专利名称：一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的纯化方法，具体地涉及人绒毛膜促性腺素的纯化方法。
背景技术：
人绒毛膜促性腺素(为简便起见，下文称为HCG)是一种由胎盘产生的激素，一般从孕妇的尿液提取出来。
HCG是一种高分子糖蛋白，由α链和β链两个亚基组成，α链有89～92个氨基酸，分子量14500～18000D；β链有145～147个氨基酸，分子量22200～39000D。两条多肽链分别以共价键与碳水化合物链相结合，碳水化合物链约占HCG全分子量的30％，由甘露糖、半乳糖、岩藻糖和唾液酸等组成。HCG的等电点是pH3.0，为两性化合物。HCG与垂体来源的卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)具有相同的α亚基，其β亚基具有特异性，决定了HCG的生物活性和免疫活性。HCG是一种对维持早期妊娠必需的糖蛋白激素，临床上主要用于治疗由黄体功能不全引起的功能性子宫出血病和习惯性流产，与HMG合用可诱发排卵和治疗不育症。HCG还可用于治疗男性因促性腺素不足性腺机能减退而导致不育的疾病。HCG的另一种重要用途是制备妊娠试剂和放射免疫试剂，用以妊娠检验和绒毛膜癌的诊断。
现有的从孕妇尿液中提取HCG的工艺步骤如下首先从孕妇尿液中用苯甲酸钠或高岭土吸附，制得HCG尿浓缩物。然后进行乙醇抽提，得到HCG原料。接着，再进一步纯化，获得最终的成品。目前一些传统的HCG纯化工艺都使用硅酸铝树脂层析法，工艺过程相对繁琐，并且收率低，从而使生产成本较高，同时产品质量仅能达到药典标准2500IU/mg左右，无法满足国内外市场对高纯度HCG产品的需求。
中国专利CN1302818A提供了另外一种工艺，其中使用了磺酸丙基葡聚糖(SP-Sephadex C-50)离子交换色谱法，收率提高至80％～90％，但其效价仍低于5000IU/mg。
近来，发展出一种用单抗亲和层析色谱法纯化HCG的工艺，虽然能获得较高纯度的HCG，但其收率都很低[母敬郁、吕延成等，单抗亲和层析生产高比活HCG方法的建立.白求恩医科大学学报，1995，21(1)96～98]，且单抗亲和层析柱制造工艺复杂，还可能引入宿主来源的生物性污染，工业化生产受到一定的限制。
综上所述，本领域缺乏一种生物效价高、同时收率高的HCG纯化方法。本领域迫切需要开发此种生物效价高、同时收率高的HCG纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于获得生物效价高、同时收率高的HCG纯化方法。
在本发明的第一方面，提供了一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法，包括下述步骤(a)将含人绒毛膜促性腺素的溶液用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到含人绒毛膜促性腺素的第一纯化产物；(b)将步骤(a)得到的第一纯化产物用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到纯化的人绒毛膜促性腺素。
在本发明的纯化方法的一个优选例中，步骤(a)中用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，包括(i)磺酸丙基琼脂糖离子交换树脂平衡步骤；(ii)上样步骤；(iii)洗脱步骤。较佳地，其中所述的步骤(i)和步骤(ii)在pH4～6的缓冲液中进行。所述(iii)洗脱步骤是在0.1～0.8M盐浓度的缓冲液中进行的。
在另一优选例中，步骤(a)中用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化的条件如下磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法的平衡液pH优选在5.0～5.5之间；电导不超过10ms。上样浓度优选在80～110g蛋白/L。洗脱优选在0.3～0.4M盐浓度的缓冲液中进行在本发明的纯化方法的另一个优选例中，步骤(b)中用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，包括(i’)二乙基季胺琼脂糖离子交换树脂平衡步骤；(ii’)上样步骤；(iii’)洗脱步骤。较佳地，其中所述的步骤(i’)和步骤(ii’)在pH6～9的缓冲液中进行。所述(iii’)洗脱步骤是在0.1～0.4M浓度的缓冲液中进行的。
在另一优选例中，步骤(b)中用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化的条件如下平衡及上样优选在7～8之间的缓冲液中进行的；电导不超过0.05ms。上样浓度优选在20～30g蛋白/L。洗脱优选在0.2～0.3M盐浓度的缓冲液中进行。
