患者骨髓样品116例和正常人骨髓样品5例，通过 基因芯片高通量基因表达水平检测得到，根据实施例1 一2的试验条件，进行MAP7表达检测， 得到图 1A，表明GSE1159(GSE是http://www.ncbi .nlm.nih. gov/geo中样本检测号）中 116例 CN-AML患者骨髓标本（原始细胞在70-97%)VS 5例正常人骨髓样品MAP7表达增高（p = 0.04)(图1A)。以原始细胞在70-97%的CN-AML患者外周血样品7例，正常人外周血样品10例 进行MAP7表达检测，得到图1B，表明GSE9476中7例CN-AML患者外周血样品（原始细胞在70-97%)VS 10例正常人外周血样品MAP7表达增高(p = 0.008)(图1B)。
[0126] 实施例7 MAP7在CN-AML患者组织样品中的表达检测及与其它CN-AML预后标志物 之间的比较
[0127]通过基因芯片高通量基因表达水平检测方法，根据实施例1 一 2的试验条件，对CN-AML患者组织样品中MAP7和其它预后标志物的表达水平进行了检测和比较，结果发现，MAP7 的表达与FLT3-ITD成正相关，与双突变CEBPA成负相关（图1C)，其它预后不良标志物更容易 在MAP7高表达中出现，预后良好标志物更容易在MAP7低表达中出现，（图1D)。
[0128] 实施例8 MAP7的表达水平检测及与CN-AML其它指标的单因素和多因素分析
[0129] 通过基因芯片高通量基因表达水平检测，根据实施例1 一 2的试验条件，对GSE6891 中129例初治的CN-AML患者(年龄小于60岁）的外周血样品中MAP7的表达水平和CN-AML其它 指标进行单因素和多因素分析。
[0130] 单因素检测和分析结果证实：在MAP7high组，1)携带FLT3-ITD的比例更高（p = 0.005) ;2)携带双突变CEBPA的比例更低（p = 0.005) ;3)具有较高的ERG、WT1、DNMT3B、 DNMT3A、MAPKBP1、ITPR2、ATP1B1(P = 0.0004、P〈0.0001、P〈0.0001、P = 0.03、P = 0.01、P = 0·005、Ρ〈0·001)(表3)。
[0131] 多因素分析中同样证实：与其它预后不良因素比较，在CN-AML中，MAP7hlgh均具有 较短的0S和EFS (表4)。
[0132] 表3 :MAP7的表达水平与CN-AML其它指标的单因素分析
[0133]
[0135] 说明：FAB，French-American-B;ritish classification(法、美、英分型系统）； ITD,internal tandem duplication(内部串耳关重复）；TKD,tyrosine kinase domain(酪氨 酸激酶结构域）。高ERG,BAALC,LEF1 ,WT1，DNMT3B，DMMT3A，MAPKP1, ITPR2和ATP1B1 表达分别 定义为高于所有样品平均值的表达水平。
[0136] 表4:MAP7的表达水平与CN-AML其它指标的多因素分析
[0137]
[0138] HR,hazards ratio(风险比）；CI，confidence interval(置信区间）〇
[0139] 实施例9 MAP7是CN-AML患者的不良预后标志物
[0140]通过基因芯片高通量基因表达水平检测方法，根据实施例1 一 2的试验条件，对CN-AML (129例，年龄小于60岁）患者的骨髓样品进行MAP7表达水平检测，并且进行预后分析。 MAP7high具有较短的0S(p = 0 · 0441)和EFS(p = 0 · 0114)(图2A、B)。因为在ELN指南分类标准 中，CN-AML几乎全部分布在中危-I，对ELN中危-I患者进行了预后分析，在这一组患者样品 中，MAP7 higt^样具有较短的0S(p = 0.0344)和EFS(p = 0.0052)(图2C、D)。
[0141] 结论:1)MAP7是CN-AML患者预后不良标志物;2)MAP7在ELN指南中危-I中均是预后 不良标志物，因此MAP7可以作为CN-AML危险度分层和预后标志物进一步细化这类患者。 MAP7高表达的CN-AML患者具有较高的危险度分层和较差的临床预后，MAP7低表达的CN-AML 患者具有较低的危险度分层和较好的临床预后。
[0142] 上述实施例只是为了详细说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的保护范 围。
[0143] 序列表
[0144] SEQ ID N0:1:MAP7的mRNA序列，4536bp:
[0151] SEQ ID N0:4:MAP7的PCR扩增产物序列：
[0153] SEQ ID N0:5:MAP7引物：
[0154] ccagaagaccaaaagcaccc
[0155] SEQ ID N0:6:MAP7引物：
[0156] agctagctgtttctcccgtt
[0157] SEQ ID NO :7 :MAP7的PCR扩增产物序列：
[0159] SEQ ID N0:8:MAP7引物：
[0160] catcttgcagccccatcatc
[0161] SEQ ID N0:9:MAP7引物：
[0162] agctggttgtcttgctttgg
[0163] SEQ ID NO :10 :MAP7的PCR扩增产物序列：
【主权项】
1. 一种用于检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管结合蛋白7表达高低 的试剂盒，特征在于，其中包含微管结合蛋白7基因的引物对或者探针。2. -种用于检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管结合蛋白7表达高低 的基因芯片，特征在于，其中包括固相载体和微管结合蛋白7基因的引物对或者探针。3. -种检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管结合蛋白7表达高低的方 法，特征在于，使用微管结合蛋白7基因的引物对或者探针。4. 根据权利要求1的检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管结合蛋白7 表达高低的试剂盒，特征在于，其中所述微管结合蛋白7基因的引物对是下面任一组的序列 或者它们的互补序列： 第一组引物对： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二组引物对： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三组引物对： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。5. 根据权利要求2的检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管结合蛋白7 表达高低的基因芯片，特征在于，其中所述微管结合蛋白7基因的引物对是下面任一组的序 列或者它们的互补序列： 第一组引物对： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二组引物对： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三组引物对： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。6. 根据权利要求3的检测正常核型急性髓系白血病细胞或组织样品中微管结合蛋白7 表达高低的方法，特征在于，其中所述微管结合蛋白7基因的引物对是下面任一组的序列或 者它们的互补序列： 第一组引物对： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二组引物对： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三组引物对： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。7. -组引物对，特征在于，其序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列： 第一组引物对： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二组引物对： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三组引物对： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。8. 微管结合蛋白7基因的引物对或者探针在制备通过检测微管结合蛋白7的表达高低 而对正常核型急性髓系白血病进行危险度分层或预后评估的基因芯片或试剂盒中的用途。9. 微管结合蛋白7基因在设计或制备用于正常核型急性髓系白血病检测、危险度分层 或预后评估的试剂、试剂盒或基因芯片中的用途。10. 微管结合蛋白7基因在筛选或制备用于治疗正常核型急性髓系白血病的药物中的 用途。
【文档编号】C12Q1/68GK105969868SQ201610344737
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】石金龙, 付林, 付华平, 徐克曼, 王晶, 克晓燕
【申请人】北京大学第三医院