专利名称：c-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的干细胞研究,具体涉及AP-I家族蛋白C-Jun N端缺失诱导多能性干细胞的方法及其应用。
背景技术：
AP-I家族是一类细胞响应外界信号包括生长因子、细胞因子和胞外压力的转录激活蛋白。结构上由不同的亚基组成同源或异源二聚体。这些亚基包括Jun、Fos和ATF。每个亚基上均有一个亮氨酸拉链结构，两两形成与DNA结合的锌指模块。ES细胞及胚胎干细胞是一中在囊胚的内细胞团中分离出的具有体外无限增殖、自我更新和多向分化的特性的细胞。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。鉴于ES细胞的体外无限增殖和多分化潜能，其在再生医学领域具 有广阔的应用前景。2006年，日本科学家Yamanaka及其同事用四个转录因子(0ct4, KLF4, Sox2,c-Myc)成功的将小鼠的成纤维细胞重编程为胚胎干细胞，这一技术被称为诱导多能性干细胞(iPS)技术。其后，人及其他物种如大鼠，猴，猪的成纤维细胞也被成功的重编程，这项技术被认为是再生医学中最为重要的突破。近年来，iPS技术发展迅速，首先是四个转率因子中c-Myc被证明是非必须的，尽管去除c-Myc后，重编程效率变得极低；其次，一系列促进重编程的小分子化合物被发现，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA、TSA，丁酸钠，DNA甲基化酶抑制剂5-AZA ；TGF-^抑制剂A83-01及SB431542，组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX01294，维生素C (抗坏血酸)等。这些小分子化合物的发现，极大的加速了 iPS进程，将重编程效率从起初的约O. 01%提高到接近1%的水平。此外，无血清以及化学成分限定培养条件的采用，将三因子的重编程效率提高到10%左右，同时也解决了血清培养体系中血清批次差异导致的实验重复性差的问题，为重编程研究提供了非常好的平台。然而，对转录因子诱导重编程过程机理的揭示进展依旧缓慢。寻找能替代核心重编程因子的小分子或基因，将对揭示核心重编程因子在重编中的功能起到推动作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种AP-I家族蛋白的c-Jun基因的截短型诱导多能性干细胞的方法及应用。本发明的技术方案为提供一种c-Jun的N端缺失与多能干细胞诱导因子联合使用在诱导多能性干细胞过程中的应用，所述c-Jun的N端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2、0ct4。优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2、c-Myc。优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、0ct4、c-Myc。
优选的，上述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2。本发明的另ー个技术方案为提供ー种C-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法a、将含有供体C-Jun蛋白氨基酸序列的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸对应的核酸序列克隆到表达载体上；b、用步骤a所得表达载体与多能干细胞诱导因子感染供 体体细胞使其重编程为多能干细胞。优选的，所述步骤a具体为将含有供体C-Jun蛋白氨基酸序列的254-334，274-334，170-334位氨基酸片段对应的核酸序列克隆到表达载体上。优选的，上述方法的多能干细胞诱导因子为Klf4、SoX2、0ct4。优选的，上述方法的多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2。优选的，上述方法的供体体细胞为小鼠成纤维细胞。本发明在诱导多能性干细胞的过程中使用了 AP-I家族蛋白的C-Jun蛋白的N端截短型，提供了一种高效率的重编程诱导体系，替代核心重编程因子的小分子或基因，将对掲示核心重编程因子在重编中的功能起到推动作用。c-Jun蛋白的N端截短型包括170位氨基酸至334位氨基酸等一系列截短，尤其包括170到274位到末端334位氨基酸的一系列截短型。如图2所示170-334，250-334、274-334片段对OKS诱导的重编程具有促进作用，其中170-334,250-334片段则对OKS诱导的重编程具有明显的促进作用。
图I是小鼠c-Jun蛋白全长和不同截短型的结构图。根据NCBI上小鼠c-Jun的蛋白序列全长和结构域信息，设计不同的引物，采用常规分子克隆的方法，克隆出图示中不同氨基酸的序列的多妝片段用于实验。其中1-334多妝片段命名为c-Jun-FL ； 1-256多妝片段命名为c-Jun(-bZIP)，170-334片段命名为c-Jun_DN。将克隆的片段用合适的限制性内切酶克隆到逆转录病毒载体PMXS上，进行目的片段的表达。图2是在OKS三因子重编程模型下，c-Jun蛋白全长或不同截短型与空载相比的重编程效率比较图。以OKS和空载病毒感染0G2胚胎成纤维细胞为对照，分别用OKS及所示c-Jun基因全长或不同截短型病毒感染0G2胚胎成纤维细胞。感染后在含血清的mES培养基中进行诱导培养，在合适的天数在荧光显微镜下计算GFP阳性的荧光克隆数。将各片段得到的重编程克隆数除以空载状态下的重编程克隆数，得到全长或各截短片段对重编程效率的影响。图3是c-Jun (-ZIP)和C-Jun-DN对三因子重编程效率的影响图。三因子SKO和所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纤维细胞后，在血清或无血清培养体系iSFl中连续培养，每天更换培养基。在合适的天数，通过荧光显微镜计算绿色荧光克隆数，以三因子感染组荧光克隆数为參照，计算各实验组的相对重编程效率。图4是C-JunDN对不同重编程因子的取代效果图。分别用所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纤维细胞，感染后在无血清培养体系iSFl中连续培养，每天更换培养基。在合适的天数，通过荧光显微镜计算绿色荧光克隆数。分析C-JunDN对Sox2，Klf4和0ct4的取代作用。K Klf4 ；S Sox2, M c-Myc, 0 :0ct4。
