专利名称：猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪α干扰素成熟蛋白(mIFNa )重组腺病毒及其构建方法与应用，属于生物技术技术领域。
背景技术：
猪α干扰素具有广谱、高效抗病毒、抗肿瘤的作用，其对免疫系统起关键的调节作用，猪α干扰素对入侵病毒的非特异性抑制功能，对许多重大传染病致病病毒具有有效地防御功能。基因工程制备的猪α干扰素与血源性干扰素相比，具有无污染、安全性高、纯度高、比活性高、成本低、疗效确切等优点。中国专利文献CN101845441A (申请号201010125057. 6)公开了一种复合猪α干扰素基因及其重组载体，属于基因工程生物制品技术领域。将新设计的复合猪α干扰素的·基因序列重组到PPICZ a -A载体，电转化入酵母菌感受态细胞，阳性鉴定、高拷贝酵母菌株的筛选、诱导表达。该系统表达的复合猪α干扰素效价较低，应用猪体后，降解较快，不利于临床应用。重组腺病毒rAdnIFN α在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae),哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus),人腺病毒种(Human adenovirus),该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效地表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经取得了广泛地应用，很多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床三期阶段。因为重组腺病毒具有感染宿主范围广，能够感染分裂和不分裂的细胞；可以表达人源和非人源蛋白；而且不会整合到宿主基因组中，不会引起基因插入突变，可以复制得到高滴度等特点。中国专利文献CN1275084A (申请号98809116. X)公开了一种重组的猪腺病毒载体，包括稳定整合并能表达至少一种异源核苷酸序列的重组猪腺病毒的重组载体。核苷酸序列优选地是编码猪霍乱病毒或假狂犬病病毒的抗原决定簇的序列。该腺病毒载体无法满足猪α干扰素的表达要求。中国专利文献CN1970774 (申请号200610124194)公开了一种猪α干扰素重组腺病毒及其构建方法，其构建方法步骤如下猪α干扰素IFN-α基因的扩增、克隆；含有IFN-a基因的重组穿梭载体的构建；重组腺病毒质粒载体的构建；重组腺病毒的获得。还公开了猪a干扰素重组腺病毒在制备抗病毒疫苗中的应用。该方法获得的重组腺病毒滴度较低，而且带有GFP标签，不能应用于临床。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种猪α干扰素成熟蛋白(mIFNa )重组腺病毒及其构建方法与应用。本发明是通过以下技术方案实现的一种猪a干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，将猪a干扰素表达基因插入到穿梭载体 pShuttle-CMV 中，制得 pShuttle-CMV-mlFNα ;然后将 pShuttle-CMV-mlFNα与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAchmIFN α ;再经脂质体转染细胞、包装，获得猪ct干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mlFNa。根据本发明优选的，所述的猪α干扰素表达基因序列如SEQ ID NO. I所示。根据本发明优选的，所述重组腺病毒质粒pAd-mlFNa的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。根据本发明优选的,所述的脂质体为脂质体Lipofectamine2000或293Fectin。根据本发明优选的，所述的细胞为293细胞或AD293细胞。上述猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤
(I)提取猪的外周血单核淋巴细胞的总RNA，然后利用RT-PCR扩增猪α干扰素成熟蛋白基因，制得核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的基因片段；(2)将步骤(I)制得的基因片段插入穿梭载体pShuttle-CMV中，制得含有猪mIFNa的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-mlFN a ；(3)将腺病毒骨架载体pAdEasy-1转化至由BJ5183大肠杆菌制备的感受态细胞，制得含pAdEasy-Ι的BJ5183细胞，然后制备含pAdEasy-Ι的BJ5183感受态细胞；(4)将步骤(2)制得的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-mlFNa电转化至由步骤(3)制得的含pAdEasy-Ι的BJ5183感受态细胞，经同源重组后，获得重组腺病毒质粒pAd-mlFNα ；(5)将步骤(4)制得的重组腺病毒质粒pAd-mlFNa经脂质体转染细胞、包装，获得猪ct干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mlFNa。所述步骤(I)中，RT-PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所
