用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的mar转录调控元件及其表达系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种哺乳动物细胞系统，具体说，是一种用于真核细胞系的提高蛋白 表达水平的MR转录调控元件及其表达系统。
【背景技术】
[0002] 医用蛋白质药物具有较强的生理活性，显著的疗效及较高的安全性等优点，在目 前的医药市场上占有重要的比例，截止2014年，在全球范围内约占有1，000亿美元（约 合6, 200亿人民币）的市场份额。抗体作为机体免疫应答的效应分子，能够特异性识别、 中和或清除诱发疾病的抗原，是理想的祀向治疗药物。目前欧美市场已有总计Ξ十余种治 疗性抗体上市销售。W上抗体药物已经在免疫性疾病、癌症等治疗领域取得巨大成功。W 罗氏公司的抗肥R2的Trastuzum油抗体为例，美国食品及药物管理局师A)于1998年批 准其作为治疗恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺 癌的抗体药物。并且已成为国际通行的针对肥R2阳性乳腺癌临床治疗的金标准（Golden standard)。据估计，到2023年肥R2阳性乳腺癌的市场份额将高达126亿美元（约合780 亿人民币）。目前在国际上销量最高由欧美主要生产厂家垄断的几种医用抗体的专利在未 来几年内将陆续到期，从而为中国及其他发展中国家在运方面的发展提供了难得的发展机 遇。WTrastuzum油为例，它的欧洲专利保护期已于2014年到期，其美国专利于2019年到 期。因此在可W预见的未来10年，医用抗体制药业将呈现飞速发展且竞争更加激烈的局 面。
[0003] 中国医用蛋白质药物的表达与纯化业由于起步晚，其行业发展受限于诸多技术瓶 颈，如：工程细胞系构建与筛选、大规模培养工艺开发，单抗的纯化与质控等，因此普遍存在 着细胞系表达水平低，培养规模小和纯化能力不够等技术问题。所W，上述产业化关键技术 的突破可加快中国抗体产业的发展进程。数据表明，一个年销售额达1亿美元左右的蛋白 质药物，通常需要年产约100公斤重组蛋白的产能作为产品支撑。因此，蛋白质药物的表达 与纯化，其技术水平和产能规模，将直接影响蛋白质药物的成本和盈利。
[0004] 在当前国际通用的各种医用蛋白表达系统有很多种，如大肠杆菌为代表的原核 表达系统，W及W酵母、植物、昆虫细胞为代表的真核细胞表达系统等。而运些表达系统 生产出的蛋白质，无论是在理化性质，还是在功能上都与天然蛋白质存在较大的差异，因 此利用哺乳动物细胞表达系统来生产医用蛋白质是现代医药领域的研究重点。目前市场 上被美国抑A批准的蛋白质药物，超过50%来自于哺乳动物细胞的表达系统，主要包括中 华仓鼠细胞Chinese hamster ovary cell(CH0)，人胚肾细胞human embiTonicki化ey cell(肥K-293)等表达细胞系。
[0005]高效的表达载体系统是医用蛋白质药物的关键。构建高效的表达载体细胞是提 高哺乳动物细胞医用蛋白质产量的首要策略，也是目前制约医用蛋白质产业化的瓶颈。外 源基因可W通过质粒载体转染的方式导入哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。一般来讲， 适用于哺乳动物细胞蛋白表达的载体，大多为穿梭载体，不仅含有便于载体扩增和大量制 备的原核序列，如复制子和抗生素基因等，还含有真核生物表达序列如调控外源基因转录 与翻译活性的启动子、增强子、终止子及polyA信号等。由于蛋白质药物的表达通常采用 稳定表达的细胞系，因此，为获得蛋白的高效表达，不仅需要表达载体的优化，同时还需要 提供适于载体表达的染色体环境，即所谓的"位置效应"。表达载体的优化，一般包括选用 较强的启动子，表达基因进行密码子优化等；同时为增加表达载体在细胞内的拷贝数，在 表达载体中加入一些筛选基因如基于氨甲噪岭（methotrexate,Ml%)的二氨叶酸还原酶 (dihy化ofolatere化ctase,DHFR)。"位置效应"是优化表达载体时应当着重考虑的。当质 粒携带表达基因转入宿主细胞时，质粒将被随机整合到宿主染色体基因组上的某个区域， 此整合区域的空间构象，显著影响基因的转录和表达。近年来，一些DNA顺式调控元件，如 核基质附着区（MatrixAttachmentRegion,MAR)被鉴定出来。功能上，当运些DNA元件与 外源基因处于同一顺反子时，能够保持外源基因的高表达而对插入位点所处的染色质结构 没有影响。已发现的DNA元件包括基因座控制区化CR)、支架/基质附着区（S/MAR)、绝缘 子、染色质开放元件扣C0巧和抗阻遏物（STAR元件）等巧ef2)。运些DNA顺式调控元件 构建到表达载体上，可显著提高基因的表达水平和蛋白的翻译水平。
[0006] 筛选高效稳定表达的细胞克隆是提高哺乳动物细胞蛋白质产量的另一重要策略。 传统质粒载体需要转染宿主细胞获得稳定表达，耗时且费力，不利于医用蛋白质的大规模 生产。虽然杆状病毒载体和慢病毒载体可W较高的拷贝数整合到宿主的基因组，但病毒载 体的制备具有一定的难度，特别是大规模的制备；而且，慢病毒载体亦有安全性的潜在风 险。另一方面，增加表达基因在宿主细胞内的拷贝数，是筛选高效表达细胞株的有效方法。 当前常用的筛选高效稳定表达克隆的体系有两类：一类是基于氨甲噪岭的二氨叶酸还原酶 筛选体系；另一类是基于甲硫氨酸亚讽的谷氨酷胺合成酶筛选体系。细胞培养在含有一定 浓度的氨甲噪岭或甲硫氨酸亚讽的培养基中，外界环境的压力使得表达基因在宿主细胞内 扩增，拷贝数增加，进而提供蛋白质药物的表达产量。但是上述两种筛选体系都存在耗时长 和成本高等缺点，不利于生物制药的产业化。因此，采用一种非病毒载体，同时运种载体能 够W较高的拷贝数并稳定整合到宿主细胞的基因组内，将极大地提高蛋白质药物的产量， 而且可大大缩短筛选细胞克隆所需的时间。