图5是C-JunDN替代0ct4与klf4及Sox2 —起将小鼠成纤维细胞重编程效果图。分别用所示病毒感染0G2小鼠胚胎成纤维细胞，感染后在无血清培养体系iSFl中连续培养，每天更换培养基。在合适的天数，通过荧光显微镜计算绿色荧光克隆数。K:Klf4;S:Sox2。图6是挑取的SKMJunDN诱导重编程克隆图。所述KSMJunDN为KSM和c-Jun-DN感染的细胞。由SKMJunDN诱导的重编程克隆在显微镜下呈现致密的球体，边缘光泽，形态均一，具有典型的干细胞形态；荧光显微镜下显示出很强的绿色荧光，表明其内源多能性基因0ct4已经激活。AP染色呈阳性，表明克隆表达碱性磷酸酶。图7是SKMJunDN诱导重编程克隆0ct4和Nanog启动子区CpG岛甲基化状态图。将挑取的SKMJunDN诱导重编程克隆培养物提取基因组DNA，采用PCR，用特异性引物将克隆基因组0ct4和Nanog启动子区目的片段分离。采用亚硫酸盐法分析 目的区域CpG岛的甲基化状态。结果表明，挑取的克隆0ct4和Nanog的启动子区均呈现去甲基化状态，与胚胎干细胞类似。黑圈表示CpG岛为甲基化状态，白圈表示CpG岛为去甲基化状态。图8是SKMJunDN诱导重编程克隆表达Sox2，Nanog, Rexl，SSEA-I等多能性分子标记物图。将挑取的克隆种植到饲养层细胞上，用胚胎干细胞培养两天。采用免疫荧光的方法，分别用Sox2，Nanog, Rexl, SSEA-I抗体和对应的荧光二抗检测这些多能型基因的表达状况。图9是SKMJunDN诱导重编程克隆具有正确的核型图。将挑去的克隆用秋水仙素处理后，采用常规方法进行核型分析，观察分裂像。图10是SKMJunDN诱导重编程克隆注射囊胚可形成嵌合鼠图。将挑取的SKMJunDN克隆消化为单细胞后注射到囊胚中(10-20个细胞/囊胚)，再将囊胚移植到ICR品系的假孕母鼠子宫中(10-15个囊胚/母鼠)，缝合伤口后继续饲养。待出生小鼠后通过检查虹膜及毛色来判断嵌合与否。使用0G2来源的细胞制备出iPSCs与ICR品系胚胎形成的嵌合鼠会呈现黑色虹膜和杂色毛发。图11是胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中c-Jun表达含量比较图。采用常规分子生物学方法分别提取胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞的总RNAJf 2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中c-jun基因的表达量。图12是胚胎干细胞向拟胚体分化过程中c-jun表达量变化图。将胚胎干细胞按照常规方法向拟胚体进行分化，分别收取不同天数的分化培养物提取总RNAJf 2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较向拟胚体分化不同天数过程中c-jun基因的表达量变化。图13是胚胎干细胞在分化过程中c-jun表达量变化图。将胚胎干细胞在撤去白细胞抑制因子(LIF)的条件下培养，细胞将逐步分化。收取不同天数的培养物提取总RNA，将2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较分化不同天数过程中c-jun基因的表达量变化。图14是c-Jun、c-Jun (-bZIP)和C-JunDN对干细胞分化影响效果图。分别构建c-Jun.c-Jun(-bZIP)和C-JunDN稳定表达干细胞株，并在胚胎干细胞的培养条件下进行连续传代培养。图15是c-Jun (_bZIP)和C-JunDN对干细胞多能性维持效果图。分别构建c-Jun (-bZIP)和c-JunDN的稳定表达干细胞株，在撤去LIF后的胚胎干细胞培养基中培养。观察观察干细胞的多能性状态，并用AP染色检测多能性分子标记物碱性磷酸酶的活性。c-Jun (-bZIP)和C-JunDN的过表达均会在没有LIF的状态下维持干细胞的多能性，延迟分化。图中黑色为碱性磷酸酶染色。
具体实施例方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。參见例如分子克隆实验指南，第3版(2002)，Sambrook，Fritsch 和 Maniatis 等人编著；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel 等人编著(1987));丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY (Academic Press, Inc.) PCR2 A PRACTICAL APPROACH(1995)，M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 等人编著，ANTIBODIES (1988)，Harlow 和 Lane 等人编著，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (1987)，R. I. Freshney 等人编著！HANDBOOK OFSTEM CELLS，卷 2，W. FrenchAnderson等人編著。除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的ー些术语进行了下述定义。本文所述的“胚胎干细胞”是这样的细胞。其来源于小鼠囊胚内细胞团分离培养而来，可在体外无限増殖、自我更新并具有多项分化潜能，和分化成三个胚层的任何ー种细胞类型。具有特异的分子标记物，可以形成畸胎瘤，注射到3. 5天囊胚再置于代孕母鼠子宮类可形成嵌合鼠。本文所述的Rl细胞来源于129品系小鼠3. 5天囊胚分离出的胚胎干细胞系，为实验室常用的胚胎干细胞系，具有胚胎干细胞的基本特征，可以血清培养条件下，在无饲养层细胞上传代培养。本文所述的“诱导式多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其来源是体细胞通过诱导体细胞重编程变化而成，其在胚胎干细胞培养条件下，与胚胎干细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠胚胎干细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠胚胎干细胞几乎完全相似。本文中所用的术语“体细胞”是相对干“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化产生的不再具有多能性，而是具有某一具体功能的细胞，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期(在小鼠中具体为受精后3. 5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞
坐、
ノ O本文中所用的体细胞优选来源于哺乳动物，更优选来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠，最优选地，来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞。
本文所述的术语“诱导”(也称“诱导重编程”)是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞(Takahashi K，Yamanaka S. Cell. 2006 ； 126:663 - 676 ；Wernig M, Meissner A,Foreman R,等人，Nature. 2007 ；448:318-324 ；Yu J, Vodyanik MA,Smuga-Otto K 等人 Science. 2007 ;318:1917-1920)。本文所述的术语“重编程”:指将已分化的细胞去分化，重新回复到多能性细胞的状态。本发明中的重编程指将成体细胞逆分化为胚胎干细胞的状态。将所述干细胞多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体 (例如pMX载体)。本文中所述的“病毒感染”即指的是上述将干细胞多能性因子cDNA导入体细胞的方法。本文中的“SOX2/KLF4/0Ct4/C-MyC”即指的是上述干细胞多能性因子cDNA或带有这些cDNA的病毒载体，干细胞多能性因子cDNA可由“病毒感染”导入体细胞中，其在体细胞等表达体系中，可以翻译合成基因产物。本文中OKSM表示的是0ct4、Klf4、Sox2、c_Myc病毒感染的细胞；“KSM”表示的是Klf4、Sox2、c-Myc病毒感染的细胞；“0SM”表示的是0ct4、Sox2、c-Myc病毒感染的细胞。“4F”表示的是0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc四个因子，“3F”表示的是0ct4、Klf4、Sox2三个因子。本文中细胞的培养方法是常规的细胞培养方法及条件，包括ー些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，各种细胞类型的培养方法以及培养条件，可參见ff. French Anderson 等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷 2，或申请号为 200910038883. 4 的中国授权发明。本文所述的“无血清培养基SF1”为申请号为200910038883.4的中国授权发明中的iPS-SFl培养基。本发明不限于使用与高效培养基相同的培养基，其他含有基础培养基以及血清或代血清添加剂的培养基都能够添加c-Jun截短型诱导诱导式多能性干细胞。本文中iPS细胞的鉴别采用了报告基因的方法，所述的报告基因是指能够指示细胞通过外加诱导已经转变为类似胚胎干细胞的阶段，包括利用转基因或同源重组手段加入一段表达荧光蛋白(如本文中的GFP)或者抗性的序列，这段序列处在胚胎干细胞特异表达的ー些基因的启动子的控制下，故而可以在细胞到达胚胎干细胞状态时激活这段荧光蛋白或抗性基因的表达，从而使这个细胞具有某些可以被检测的性状特征(如发出绿光)而区别于其他未重编程至该状态的细胞。本领域技术常用的报告基因包括绿色荧光蛋白，抗性基因例如氨苄青霉素抗性基因等。本领域的技术人员可以根据细胞的培养条件和用途选择适合于各种实施方案的报告基因。參考例如Young II Yeom等人，Germlineregulatory element of Oct-4 specmc ior the totipotent cycle 01 embryonalcells，Development 122，000-000 (1996)，Printed in Great Britain, The company ofBiologists Limited 1996，881_894页；Shin-yaHatano等人，Pluripotential competenceof cells associated with Nanog activation,Mechanisms of Development 122(2005)，67-79。本文所 述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如 Yamanaka，S. Strategies and new developments in the generation ofpatient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 1，39-49 (2007)等。所述方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用经诱导的多能性干细胞形成嵌合鼠等等。本文所述的“嵌合鼠”是通过本领域普通技术人员熟知的“嵌合鼠”技术实施的。