在本发明的纯化方法的另一个优选例中，步骤(a)或步骤(b)中所述离子交换色谱法的洗脱步骤采用线性梯度法或逐步阶段法进行洗脱。
在本发明的纯化方法的另一个优选例中，步骤(a)或步骤(b)中所述离子交换色谱法的洗脱步骤中，采用的洗脱用含盐缓冲液的盐包括氯化物、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐或其组合，其中所述盐类的阳离子包括Na+、K+、NH4+。
本发明的另一个方面提供人绒毛膜促性腺素，可用以下纯化方法得到，包括下述步骤(a)将含人绒毛膜促性腺素的溶液用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到含人绒毛膜促性腺素的第一纯化产物；(b)将步骤(a)得到的第一纯化产物用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到纯化的人绒毛膜促性腺素。
所述的人绒毛膜促性腺素的生物效价不低于6000IU/mg，总收率不低于90％。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过改进制备工艺，发现通过选用合适的树脂以及优化分离条件，经过联合使用离子交换色谱法可以获得高纯度的HCG，并能保证很高的收率。通过本发明的纯化方法生产的HCG，其生物效价大于6000IU/mg，总收率在90％以上。
含人绒毛膜促性腺激素(HCG)的溶液本发明的含人绒毛膜促性腺素的溶液浓度优选在50～120g蛋白/L。其制备方法按本领域常见技术而制得。例如由下述方法制得1.将孕妇尿浓缩物经过乙醇抽提制成HCG原料；2.HCG原料配成溶液。含有HCG的溶液接着进行后续纯化反应。
所述孕妇尿浓缩物按本领域常规技术而制得。例如，收集怀孕2～6月的健康妇女尿，验收合格后，以100L尿液加2.2公斤计加入苯甲酸钠，搅拌溶解后，用稀HCl调节pH4～5，静置沉淀过夜。次日虹吸弃去上层废尿，过滤收集沉淀。按每公斤沉淀加10升计加入95％乙醇，搅拌1小时，过滤收集沉淀，沉淀干燥后即得尿浓缩物。其生物效价在7～12IU/mg左右。
所述HCG原料按本领域常规技术而制得。例如，上述孕妇尿浓缩物用抽提液提取，抽提液的配方一般是0.01M CaCl2+0.04M NaAc+0.25M NaCl+50％乙醇，pH4.5～5.5。按每公斤尿浓缩物加20L计加入抽提液，6～8℃搅拌2小时，离心收集上清，上清加入3倍体积的95％乙醇，收集沉淀，真空干燥得HCG原料。
人绒毛膜促性腺素是一种由胎盘产生的激素，一般从孕妇的尿液提取出来。HCG是一种高分子糖蛋白，由α链和β链两个亚基组成，α链有89～92个氨基酸，分子量14500～18000D；β链有145～147个氨基酸，分子量22200～39000D。两条多肽链分别以共价键与碳水化合物链相结合，碳水化合物链约占HCG全分子量的30％，由甘露糖、半乳糖、岩藻糖和唾液酸等组成。HCG的等电点是pH3.0，为两性化合物。HCG与垂体来源的卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)具有相同的α亚基，其β亚基具有特异性，决定了HCG的生物活性和免疫活性。
本发明的方法也可以用于从垂体中纯化人绒毛膜促性腺素，或从重组后得到的细胞培养基中纯化重组人绒毛膜促性腺素。本发明的纯化方法还可以纯化其它哺乳动物的绒毛膜促性腺素，例如牛、马、猪、羊和猴。
纯化方法本发明的人绒毛膜促性腺素的纯化方法包括下述步骤(a)将含人绒毛膜促性腺素的溶液用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到含人绒毛膜促性腺素的第一纯化产物；(b)将步骤(a)得到的第一纯化产物用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到纯化的人绒毛膜促性腺素。
上述步骤中，可以先进行步骤(a)接着进行步骤(b)，也可以先进行步骤(b)，再进行步骤(a)。
磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法纯化步骤本发明的磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法纯化步骤可去除大部分杂蛋白。
在本发明的优选实例中，用磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法纯化时，包括(i)磺酸丙基琼脂糖离子交换树脂平衡步骤；(ii)上样步骤；(iii)洗脱步骤。
磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法的平衡液pH优选在4～6，更优选在5.0～5.5之间；电导不超过10ms。
上样液的pH、电导调整到与平衡液一致，优选在pH4～6的缓冲液中进行，上样浓度优选在50～120g蛋白/L。上样结束后用平衡液洗涤，洗涤体积优选在5～15个柱体积，能使大量杂蛋白流出。
