一种从人尿中提取促性腺激素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种化学药物提取工艺，尤其是一种从人尿中提取促性腺激素的方法。
【背景技术】
[0002]促性腺激素(gonadoti^pins)是调节脊椎动物性腺发育，促进性激素生成和分泌的糖蛋白激素。如垂体前叶分泌的尿促性素(HMG)、人胎盘分泌的绒毛膜促性腺激素(HCG，简称绒促性素)、促黄体生长素(LH)等，都被广泛应用于不孕不育的治疗，它们都有相似的结构，分别由α、β两条肽链组成，其中α链的序列是完全一致的。不同蛋白间的差别在β链的序列上，还反映在不同的空间结构和对不同细胞表面受体的结合上。
[0003]尿促性素(HMG)是由绝经期妇女尿液中提取得到的一类生殖激素，主要含有尿促卵泡素(FSH, Follicle-Stimulating Hormone)和促黄体生成素(LH, LuterinizingHormone)组成。尿促卵泡素是由垂体前叶嗜碱性细胞合成、分泌的一类糖蛋白，由α、β两个亚基组成，α有85个氨基酸，β有115个氨基酸，特异性由β亚基组成，分子量约33000。尿促卵泡素的主要生理功能是促进卵泡的各种细胞生长、发育，以利卵母细胞的成熟。尿促卵泡素的作用包括:促进卵泡周围间质细胞分化为内、外两层泡膜细胞并合成促黄体生成素受体；促进卵泡颗粒细胞增生和颗粒细胞内的芳香化酶系统活化，使雄激素转化为雌激素；促进卵泡液分泌，使卵泡细胞逐渐增大。尿促卵泡素主要针对排卵障碍引起的不孕症，并广泛应用于人工授精、试管婴儿等辅助生育技术中。促黄体生长素(LH)对女性能促进卵巢黄体生成，分泌孕激素，对男性有刺激睾丸中的间质细胞的功能，分泌雄激素。
[0004]绒促性素(Human Chor1nic Gonadotrophin, HCG)是从怀孕妇女尿液中提取的精制糖蛋白促性腺激素，是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素。在妊娠早期hCG的浓度迅速增高，检测尿中的hCG即可证实妊娠。临床上用于不孕症、黄体功能不足、功能性子宫出血、隐睾症、男性性腺功能减退症、先兆流产或习惯性流产等。
[0005]目前，尿促卵泡素和绒促性素的提取工艺比较复杂，生产周期长，产品收率不高，导致生产成本大大增加，无法满足市场需求。殷小崴等在公开号为CN101555278A的中国发明专利中公开了《一种尿促卵泡素的提取方法》;赵贵吉等在公开号为CN102311494A的中国发明专利申请中也公开了《一种提取人绒毛膜促性腺素的方法》；该两件专利申请公开的提取工艺，与现有技术相比，具有工艺技术简单、产品收率高等优点，但是也存在着产品杂质含量高、纯度低、效价低等缺点，造成了后续精制过程步骤繁琐。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明的目的在于提供一种可显著地简化工艺、缩短生产时间、降低耗能、提高产品活性、收率、纯度、效价高的一种从人尿中提取促性腺激素的方法。
[0007]为达到上述目的，本发明所提出的技术方案为:一种从人尿中提取促性腺激素的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤I调节pH值析出杂质:用碱调节原料液的pH值至8.0?9.0 ;
步骤2过滤除杂、超滤浓缩:调节pH值后，向原料液中加入硅藻土或高岭土进行过滤，然后将滤液通过截留分子量为8000-15000的超滤膜进行浓缩，得超滤浓缩液；
步骤3离子交换柱层析:超滤浓缩液上CM Sepharose Fast Flow离子交换柱,先以pH4.0-5.0的NaAc进行洗涤，后以含0.3M NaCl的溶液进行洗脱，收集洗脱液；
步骤4沉淀除杂:在搅拌下，先向洗脱液中加入10%乙酸铵，以及有机溶剂使有机溶剂浓度达到50-60%，离心，收集清液；
步骤5沉淀与干燥:向清液中加入有机溶剂，使有机溶剂浓度达到80-85%，搅拌均匀后静置沉淀5-8小时，离心收集沉淀物，有机溶剂洗涤2-3遍，脱水干燥后即可得到促性腺激素粗品。
[0008]进一步，所述的促性腺激素为尿促性素，所述的原料液为绝经期妇女尿液。
[0009]进一步，所述的促性腺激素为绒毛膜促性腺激素，所述的原料液为妊娠期妇女尿液。
[0010]优选的，所述的有机溶剂为乙醇或丙酮。
[0011]优选的，步骤2所述的超滤膜的截留分子量为10000。
[0012]采用上述技术方案，本发明所述的从人尿中提取促性腺激素的方法，具有工艺技术简单，广品收率闻，生广成本低、广品纯度好，效价闻等优点，为后续提取闻纯度广品的生产省去了许多步骤。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
[0014]实施例1，尿促性素的提取，包括如下步骤:
(1)通过采集绝经期妇女尿液1000L，经检验合格后的尿液投入罐内，用碱调节尿液的pH值至8.0?9.0 ;
