一种修饰的重组人内皮抑素及其应用
【专利说明】
[0001] 本申请是分案申请，原申请的申请号为200710131562.X，申请日为2007年9月5 日，发明名称为"一种修饰的重组人内皮抑素及其应用"。
技术领域
[0002] 本发明属于生物制品制药技术领域，涉及一种修饰的重组人内皮抑素及其应用。
【背景技术】
[0003] 1971年，Folkman教授提出"肿瘤的生长依赖于新生血管生成"这一观点，通过阻 断新生血管生成，就有可能控制肿瘤生长，达到遏制肿瘤侵袭、复发、转移的目的，从此开创 了肿瘤治疗的新领域。
[0004] 1997年，哈佛大学0' Reilly等发现小鼠血管内皮瘤细胞的培养基具有内皮细胞 抑制作用，通过纯化发现该活性物质在一定浓度范围内（l〇〇ng/ml~600ng/ml)特异性对 内皮细胞表现出剂量依从的生长抑制作用。通过N端氨基酸测序表明该物质为胶原X VDI的 C末端片段，分子量20kD左右，这个蛋白就被命名为内皮抑素（Endostatin，ES)。
[0005] 研宄表明内皮抑素能够有效控制非小细胞性肺癌、结肠癌、脑胶质瘤、纤维瘤、间 皮瘤及淋巴瘤等各种实体瘤的生长、浸润和转移。目前，内皮抑素的获得都是通过基因工程 的方法。由于真菌表达内皮抑素成本太高，人们更倾向于利用大肠杆菌作为表达体系，但这 样表达出的蛋白存在复性率低等问题。为此，人们开始尝试对天然内皮抑素进行结构改造。 其中罗永章等在天然Endostatin的N末端添加了 9个氨基酸，不仅使ES稳定性提高，半衰 期延长，而且生物活性增加，蛋白的复性率也高于一般生产方法。该药物已正式上市，命名 为恩度（Endostar)。所生产的重组人内皮抑制素由192个氨基酸构成，其氨基酸序列为：
[0006] (M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLY SIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYC ETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其 N 末 端的Met有时会被部分删除。
[0007] III期临床实验表明改造后的内皮抑素与化疗药物NP联用可能有一定的协同作 用，可延长患者的肿瘤进展时间。
[0008] 临床实验证实内皮抑素毒副作用很小，适合与放疗或化疗联用。但是内皮抑素作 为小分子蛋白，性质不稳定，有研宄表明，内皮抑素在缺氧条件下容易降解，当内皮抑素与 内皮细胞在低氧环境下共孵育48小时后，含量会下降20%左右。而肿瘤内部恰是低氧环 境，对于其活性的发挥很不利。另一方面，目前Endostar临床用药量很大，为7. 5mg/m2,需 要每天静脉滴注3~4小时完成给药。实验表明，给药方式为腹腔注射时，内皮抑素在2小 时内清除。这些现象表明，内皮抑素在进入体内后，尤其是在发挥药效的肿瘤局部可能会被 蛋白水解酶水解。如何对蛋白分子进行保护，防止酶解，降低清除率从而减少给药剂量是急 待解决的问题。
[0009] 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)是一种安全的、无活性、无毒的聚合物。通 过共价连接至蛋白质上进行化学修饰，聚乙二醇化（pegylation)在保留天然蛋白质的内 在生物学活性的同时，能有效地克服蛋白质类药物在临床应用中的一些缺点，如可以提高 血浆半衰期，增强生物利用度，减低蛋白质免疫原性、提高药物疗效及安全性等。目前为止， 成功上市的PEG修饰蛋白多肽药物有酰苷脱胺酶(Adagen%)、天冬酰胺酶（Oncaspai^)、干 扰素<3-213(丨平0-丨11如〇1<)、干扰素（1-2&(卩〇835)^1<) /^，而更有尿酸酶、水輕素、白介素-2、白 介素-6等20多种药物正进行临床研宄。