是指将胚胎干细胞或通过本文技术获得的iPS细胞注射入小鼠囊胚中，使得其与所注射入小鼠的囊胚中的胚胎细胞混合，共同在代孕母鼠中的子宫内生长发育，小鼠出生后全身上下的各个组织即由两种胚胎细胞共同混合组成，如马赛克拼图样，这样的小鼠被称为嵌合鼠(Evans M J，等人；The ability of EK cell to form chimeras after selection ofclones in G418 and some observation on the intergration of retroviral vectorproviral DNA into EK cells[M] ；Cold Spring Harbor Symposia on QuantitativeBiology ；1985 年；Xian MW，Wu BY，Hu XL，Shang KG, Wu HL, 1996. Construction ofchimeric mice of ES cells by microinjection method. Hereditas 18(1):7_10)。使用iPS能否形成嵌合鼠是检验iPS是否与胚胎干细胞具有类似性质的最直接和最关键的证据。本文所述的“基础培养基”为人工制备的含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素、脂质等细胞生长所需营养物质的培养品。本发明所述基础培养基包括Dulbecco’ s ModifiedEagle，s Medium(DMEM)，Minimal Essential Medium (MEM)，Basal Medium Eagle(BME)，F-10，F-12，RPMI 1640，Glasgow’ s Minimal Essential Medium (GMEM)，a MinimalEssential Medium( a MEM), Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium 和 M199 等，但不仅限于上述基础培养基，其中优选的基础培养基为高糖DMEM基础培养基。本文所述c-Jun全长的氨基酸序列(SEQ ID NO 1) :(1-334)I mtakmettfyddalnasfIqsesgaygysnpkilkqsmtlnladpvgslkphlraknsdl61 Itspdvgllkl aspelerlii qssnghittt ptptqfIcpk nvtdeqegfa egfvralae121 lhsqntlpsv tsaaqpvsga gmvapavasv agagggggys aslhseppvy anlsnfnpga181 lssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempg241 etpplspidmesqerikaerkrmrnriaaskcrkrkleriarleekvktlkaqnselast301 anmlreqvaq lkqkvmnhvn sgcqlmltqq Iqtf本文所述c-JunDN 截短型(170-334)序列(SEQ ID NO :2)yanlsnfnpgalssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempgetpplspidmesqerikaerkrmrnriaaskcrkrkleriarleekvktlkaqnselastanmlreqvaqlkqkvmnhvnsgcqlmltqqlqtf本文所述c-Jun-Bzip (1-256)序列(SEQ ID NO :3):I mtakmettfyddalnasflqsesgaygysnpkilkqsmtlnladpvgslkphlraknsdl61 tspdvgllklaspelerliiqssnghitttptptqflcpknvtdeqegfaegfvralae121 lhsqntlpsvtsaaqpvsgagmvapavasvagagggggysaslhseppvyanlsnfnpga181 lssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempg
241 etpplspidmesqeri本文所述c-Jun全长的cDNA序列(SEQ ID NO 4)ATGACTGCAAAGATGGAAACGACCTTCTACGACGATGCCCTCAACGCCTCGTTCCTCCAGTCCGAGAGCGGTGCCTACGGCTACAGTAACCCTAAGATCCTAAAACAGAGCATGACCTTGAACCTGGCCGACCCGGTGGGCAGTCTGAAGCCGCACCTCCGCGCCAAGAACTCGGACCTTCTCACGTCGCCCGACGTCGGGCTGCTCAAGCTGGCGTCGCCGGAGCTGGAGCGCCTGATCATCCAGTCCAGCAATGGGCACATCACCACTACACCGACCCCCACCCAGTTCTTGTGCCCCAAGAACGTGACCGACGAGCAGGAGGGCTTCGCCGAGGGCTTCGTGCGCGCCCTGGCTGAACTGCATAGCCAGAACACGCTTCCCAGTGTCACCTCCGCGGCACAGCCGGTCAGCGGGGCGGGCATGGTGGCTCCCGCGGTGGCCTCAGTAGCAGGCGCTGGCGGCGGTGGTGGCTACAGCGCCAGCCTGCACAGTGAGCCTCCGGTCTACGCCAACCTCAGCAACTTCAACCCGGGTGCGCTGAGCAGCGGCGGTGGGGCGCCCTCCTATGGCGCGGCCGGGCTGGCCTTTCCCTCGCAGCCGCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCTCAGCCGCCGCACCACTTGCCCCAACAGATCCCGGTGCAGCACCCGCGGCTGCAAGCCCTGAAGGAAGAGCCGCAGACCGTGCCGGAGATGCCGGGAGAGACGCCGCCCCTGTCCCCTATCGACATGGAGTCTCAGGAG CGGATCAAGGCAGAGAGGAAGCGCATGAGGAACCGCATTGCCGCCTCCAAGTGCCGGAAAAGGAAGCTGGAGCGGATCGCTCGGCTAGAGGAAAAAGTGAAAACCTTGAAAGCGCAAAACTCCGAGCTGGCATCCACGGCCAACATGCTCAGGGAACAGGTGGCACAGCTTAAGCAGAAAGTCATGAACCACGTTAACAGTGGGTGCCAACTCATGCTAACGCAGCAGTTGCAAACGTTTTGA实验例I :C-Jun及其不同的缺失型的构建，c-jun截短促进SKO诱导的重编程效率。采用常规分子克隆方法分别将含有c-jun蛋白全长(324个氨基酸)，及1_256，75-324，170-334，254-334，274-334，170-334等6种不同氨基酸片段的核酸序列克隆到PMXs逆转录病毒表达载体上。最终克隆片段如图I所示。将小鼠成纤维细胞消化后，以每孔2万细胞种植到12孔板内，分别用OKS或OKSM