/Jn ο上述猪a干扰素成熟蛋白重组腺病毒在制备猪抗病毒感染药物中的应用。上述操作如无特殊说明，均可采取本领域常规技术。有益效果I、本发明构建的猪a干扰素成熟蛋白重组腺病毒外源蛋白表达稳定，且滴度高而稳定，重组腺病毒的滴度(组织细胞半数感染量)稳定在108 67TCID5(l/mL，与现有干扰素相t匕，本发明构建的重组腺病毒滴度提高了 10000倍；2、本发明表达的是猪a干扰素成熟蛋白，成熟蛋白是真正发挥抗病毒作用的蛋白，不包含降低重组病毒滴度的疏水信号肽干扰蛋白的表达；3、本发明表达猪a干扰素成熟蛋白的腺病毒载体，由于该重组腺病毒采用人血清5型腺病毒，对人、猪等动物没有致病性，不表达GFP蛋白，生产上更安全；4、本发明利用腺病毒载体首次表达猪a干扰素成熟蛋白，该重组腺病毒突破了常规猪a干扰素的局限性，使猪a干扰素提前表达，使猪提前获得抵抗病毒感染的能力；5、本发明所述重组腺病毒能在体内进行有限增值并且不断表达mIFNa蛋白，表达的mIFNa具有广谱抗病毒作用，通过抑制病毒的吸附、脱壳盒早期病毒核酸转录、病毒蛋白合成以及成熟病毒的释放等病毒感染过程的各个环节，起到抑制病毒增殖的效果；6、本发明所述重组腺病毒可以有效预防和治疗由病毒引起的猪的多种传染病，针对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等疾病有显著疗效，提高公猪的精液质量，降低母猪的流产、死胎、木乃伊胎及产仔数少等情况，实验证明，对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病治愈率高达80-95%。本产品对猪瘟、口蹄疫等也有显著地疗效，显著降低由此引发的经济损失，使猪的生产性能大大提高。
图I是重组猪α干扰素成熟蛋白腺病毒的生产工艺流程图；图2是重组腺病毒质粒的Pac I酶切鉴定的电泳图；图3是RT-PCR鉴定猪mIFN α重组腺病毒表达的电泳图；图4是Western-blot鉴定mIFNa重组腺病毒表达的电泳图；
具体实施例方式下面通过实施对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例中所述的腺病毒穿梭载体pShut11e-CMV、腺病毒骨架载体pAdEasy-1、BJ5183大肠杆菌、293细胞、AD293细胞均购自QbioGene公司；脂质体Lipofectamine2000、293Fectin购自Invitrogen公司；EcoR I内切酶、Xho I内切酶、Pac I内切酶购自NEB公司。实施例I猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤一、猪α干扰素成熟蛋白腺病毒质粒(pAd-mlFNa )的构建I、细胞总RNA提取用淋巴细胞分离液(购自上海生工公司)分离猪的外周血单核淋巴细胞，将细胞用RPMI-1640培养基(购自HyClone公司)稀释成5 X IO VmL,种植24孔细胞板，每孔lmL。每孔中添加ConA(购自Sigma公司)至5μ g/mL，置37°〇、5%0)2培养箱中培养。24h后，弃去上清，加入ImL TRIzol (购自Invitrogen公司),提取细胞总RNA, RNA提取步骤均按Invitrogen公司生产的RNA提取试剂盒说明书中的步骤进行操作。2、引物根据猪IFNa 序列(GenBank No. NM 001195377)设计引物上游引物5’ -GTAGAATTCATGTGCGACCTGCC-3，，下游引物5’ -GAACTCGAGTCACTCCTTCTTCCTG-3，。在上游引物中引入EcoRI内切酶酶切位点，在下游引物中引入Xho I内切酶酶切位点。引物由上海生工生物工程有限公司合成。3、猪α干扰素成熟蛋白基因的克隆将提取到的细胞总RNA作为模板,用TaKaRa公司出售的PrimeScript One-StepRT-PCR试剂盒扩增猪α干扰素成熟蛋白编码基因；反应体系如下RNA模板3 μ L、2 X PrimeScript One-Step缓冲液12. 5 μ L、上下游引物各IuL (10 μ mol/L)和酶混合物(反转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂)I μ L，加水至25 μ L混匀。反应条件为50°C反转录30min，94°C预变性2min，94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸45s，循环30次，最后72°C延伸lOmin，PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，可观察到50Ibp大小的特异DNA条带。