[0010] 在蛋白质PEG化过程中，活化的PEG分子偶联到蛋白分子中的自由氨基上，主要是 Lys上。由于蛋白质链中自由氨基不只一个，反应产物中不仅存在单分子、双分子甚至三分 子等多类修饰产物，而且各类修饰产物中还包括多种异构体。与单分子修饰产物相比，多分 子修饰产物活性损失大，不仅浪费了反应底物，而且降低了反应产物的总体活性。通过控制 反应条件和采用纯化手段可以克服多分子修饰产物的问题，而获得单分子修饰产物。但是 单分子修饰还存在异构体的问题，异构体在生物活性上可能存在较大差异且异构体的混合 物通常很难进行纯化。所以最好的是能通过控制反应条件，实现定点修饰，以帮助产物的纯 化和性质研宄。而且定点修饰对蛋白活性的保持更为有利。Kinstler利用N末端的α氨 基比赖氨酸的氨基有更低的PKa值发明了一种方法。用PEG乙醛修饰粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)得到了 PcgHlgrastimk。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种修饰的重组人内皮抑素 CH3O-(CH2CH2O) ^CH2CH2CH2-NciH-Endostar,使得Endostar在体内的稳定性增强，从而可以提高有效血药浓 度，延长半衰期，降低给药剂量。CH3O-(CH2CH2O)m-CH 2CH2CH2-的重均分子量在20kD~40kD， 优选CH3O- (CH2CH2O) m-CH2CH2CH2-的重均分子量为20kD (以下采用m = 20kD的方式表示）， 另一优选CH3O-(CH2CH2O)m-CH 2CH2CH2-的重均分子量为40kD (以下采用m = 40kD的方式表 示），分散度< 1. 2,优选分散度为I. 1。
[0012] 本发明的另一个目的是提供上述修饰的重组人内皮抑素 CH3O- (CH2CH2O)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar在制备抗肿瘤药中的应用。
[0013] 本发明的目的是通过下列措施实现的：
[0014] 1、Endostar的N-末端化学修饰。反应式为：
[0018] (I)Endostar的来源：本发明中所用的重组人血管内皮抑素是来自江苏先声麦得 津生物制药有限公司。是大肠杆菌表达的N末端带有（Met)GlyGlyXaa HisHisHisHisHis附
[0015]
[0016]
[0017] 加氨基酸序列的Endostatin，其中Xaa代表中性氨基酸或不存在，当由大肠杆菌表达时其N 末端的Met有时会被部分删除，分子量为2IkD。
[0019] (2)本发明中所用的重组人血管内皮抑素和单甲基聚乙二醇衍生物在还原剂氰 基硼氢化钠存在的条件下（终浓度IOmM~30mM)，于0°C~25°C反应IOh~40h，生成 CH3O- (CH2CH2O) ^-CH2CH2CH2-Na H-Endostar。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 本发明提供的修饰的重组人内皮抑素（CH3O-(CH2CH 2O) ^-CH2CH2CH2-Nci H-Endostar)，具有下列优点：
[0022] (1)与 Endostar 相比，CH3O-(CH2CH2O)111-CH 2CH2CH2-NciH-Endostar 的体内有效血药 浓度更高；
[0023] (2)与 Endostar 相比，CH3O-(CH2CH2O)111-CH 2CH2CH2-NciH-Endostar 的抗内皮细胞增 殖活性显著增加；
[0024] (3)与 Endostar 相比，CH3O-(CH2CH2O)111-CH 2CH2CH2-NciH-Endostar 的体内半衰期更 长；
[0025] (4)与 Endostar 相比，CH3O-(CH2CH2O)111-CH 2CH2CH2-NciH-Endostar 的 AUC 更大。
[0026] 上述优点表明，Endostar经修饰后增强了体内稳定性，提高了血药浓度，延长了半 衰期，抗内皮细胞增殖活性显著增加，从而能够减少给药剂量，降低给药频率，减轻病人的 身体上痛苦，同时还能减轻病人的经济负担。该CH3O-(CH2CH2O) m-CH2CH2CH2-NciH-Endostar 可用于制备抗肿瘤药物。
【附图说明】
[0027] 图 1 显示的是 CH3O-(CH2CH2O)2tlkll-CH 2CH2CH (OCH2CH3)2与 Endostar 的偶联。图中 1~4号电泳道分别对应：1、分子量分别为14400,20100,31000,43000,66200,97400的标 准蛋白；2、Endostar ;3、反应混合物；4、CH3O-(CH2CH2O)20kD-CH 2CH2CH(OCH2CH3)2。
[0028] 图 2 显示的是 CH3O-(CH2CH2O)MirCH 2CH2CH2-NciH-