及实施例I中构建的表达载体进行感染。感染后用通用的重编程培养基培养，每天更换培养基，并在合适的天数在荧光显微镜下计算荧光克隆数。如图2所示，与空载相比，C-Jun蛋白全长，1-256片段，75_324片段均对OKS诱导重编程有抑制作用，其中C-Jun蛋白全长抑制最为显著。而170-334，250-334片段则对OKS诱导的重编程具有明显的促进作用，其中170—334促进作用尤其显著。170-282和274-334片段对OKS诱导的重编程有影响但不明显。在接下来的的实施例中，我们将c-Jun全长命名为 c-Jun FLJf c-JUN 170-334 片段命名为 c-jun-DN.实验例2 :c-Jun-DN促进SKO诱导的重编程效率，并能替代重编程因子Oct或Sox20c-JunDN分别和三因子SKO或不同因子组合感染MEF细胞，并在血清或无血清诱导培养体系中进行培养，每天更换培养基并在合适的天数计算重编程效率。观察c-JunDN对重编程效率的影响及对重编程因子的替代作用。本文所述的“无血清培养基SF1”为申请号为200910038883.4的中国授权发明中的iPS-SFl培养基。本文所述的血清培养基为本领域技术人员所熟知的小鼠胚胎干细胞细胞培养基，主要成分为基础培养基添加胎牛血清，并添加白细胞抑制因子LIF。本实施例的“血清培养基”为申请号为200910038883. 4的中国授权发明中的mES培养基。如图3所示，在无血清或有血清的培养体系下，c-Jun-DN均能提高SKO诱导的重编程效率。如图4所示，在无血清培养基iPS-SFl条件下，C-JunDN可在没有Sox2或0ct4的条件下实现有效重编程。如图5所示，在无血清培养基iPS-SFl条件下，c-JunDN可与Sox2，Klf4 一起将小鼠成纤维细胞重编程。如图6所示，c-Jun-DN替代0ct4产生的KSMJunDN克隆表达绿色荧光，并具有典型的干细胞形态，AP染色也成阳性。所述KSMJunDN为KSM和c-Jun-DN感染的细胞。如图7所示，c-Jun-DN替代0ct4产生的KSMJunDN克隆0ct4和Nanog启动子区均为去甲基化状态，与胚胎干细胞类似。如图8 所示，c-Jun-DN 替代 0ct4 产生的 KSMJunDN 克隆表达 Sox2, Nanog, Rexl, SSEA-I等多能性分子标记物。如图9所示，c-Jun-DN替代0ct4产生的KSMJunDN克隆具有正确的核型。如图10所示，c-Jun替代0ct4产生的KSMJunDN克隆能够产生嵌合体小鼠。上述结果表明C-JunDN-DN可有效替代0ct4或Sox2将胚胎成纤维细胞重编程。实施例3 :c-Jun-DN可以维持干细胞的多能性。为了研究C-Jun基因在胚胎干细胞多能性維持中的作用，我们研究了该基因在胚胎干细胞和成体细胞及胚胎干细胞分化过程中的表达状况，同时分析了不同的截短型在胚胎干细胞多能性維持和分化的影响。分别将小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)和胚胎干细胞(ES)提取RNA，再用RT-PCR的方法分析两种细胞中c-Jun的表达量。如图11显示，MEF细胞中c-Jun的表达量远高于胚胎干细胞中的表达量。表明c-Jun因子可能不利于多能性的維持。将ES细胞采用标准的方式分化为拟胚体(EB)，在不同的天数收取样品，提取RNA，采用RT-PCR的方法分析两种细胞中c-Jun的表达量。如图12所示，ES细胞向EB分化的过程中c-Jun的表达量不断上调。将ES细胞在没有LIF的培养基中培养，在不同天数收取细胞样品，提取RNA，采用RT-PCR的方法分析两种细胞中c-Jun的表达量.如图13所示，ES细胞分化过称中，c-Jun的表达量不断上调。分别将c-Jun全长,c-Jun (_bZIP), c-JunDN转入Rl中，采用抗性筛选能稳定表达目的基因片段的细胞系。如图14所示,c-Jun全长在Rl中过表达,能引起干细胞的分化,而c_Jun (_bZIP),c-JunDN则不会引起干细胞分化。如图15所示，在撤去LIF的ES培养基里，c-Jun (-bZIP)，c-JunDN能维持细胞的多能性状态，延缓干细胞分化。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120>C-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法和应用<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>333<212>PRT〈213〉小鼠c-jun氨基酸序列〈400〉IMet Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala151015Ser Phe Leu Gln Ser Glu Ser Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys202530He Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser354045Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Thr Ser Pro Asp505560Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu He Ile65707580Gln Ser Ser Asn Gly His He Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln Phe859095Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu Gly100105110Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro Ser115120125Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Ser Gly Ala Gly Met Val Ala Pro130135140Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ala145150155160Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn165170175Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala180185190Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln195200205Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln He Pro Val Gln His Pro Arg Leu210215220Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu225230235240Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg He Lys
245250255Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg He Ala Ala Ser Lys Cys Arg260265270Lys Arg Lys Leu Glu Arg He Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr275280285Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg290295300Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser 305310315320Gly Cys Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe325330<210>2<211>165<212>PRT〈213〉小鼠c-Jun截短型(170-334)位氨基酸序列<400>2Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly151015Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro202530Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln354045He Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln505560Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp65707580Met Glu Ser Gln Glu Arg He Lys Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn859095Arg He Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg Lys Leu Glu Arg He Ala100105110Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu115120125Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln130135140Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys Gln Leu Met Leu Thr Gln145150155160Gln Leu Gln Thr Phe165<210>3
<211>255<212>PRT〈213〉小鼠c-Jun截短型(1-256)位氨基酸序列<400>3Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala151015Ser Phe Leu Gln Ser Glu Ser Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys202530
He Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser354045Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Thr Ser Pro Asp505560Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu He Ile65707580Gln Ser Ser Asn Gly His He Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln Phe859095Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu Gly100105110Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro Ser115120125Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Ser Gly Ala Gly Met Val Ala Pro130135140Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ala145150155160Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn165170175Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala180185190Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln195200205Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln He Pro Val Gln His Pro Arg Leu210215220Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu225230235240Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile245250255<210>4〈211>1005<212>DNA