PCR产物用DNA快速回收试剂盒(购自TaKaRa公司)回收，将回收的PCR产物与PMD19-T (购自TaKaRa公司)在16°C连接30min，将连接产物转化DH5a感受态细菌，37°C培养16h 20h。挑取平板上的单菌落于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37°C过夜振荡培养，次日应用菌液PCR的方法扩增IFNa成熟蛋白基因筛选阳性克隆，阳性重组质粒命名为ρΤ-mIFNa ;鉴定为阳性的菌液提取质粒交由上海生工测序。猪IFNa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，将序列在GenBank中进行BLAST比对，与已发布的猪IFNa基因序列的同源性达到96%以上。·4、重组猪mIFNa穿梭载体的构建将测序正确的阳性质粒ρΤ-mIFNa经EcoR I和Xho I双酶切，胶回收目的片段，克隆入与经过EcoR I内切酶和Xho I内切酶双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，提取质粒，用EcoR I内切酶和Xho I内切酶双酶切鉴定和测序分析，获得含有猪mIFN a的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-mlFN a (具体步骤和操作条件可参见腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV的使用说明书)。5、含腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι的BJ5183大肠杆菌感受态细胞的制备将腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι转化至BJ5183大肠杆菌感受态细胞(2. 5Κν、200Ω、25yF电击)，用含氨苄青霉素(ΙΟΟμ g/mL)和链霉素(25μ g/mL)的LB平板培养基筛选，挑取单克隆，获得含pAdEasy-Ι的BJ5183细胞，然后用冰冷的含10%甘油的双蒸水(WB)洗涤BJ5183细胞2次，最后用1/100原始培养体积的WB重悬细胞，然后制备成电转化感受态细胞。6、重组猪mIFNa腺病毒质粒的构建重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-mlFNa经Pme I内切酶(购自NEB公司)线性化后，胶回收，电转化至含腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι的BJ5183大肠杆菌感受态细胞，37°C培养20h 24h，在大肠杆菌重组酶的作用下，穿梭载体和骨架载体发生同源重组，将外源基因转入腺病毒骨架载体。挑取平板上的单菌落于卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37°C过夜振荡培养，次日碱裂解法提取质粒，经限制性内切酶Pac I酶切，得到一条大约30kb的大片段和一条大约3kb的小片段(图2)，表明含有目的基因的阳性重组腺病毒质粒pAd-mlFNa构建成功。将鉴定为阳性的菌液提取质粒交由上海生工测序，重组腺病毒质粒pAd-mlFNa的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。二、重组腺病毒rAd-mlFNa的包装及鉴定1、293细胞的复苏、培养与冻存(I)将液氮中保存的293细胞株迅速放入37 42°C水浴中，剧烈摇晃，使之快速融化。(2) 2000rpm离心IOmin,吸去上清,加入ImL含10% (v/v)小牛血清的DMEM培养液(购自HyClone公司)，漂洗细胞表面，吸去营养液，重复2次。(3)加入ImL含10% (v/v)小牛血清的DMEM培养液，轻轻吹打细胞团使之分散，转入25mL细胞瓶，补加4mL含10% (v/v)小牛血清的DMEM培养液，摇匀后置于37°C、5%C02培养箱培养。
(4)每天在倒置生物显微镜下观察细胞生长情况，每2天传代一次。(5)把处于对数生长期、生长良好的293细胞完全消化下来，离心、沉淀293细胞，用少量含10% (v/v)小牛血清的DMEM重悬细胞，进行细胞计数。(6)用含50% (v/v)小牛血清的DMEM、40% (v/v)小牛血清和10% (v/v)小牛血清的DMSO的细胞冻存液使细胞密度达到I X IO6个/mL，在I. 8mL冻存管中分装I. OmL的293细胞，把冻存管置于液氮罐液氮面上方，24h后把细胞沉到液氮面以下。2、猪mIFNa重组腺病毒的包装与鉴定与表达重组腺病毒质粒pAd-mlFN a经Pac I内切酶酶切纯化后，经脂质体Lipofectamine 2000转染293细胞，包装获得重组猪mIFN α腺病毒rAdiIFN α。提取重组病毒的RNA，进行RT-PCR鉴定，扩增出约50Ibp的片段，未转染的293细胞结果为阴性，与预期结果相符，结果如图3所示。 