(2)调节pH值完毕后，向尿液中加入1kg硅藻土，搅拌均匀，用板框进行过滤；
(3)将过滤好的溶液打入超滤罐，通过分子孔径为10000的超滤膜过滤，浓缩液1L打入沉淀te ；
(4)往离子交换层析柱中预装CMSepharose Fast Flow填料后，以2倍柱体积pH 4.5NaAc缓冲液A平衡，将浓缩液上柱后，再以2倍柱体积缓冲液A洗涤，然后用2倍柱体积含
0.3M NaCl的缓冲液B洗脱，收集洗脱液；
(5)在搅拌下，向洗脱液中加入乙醇使浓度达到55%，离心，收集清液；
(6)向清液中加入乙醇，使浓度达到80%，搅拌均匀后静置沉淀5小时，沉淀物用无水乙醇洗涤3遍，脱水干燥后得到尿促性素产品0.65g克。
[0015]使用雌性幼大白鼠卵巢增重法进行生物测定，上述方法生产的尿促性素中，尿促卵泡素生物活性为62.4国际单位/毫克，促黄体生成素为71.5国际单位/毫克。
[0016]实施例2，绒毛膜促性腺激素的提取，包括如下步骤:
(O使用妊娠期妇女尿液原料1000L，将经检验合格后的尿液泵入罐内，用碱调节尿液的pH值至8.0?9.0 ;
(2)调节pH值完毕后，向尿液中加入1kg硅藻土或高岭土，搅拌30分钟至均匀，用板框进行过滤；
(3)将过滤好的溶液泵入超滤罐，通过截留分子量为10000的超滤膜过滤，得到的超滤浓缩液1L打入沉淀罐；
(4)往离子交换层析柱中预装SepharoseFast Flow填料后，以2倍柱体积pH 4.5NaAc缓冲液A平衡，将浓缩液上柱后，再以2倍柱体积缓冲液A洗涤，然后用2倍柱体积含0.3M NaCl的缓冲液B洗脱，收集洗脱液；
(5)在搅拌下，先向洗脱液中加入10%乙酸铵，以及有机溶剂使有机溶剂浓度达到60%，离心，收集清液；
(6)向清液中加入有机溶剂，使有机溶剂浓度达到85%，搅拌均匀后静置沉淀5小时，离心收集沉淀物，有机溶剂洗涤2-3遍，脱水干燥后即可得到绒毛膜促性腺激素4.3克。
[0017]使用雌性幼大白鼠卵巢增重法进行生物测定，上述方法生产的绒毛膜促性腺激素生物活性为2158国际单位/毫克。
[0018]尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种从人尿中提取促性腺激素的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤I调节pH值析出杂质:用碱调节原料液的pH值至8.0?9.0 ; 步骤2过滤除杂、超滤浓缩:调节pH值后，向原料液中加入硅藻土或高岭土进行过滤，然后将滤液通过截留分子量为8000-15000的超滤膜进行浓缩，得超滤浓缩液； 步骤3离子交换柱层析:超滤浓缩液上CM Sepharose Fast Flow离子交换柱,先以pH4.0-5.0的NaAc进行洗涤，后以含0.3M NaCl的溶液进行洗脱，收集洗脱液； 步骤4沉淀除杂:在搅拌下，先向洗脱液中加入10%乙酸铵，以及有机溶剂使有机溶剂浓度达到50-60%，离心，收集清液； 步骤5沉淀与干燥:向清液中加入有机溶剂，使有机溶剂浓度达到80-85%，搅拌均匀后静置沉淀5-8小时，离心收集沉淀物，有机溶剂洗涤2-3遍，脱水干燥后即可得到促性腺激素粗品。2.根据权利要求1所述的一种从人尿中提取促性腺激素的方法，其特征在于，所述的促性腺激素为尿促性素，所述的原料液为绝经期妇女尿液。3.根据权利要求1所述的一种从人尿中提取促性腺激素的方法，其特征在于，所述的促性腺激素为绒毛膜促性腺激素，所述的原料液为妊娠期妇女尿液。4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的一种从人尿中提取促性腺激素的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为乙醇或丙酮。5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的一种从人尿中提取促性腺激素的方法，其特征在于，步骤2所述的超滤膜的截留分子量为10000。
【专利摘要】本发明公开了一种从人尿中提取促性腺激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1.调节pH值析出杂质；步骤2.过滤除杂、超滤浓缩；步骤3.离子交换柱层析；步骤4.沉淀除杂；步骤5.沉淀与干燥，即可得到促性腺激素粗品。本发明所述的从人尿中提取促性腺激素的方法，具有工艺技术简单，产品收率高，生产成本低、产品纯度好，效价高等优点，为后续提取高纯度产品的生产省去了许多步骤。
【IPC分类】C07K14/59, C07K1/18, C07K1/36, C07K1/34
【公开号】CN104961821
【申请号】CN201410362136
【发明人】张样柏
【申请人】厦门欧瑞捷生物科技有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2014年7月28日