〈213〉人工序列<400>4atgactgcaa agatggaaac gaccttctac gacgatgccc tcaacgcctc gttcctccag60tccgagagcg gtgcctacgg ctacagtaac cctaagatcc taaaacagag catgaccttg120aacctggccg acccggtggg cagtctgaag ccgcacctcc gcgccaagaa ctcggacctt180
ctcacgtcgc ccgacgtcgg gctgctcaag ctggcgtcgc cggagctgga gcgcctgatc240atccagtcca gcaatgggca catcaccact acaccgaccc ccacccagtt cttgtgcccc300aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgagggct tcgtgcgcgc cctggctgaa360ctgcatagcc agaacacgct tcccagtgtc acctccgcgg cacagccggt cagcggggcg420ggcatggtgg ctcccgcggt ggcctcagta gcaggcgctg gcggcggtgg tggctacagc480gccagcctgc acagtgagcc tccggtctac gccaacctca gcaacttcaa cccgggtgcg540ctgagcagcg gcggtggggc gccctcctat ggcgcggccg ggctggcctt tccctcgcag600ccgcagcagc agcagcagcc gcctcagccg ccgcaccact tgccccaaca gatcccggtg660cagcacccgc ggctgcaagc cctgaaggaa gagccgcaga ccgtgccgga gatgccggga720gagacgccgc ccctgtcccc tatcgacatg gagtctcagg agcggatcaa ggcagagagg780aagcgcatga ggaaccgcat tgccgcctcc aagtgccgga aaaggaagct ggagcggatc840gctcggctag aggaaaaagt gaaaaccttg aaagcgcaaa actccgagct ggcatccacg900gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag cttaagcaga aagtcatgaa ccacgttaac960agtgggtgcc aactcatgct aacgcagcag ttgcaaacgt tttga100权利要求
1.C-Jun的N端缺失与多能干细胞诱导因子联合使用在诱导多能性干细胞过程中的应用，所述c-Jun的N端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2、0ct4o
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2、C-MyCo
4.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为Klf4、0ct4、C-MyCo
5.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2。
6.使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法，其特征在于， a、将含有供体c-Jun蛋白氨基酸序列的170到274位氨基酸到末端334位氨基酸对应的核酸序列克隆到表达载体上； b、用步骤a所得表达载体与多能干细胞诱导因子感染供体体细胞使其重编程为多能干细胞。
7.根据权利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法，其特征在于，所述步骤a具体为将含有供体c-Jun蛋白氨基酸序列的254-334，274-334，170-334位氨基酸片段对应的核酸序列克隆到表达载体上。
8.根据权利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2、0ct4。
9.根据权利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为Klf4、Sox2。
10.根据权利要求6所述的使用AP-I家族的c-Jun的N端缺失诱导多能性干细胞的方法，其特征在于，所述供体体细胞为小鼠成纤维细胞。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域的干细胞研究，具体涉及AP-1家族蛋白c-Jun截断型诱导多能性干细胞的方法及其应用。本发明的技术方案为提供一种c-Jun的N端缺失与多能干细胞诱导因子联合使用在诱导多能性干细胞过程中的应用，所述c-Jun的N端缺失为AP-1家族蛋白c-Jun的170位氨基酸至334位氨基酸的一系列截短的氨基酸序列或其对应的核酸序列。本发明在诱导多能性干细胞的过程中使用了AP-1家族蛋白的c-Jun蛋白的N端截短型，提供了一种高效率的重编程诱导体系，替代核心重编程因子的小分子或基因，将对揭示核心重编程因子在重编中的功能起到推动作用。
文档编号C12N5/10GK102816796SQ20121032457
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者裴端卿, 韩庆凯, 刘晶, 陈捷凯, 韦备, 彭梅秀 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院