3、猪mIFNa重组腺病毒的表达与鉴定将感染rAd-mlFNa的293细胞离心，收集细胞，加入2XSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min,用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析。Western-blot结果表明重组腺病毒在293细胞中表达了目的蛋白，蛋白大小(ISkD)与预期的蛋白分子量一致，结果如图4所不。此蛋白为猪α干扰素成熟蛋白(mIFN a )基因表达广物。4、猪mIFNa重组腺病毒的纯化在24孔细胞板的每一个孔2 X IO4个293细胞，37°C、5%C02培养箱培养；待细胞长满单层后，将重组病毒按照1%体积比接种细胞，37°C吸附Ih ;弃去上清，用DMEM洗涤细胞2次；在一无菌的三角烧瓶中加入IOmL 37°C预热的含1 丨％青霉素、1被％链霉素和4wt%血清的2 X DMEM，和IOmL高压灭菌的2wt%的琼脂糖，充分混匀后置于37°C水浴锅中；按24孔细胞板的每一孔加500 μ L上述琼脂糖，37°C、5%C02培养箱培养，观察噬斑；用灭菌吸头挑取包含单个噬斑的琼脂糖块放入灭菌离心管中，加入200 μ L灭菌的PBS，将琼脂糖块捣碎后，反复冻融3次；12000rpm离心5min ;将收获的病毒上清接种于一新的24孔细胞板中。5、猪mIFNa重组腺病毒的TCID5tl测定按照《动物病毒学》(科学出版社，出版号9787030060532，出版日期1997年11月)中第十四章中记载的方法，用含2wt%血清和lwt%青霉素、lwt%链霉素的DMEM维持液将重组腺病毒作10倍比稀释，然后分别接种于长满293细胞单层的96孔细胞板，每个稀释度接种8个孔，每个孔接种100 μ L0同时设定维持液阴性对照。37°C、5%C02培养箱培养，每天观察并记录细胞病变，按照Reed-Much法计算病毒TCID5(I。重组病毒效价为108 67TCID5(l/mL。6、猪mIFNa重组腺病毒的稳定性试验将重组腺病毒rAd-mlFN a在293细胞上连续传代50代，每5代分别检测rAd-mlFNa中mIFNa的基因转录和蛋白表达，同时测定其组织细胞半数感染量(TCID5Q)。结果表明，mIFNa在重组腺病毒rAd-mlFN a连续传代过程中表达稳定，其TCID5tl也一直稳定，未发生变化。综上所述，将纯化的重组腺病毒rAd-mlFN a在293细胞上连续传代50代，每5代检测重组腺病毒中mIFN a的表达情况，同时测定其TCID5(I。结果证明，重组腺病毒能稳定表达mIFNa蛋白，而且其TCID5tl稳定，种毒的滴度稳定在108 67TCID5(l/mL。实施例2
如实施例I所述的猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒的构建方法，不同之处在于，脂质体为293Fectin，转染细胞为AD293细胞。实施例3猪mIFNa重组腺病毒的大量制备将实施例I和实施例2纯化的重组腺病毒rAd-mlFN a在293细胞上连续传代50代，检测其猪mIFNa的表达情况，证明猪mIFN a表达稳定，而且重组病毒的滴度稳定在108_67TCID5(l/mL。在扩大培养过程中，用纯化的猪mIFNa重组腺病毒按IO4TCID5tl接种长成单层的293细胞。当细胞病变达到80 90%时收获病毒，冻融后即可获得猪mIFNa重组腺病毒，分别标记为样品I和样品2。
实施例4猪mIFNa重组腺病毒对猪病毒性疾病治疗的动物实验案例一猪mIFN a重组腺病毒对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的治疗30日龄断奶仔猪160头，随机分成I、II组，每组80头。每组中再随机分成4小组，每小组20头，包括样品I和样品2两个试验小组各3个不同剂量组和2个对照组。分别于攻毒后肌肉注射两个样品的猪mIFN a重组腺病毒108TCID5(I、2 X 108TCID5(I、3 X IO8TCID5tl,非治疗对照组注射ImL生理盐水。攻毒后2天开始治疗，肌肉注射猪mIFN a重组腺病毒，每天一次，连续使用三天。连续观察14天。保护率=(AXB-C)/AXB，A为试验组猪，B为对照组发病/死亡比例，C为试验组发病/死亡猪数。表I各组试验猪干扰素注射量(IO8TCID5tl/只)
Λ1Ι试验纽X (X=A成B 1 C)对照汛
1\ I m —————
XlX2X3X4
I0.51.01.5-
_I_oj_u_y_=_以IO8TCID5tl/头剂量的猪mIFN a重组腺病毒肌肉注射治疗，断奶仔猪可以获得80%以上的保护率；以2X IO8TCID5tl/头剂量的猪mIFN a重组腺病毒肌肉注射治疗，断奶仔猪可以获得95%以上的保护率。肌肉注射治疗使用时以2X IO8TCID5tl/头为宜。案例二猪mIFNa重组腺病毒对猪II型圆环病毒(PCV2)的治疗30日龄断奶仔猪160头，随机分成I、II组，每组80头。每组中再随机分成4小组，每小组20头，包括样品I和样品2两个试验小组各3个不同剂量组和2个对照组。分别于攻毒后肌肉注射两个样品的猪mIFN a重组腺病毒108TCID5(I、2 X 108TCID5(I、3 X IO8TCID5tl,非治疗对照组注射ImL生理盐水。攻毒后2天开始治疗，肌肉注射猪mIFN a重组腺病毒，每天一次，连续使用三天。连续观察14天。保护率=(AXB-C)/AXB，A为试验组猪，B为对照组发病/死亡比例，C为试验组发病/死亡猪数。表2各组试验猪干扰素注射量(IO8TCID5tl/只)