[0007] 用睡美人转座子（Sle巧ingBeauty,SB)作为表达载体具有质粒无可比拟的优点。 转座子是染色体上可自主复制和移位的DNA作用元件。睡美人转座子是第一个应用于高等 哺乳动物细胞相关研究的转座子。SB转座子由两部分组成：转座酶基因和能被转座酶基因 所识别的两端反向重复序列。SB转座子采用"剪切-粘贴"的作用机制进行转座。转座酶 特异识别转座子两端反向重复序列，从转座子载体上切下位于两端反向重复序列的DNA元 件，并插入到新的整合位点上。因此，SB转座子做为非病毒的基因载体，具有较高的生物安 全性；同时结构简单，容易操作；对位于两端反向重复序列之间的DNA片段，没有插入片段 的长度限制。重要的是，通过SB转座子，可W使DNA片段稳定地整合到基因组内，从而实现 基因的稳定表达。因此，利用睡美人转座子作为医用蛋白质药物的表达载体，有文献报道， 可数倍提高蛋白质药物的产量，而且由于SB转座子载体W较高的基因拷贝数稳定整合，大 大缩短了筛选高效稳定表达克隆的时间和过程。并且，由于稳定地整合到宿主细胞基因组 内，因此在大规模细胞培养生产蛋白质药物的过程中，不会出现质粒载体中的基因丢失等 缺点，使得单位体积的细胞培养基最大可能地生产出表达蛋白质，从而最大限度地利用培 养基，最终降低了生产成本，同时提高了产量。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的 MR转录调控元件及表达系统，发现并鉴定了新型的DNA调控元件；W此调控元件为基础， 结合基因转座子技术，优化和构建了真核表达载体。随后通过转染及筛选，所获得的细胞 株，可高效，稳定地表达医用蛋白质药物。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于真核细胞系的提高 蛋白表达水平的MR转录调控元件，所述MR转录调控元件为具有增强转录的功能的DNA 顺式作用元件，嫩3转录调控元件为嫩1?1，嫩1?2，嫩1?3.嫩1?4，嫩1?5中的任意一种，嫩1?1的核 巧酸序列为SEQIDNO. 1，MR2的核巧酸序列为SEQIDNO. 2，MR3的核巧酸序列为SEQID NO. 3,MAR4的核巧酸序列为沈QIDNO. 4和MAR5的核巧酸序列为沈QIDNO. 5。
[0010] 所述MR转录调控元件提取于中国仓鼠卵巢细胞系CHO。
[0011] 含有所述MR转录调控元件的高效稳定的医用重组抗体的哺乳动物细胞表达载 体，包括：1)使得基因高效表达的DNA顺式作用元件MAR，2)睡美人转座子载体表达抗体基 因，其核巧酸序列如SEQIDNO. 6所示；3)筛选标记基因，其核巧酸序列如SEQIDNO. 7所 示；4)IRES序列沈QIDNO. 8。
[0012] 所述睡美人转座子载体，含有可被转座酶识别的反向重复序列，其核巧酸序列如 沈QIDNO. 9所示。
[001引所述筛选基因为二氨叶酸还原酶基因DHFR，所述IRES元件为基因合成的FMDVIRES序列。
[0014] 所述MR转录调控元件为MR2。
[0015] 一种高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法，利用上述的哺乳动物细胞 表达载体，将目标基因转染到哺乳动物宿主细胞，筛选获得高表达目标基因的稳定细胞株。
[0016] 所述哺乳动物宿主细胞是中华仓鼠卵巢细胞C册和人胚肾上皮细胞肥K293。
[0017] 所述筛选方法包括针对筛选标记的抗生素筛选和针对扩增标记基因的药物加压 筛选。
[0018] 所述的高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法获得的高效稳定表达的 细胞株。
[0019] 本发明的有益效果是：首次利用C册细胞克隆出具有转录调节功能的DNA调控元 件（MAR)，通过一系列载体构建及稳定细胞株筛选，证明了此DNA调控元件可提高蛋白质的 表达产量。W此为基础，还首次将此MAR调控元件与睡美人转座子载体结合，从而构建了一 种适用于高效稳定表达医用蛋白质药物的表达系统。并W表达纯化抗肥R2的IgG为例，证 明了与传统的质粒表达系统相比，该系统具有如下优点：较高的蛋白质产量（与质粒系统 相比，高达10倍的产量）；稳定持久地蛋白表达（细胞系传50代后，仍保持相近的蛋白表 达产量）；大大缩短筛选克隆的时间（一个月左右）；快速便捷的基因克隆。
【附图说明】
[0020] 图1是中华仓鼠卵巢上皮细胞培养的生长曲线。
[0021] 图2是用抗H4的抗体进行染色体免疫沉淀，经一系列处理，所得的DNA样品进行 1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0022] 图3是微阵列分析试验中，从染色体免疫共沉淀所得的DNA样品中扩增β-actin 用于PCR扩增的阳性对照。
[002引 图4是表达EGFP的真核表达载体的图谱（比较祀GFP-Control(A)和 祀GFP-