洗脱优选0.1～0.8M盐浓度的缓冲液中进行的。所述洗脱用含盐缓冲液的盐包括氯化物、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐或其组合，其中所述盐类的阳离子为Na+、K+、NH4+。洗脱步骤可以用线性梯度法洗脱，也可以用逐步阶段法洗脱。用逐步阶段法洗脱的盐浓度更优选在0.2～0.5M，特别优选在0.3～0.4M。
收集含有HCG的馏分，加乙醇沉淀。收集沉淀，真空干燥。
在另一优选例中，步骤(a)中用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化的条件如下磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法的平衡液pH优选在5.0～5.5之间；电导不超过10ms。上样浓度优选在80～110g蛋白/L。洗脱优选在0.3～0.4M盐浓度的缓冲液中进行。
二乙基季胺(Q)琼脂糖离子交换色谱法纯化步骤在本发明的优选实例中，用二乙基季胺(Q)琼脂糖离子交换色谱法纯化时，包括(i)二乙基季胺(Q)琼脂糖离子交换树脂平衡步骤；(ii)上样步骤；(iii)洗脱步骤。
平衡是在pH6～9的缓冲液中进行的，更优选在7～8之间；电导不超过0.05ms。上样液的pH、电导调整到与平衡液一致，上样浓度优选在20～50g/L。上样结束后用平衡液洗涤，洗涤体积优选在5～15个柱体积。
洗脱是在含0.1～0.4M盐浓度的缓冲液中进行的。所述洗脱用含盐缓冲液的盐包括氯化物、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐或其组合，其中所述盐类的阳离子为Na+、K+、NH4+。洗脱步骤可以用线性梯度法洗脱，也可以用逐步阶段法洗脱。用逐步阶段法洗脱的盐浓度优选在0.1～0.4M，更优选在0.2～0.3M。
收集含有HCG的馏分，加乙醇沉淀，收集沉淀，真空干燥；也可以通过超滤脱盐后进行冷冻干燥。经过以上步骤即得到HCG纯化产物。
在另一优选例中，步骤(b)中用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化的条件如下平衡及上样优选在7～8之间的缓冲液中进行的；电导不超过0.05ms。上样浓度优选在20～30g/L。洗脱优选在0.2～0.3M盐浓度的缓冲液中进行。
本发明制得的绒毛膜促性腺素，生物效价不低于6000IU/mg，总收率不低于90％。
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
实施例1取HCG尿浓缩物(测生物效价为8.1IU/mg)2500克，总效价为0.202亿IU。将其加入到8℃的50L抽提液(0.01M CaCl2+0.04M NaAc+0.25M NaCl+50％乙醇，pH5.0)中，搅拌2小时，离心收集上清，上清加入150L 95％乙醇，沉淀过夜。次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得77.3克HCG原料。
将上述77.3克HCG原料加至700mL平衡液(0.03M磷酸二氢钠，pH5.2)中，搅拌40分钟，离心取上清。上清液以12cm/h的流速通过直径为8cm、高度为12cm的SP-Sepharose FF(Amersham提供)层析柱，此柱事先已用相同的平衡液平衡好。上样结束后，用6升平衡液洗涤，流速12cm/h。然后用平衡液和洗脱液(0.03M磷酸二氢钠+1M NaCl，pH5.2)进行线性梯度洗脱，流速12cm/h，用紫外检测器监测280nm处，分布收集各馏出峰，检测其HCG免疫效价，合并有效成份约0.4L，加入1.6升-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到4.30克干品。
将上述4.30克干品，溶于150mL平衡液(0.01M磷酸二氢钠，pH7.0)中，以8cm/h的流速通过直径为8cm、高度为8cm的Q-Sepharose FF(Amersham提供)层析柱，此柱事先已用相同的平衡液平衡好。上样结束后，用4升平衡液洗涤，流速8cm/h。然后用洗脱液(0.01M磷酸二氢钠+0.2M NaCl，pH7.0)进行洗脱，流速8cm/h，用紫外检测器监测280nm处，收集体积约0.4L，加入2.0升-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到2.61克HCG纯化产物。测生物效价为7316IU/mg，总效价为0.191亿IU，总收率为94.6％。生物效价的测定方法按中国药典2005版附录XIIE检验。
实施例2取与实施例1相同的HCG尿浓缩物(生物效价为8.1IU/mg)25.0千克，总效价为2.02亿IU。将其加入到8℃的500L抽提液(0.01M CaCl2+0.04MNaAc+0.25M NaCl+50％乙醇，pH5.0)中，搅拌2小时，离心收集上清，上清加入1500L 95％乙醇，沉淀过夜。次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得826克HCG原料。