权利要求
1.一种猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，将猪α干扰素表达基因插入到穿梭载体 pShuttle-CMV 中，制得 pShuttle-CMV-mlFN α ;然后将 pShuttle-CMV-mlFN α 与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAchmIFN α ;再经脂质体转染细胞、包装，获得猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mlFNa。
2.如权利要求I所述的猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，所述的猪α干扰素表达基因序列如SEQ ID NO. I所示。
3.如权利要求I所述的猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒质粒pAd-mlFN α的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.如权利要求I所述的猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，所述的脂质体为脂质体 Lipofectamine2000 或 293Fectin。
5.如权利要求I所述的猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒，其特征在于，所述的细胞为293细胞或AD293细胞。
6.权利要求I所述猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)提取猪的外周血单核淋巴细胞的总RNA，然后利用RT-PCR扩增猪α干扰素成熟蛋白基因，制得核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的基因片段； (2)将步骤(I)制得的基因片段插入穿梭载体pShuttle-CMV中，制得含有猪mIFNa的重组腺病毒穿梭载体pShutt I e-CMV-mIFN a ； (3)将腺病毒骨架载体pAdEasy-1转化至由BJ5183大肠杆菌制备的感受态细胞，制得含pAdEasy-Ι的BJ5183细胞，然后制备含pAdEasy-Ι的BJ5183感受态细胞； (4)将步骤(2)制得的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-mlFNa电转化至由步骤(3)制得的含pAdEasy-Ι的BJ5183感受态细胞，经同源重组后，获得重组腺病毒质粒pAd-mlFNα ； (5)将步骤(4)制得的重组腺病毒质粒pAd-mlFNa经脂质体转染细胞、包装，获得猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mlFNa。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(I)中，RT-PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
8.权利要求I所述猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒在制备猪抗病毒感染药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒及其构建方法与应用，它是将猪α干扰素表达基因插入到穿梭载体pShuttle-CMV中，制得pShuttle-CMV-mIFNα；然后将pShuttle-CMV-mIFNα与腺病毒骨架载体pAdEasy-1发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd-mIFNα；再经脂质体转染细胞、包装，获得猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒rAd-mIFNα。本发明构建的猪α干扰素成熟蛋白重组腺病毒外源蛋白表达稳定，且滴度高而稳定，重组腺病毒的滴度稳定在108.67TCID50/mL，与现有干扰素相比，本发明构建的重组腺病毒滴度提高了10000倍。
文档编号C12N7/01GK102787102SQ201210324020
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者丛晓燕, 任素芳, 吕伟, 吴家强, 孙文博, 宋恩亮, 时建立, 李俊, 杜以军, 王金宝, 郭立辉, 黄保华 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所