将上述826克HCG原料加至9L平衡液(0.03M磷酸二氢钠，pH5.2)中，搅拌40分钟，离心取上清。上清液以24cm/h的流速通过直径为18cm、高度为24cm的SP-Sepharose FF(Amersham提供)层析柱，此柱已先用相同的平衡液平衡好。上样结束后，用50升平衡液洗涤，流速24cm/h。然后用洗脱液(0.03M磷酸二氢钠+0.4M NaCl，pH5.2)进行洗脱，流速24cm/h，用紫外检测器监测280nm处，收集体积约4.3L，加入18升-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到45.5克干品。测生物效价4351IU/mg。
将上述45.5克干品，溶于2L平衡液(0.01M磷酸二氢钠，pH7.0)中，以16cm/h的流速通过直径为18cm、高度为16cm的Q-Sepharose FF(Amersham提供)层析柱，此柱事先已用相同的平衡液平衡好。上样结束后，用40升平衡液洗涤，流速16cm/h。然后用洗脱液(0.01M磷酸二氢钠+0.2M NaCl，pH7.0)进行洗脱，流速16cm/h，用紫外检测器监测280nm处，收集体积约4.5L，加入23升-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到29.8克HCG纯化产物。测生物效价为6539IU/mg，总效价为1.95亿IU，总收率为96.5％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法，其特征在于，包括下述步骤(a)将含人绒毛膜促性腺素的溶液用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到含人绒毛膜促性腺素的第一纯化产物；(b)将步骤(a)得到的第一纯化产物用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，得到纯化的人绒毛膜促性腺素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)中用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，包括(i)磺酸丙基琼脂糖离子交换树脂平衡步骤；(ii)上样步骤；(iii)洗脱步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于其中所述的步骤(i)和步骤(ii)在pH4～6的缓冲液中进行，和/或所述(iii)洗脱步骤是在0.1～0.8M盐浓度的缓冲液中进行的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)中用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，包括(i’)二乙基季胺琼脂糖离子交换树脂平衡步骤；(ii’)上样步骤；(iii’)洗脱步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于其中所述的步骤(i’)和步骤(ii’)在pH6～9的缓冲液中进行，和/或所述(iii’)洗脱步骤是在0.1～0.4M浓度的缓冲液中进行的。
6.如权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述离子交换色谱法的洗脱步骤采用线性梯度法或逐步阶段法进行洗脱。
7.如权利要求2或4所述的方法，其特征在于步骤(a)或步骤(b)中所述离子交换色谱法的洗脱步骤中，采用的洗脱用含盐缓冲液的盐包括氯化物、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐或其组合，其中所述盐类的阳离子为Na+、K+、NH4+。
8.一种用权利要求1所述的纯化方法制备的人绒毛膜促性腺素。
9.如权利要求8所述的人绒毛膜促性腺素，其特征在于，所述的人绒毛膜促性腺素的生物效价不低于6000IU/mg，总收率不低于90％。
全文摘要
本发明提供一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法，包括下述步骤用磺酸丙基琼脂糖离子交换色谱法进行纯化，以及用二乙基季胺琼脂糖离子交换色谱法进行纯化。本发明的纯化方法所制得的产品生物效价高、同时收率高。
文档编号C07K14/59GK1958603SQ20051011003
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者季斌, 金灿煌, 庞骏, 谢莽, 郭照晔 申请人:上海天伟生物制药有限公司