Endostar 的纯化层析图。
[0029] 图 3 显示的是纯化后 CH3O- (CH2CH2O) Wkll-CH2CH2CH2-NciH-Endostar 的 SDS-PAGE 鉴定。图中1~4号电泳道分别对应：1、纯化后的CH3O- (CH2CH2O) 2QkD-CH2CH2CH2-N ° H-End ostar ;2、反应混合物；3、CH3O-(CH2CH2O)2tlkirCH 2CH2CH(OCH2CH3) 2;4、分子量分别为 14400， 20100, 31000,43000,66200,97400 的标准蛋白。
[0030] 图 4 显示的 CH3O- (CH2CH2O) _-CH2CH2CH0 与 Endostar 的偶联。图中 1 ~5 号电泳 道分别对应~4、反应混合物；5、CH3O-(CH2CH2O) 4_-CH2CH2CH0。
[0031] 图 5 显示的是 CH3O-(CH2CH2O)^d-CH 2CH2CH2-NciH-Endostar 的纯化层析图。
[0032] 图 6 显示的是纯化后 CH3O- (CH2CH2O) ^d-CH2CH2CH2-NciH-Endostar 的 SDS-PAGE 鉴 定。图中1~3号电泳道分别对应：1~2、纯化后的CH3O-(CH2CH2O) 4tlkirCH2CH2CH2-NciH-End ostar ;3、分子量分别为 14400, 20100, 31000,43000,66200,97400 的标准蛋白。
[0033] 图7显示的是Endostar修饰前后的血药浓度和时间的关系曲线。
[0034] 图8显示的是Endostar修饰前后抗内皮细胞增殖活性。
【具体实施方式】
[0035] 以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但不是对本发明保护范围的限制。
[0036] 实施例 1、重均分子量为 20kd 的 CH3O-(CH2CH2O)2tlkll-CH 2CH2CH(OCH2CH3)2和 Endostar的偶联物（简写为PEG2tl-ENDO)的制备：
[0037] (I) CH3O- (CH2CH2O) 2_-CH2CH2CH(OCH2CH3) 2与 Endostar 的偶联
[0038] 20ml Endostar 原液（PH5. 0 ~5. 5，HAC/NaAC Buffer，蛋白质含量为 5mg/ml)，加 入还原剂氰基硼氢化钠 NaCNBH3至终浓度为20mM，加入单甲氧基聚乙二醇-3, 3-二乙氧基 丙烷lOOmg，使其与Endostar的摩尔比为1 :1，在4°C搅拌过夜，即形成PEG2q-ENDO修饰物， 产物用SDS-PAGE鉴定，鉴定结果见图1。
[0039] (2) PEG2tl-ENDO 的纯化
[0040] 上述反应产物用CM - S印harose柱，AKTA层析仪分离、纯化。样品以20mM，pH7. 0 的PB缓冲液稀释后上样，以20mM，pH7. 0的PB缓冲液平衡至基线，再分别以含0. 1M、0. 2M、 0. 5M NaCl的20mM，pH7. 0的PB缓冲液阶段洗脱（图2)，分部收集器收集，修饰产物用 SDS-PAGE 鉴定。（图 3)
[0041] 实施例 2、重均分子量为 40kd 的 CH3O-(CH2CH2O)4tlkirCH 2CH2CHO 和 Endostar 的偶联 物（简写为PEG4ci-ENDO)的制备：
[0042] (I) CH3O- (CH2CH2O) 4_-CH2CH2CH0 与 Endostar 的偶联
[0043] 20ml Endostar 原液（PH5. 0 ~5. 5，HAC/NaAC Buffer，蛋白质含量为 5mg/ml)，加 入还原剂氰基硼氢化钠 NaCNBH3至终浓度为20mM，加入单甲氧基聚乙二醇-3, 3-二乙氧基 丙烷400mg，使其与Endostar的摩尔比为1 :2,在4°C搅拌过夜，即形成PEG4ci-ENDO修饰物， 产物用SDS-PAGE鉴定。（图4)
[0044] (2) PEG4tl-ENDO 的纯化
[0045] 上述反应产物用CM - Sepharose柱，AKTA层析仪分离、纯化。样品以20mM，pH7. 0 的PB缓冲液稀释后上样，以20mM，pH7. 0的PB缓冲液平衡至基线，再分别以含0~0. 5M NaCl的20mM，pH7. 0的PB缓冲液梯度洗脱（图5)，分部收集器收集，修饰产物用SDS-PAGE 鉴定。（图6)
[0046] 实施例3、聚乙二醇修饰的重组人内皮抑素的药代动力学研宄
[0047] 将15只雄性SD大鼠随机分成3组，按4. 5mg/kg体重给药。A组为未修饰的 Endostar，B 组为 PEG2(i-END0, C 组为 PEG4(l-END0。给药后 5min、lOmin、15min、30min、lh、4h、 6h、12h、24h、48h、96h取血，肝素抗凝，血样立即6000r/min，离心10min，得到血衆样品。采 用Human Endostatin Protein Accucytc? EIA试剂盒测定血衆中样品的含量。经测定修饰 后内皮抑素有效血药浓度提高20倍以上（图7)，Endostar的半衰期为8小时，PEG2ci-ENDO 的体内半衰期为18h，PEG4ci-ENDO的体内半衰期为97h。与Endostar相比，PEG2ci-ENDO的AUC 提高至少10倍，PEG4ci-ENDO的AUC提高至少100倍。
[0048] (Endostar 的 AUCchoo = 1065. 46 μ g/L*h ;PEG2(i-END0 的 AUCchoo = 1133103. 46 μ g/ L*h ;PEG4(l-END0 的 AUCchoo = 19759375. 66 μ g/L*h)
[0049] 实施例4、聚乙二醇修饰的恩度的生物活性测定
[0050] 1、将牛主动脉内皮细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，置37°C、5% 〇)2培养箱中，选对数生长期的细胞用于实验。
[0051] 2、调细胞浓度（10000个/ml)后分10组接种于96孔板上，每组设5个复孔， 置37°C、5% CO2培养箱培养24h待细胞贴壁后，分别加入终浓度为100 μ g/ml、25 μ g/ml、 6· 25 μ g/ml、l. 56 μ g/ml、0. 39 μ g/ml 的 Endostar、PEG2(l-ENDO 和 PEG4(l-END0。对照组加含 2% FCS的1640培养基和加2% FCS+bFGF的1640培养基，最后四周孔用含2% FCS的1640 培养基封闭。
[0052] 3、以MTT法测定每孔的OD值。根据OD值求出细胞抑制率，计算公式为抑制率（IR) =(对照组OD值均数-实验组OD值均数）/对照组OD值均数。
[0053] 4、PEG2q-ENDO和PEG4q-ENDO的抗内皮细胞增殖活性有显著提高，PEG 2ci-ENDO活性 提尚更多（图8)。
【主权项】
1. 一种修饰的重组人内皮抑制素，其特征在于其结构为： CH3O- (CH2CH2O) ,CH2CH2CH2-Nci H-Endostar， 其中 CH3O-(CH2CH2O)ni-CH 2CH2CH2-的重均分子量为 20kD 或 40kD。2. 权利要求1所述的修饰的重组人内皮抑制素在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本申请是200710131562.X的分案申请，属于生物制品制药技术领域，公开了一种修饰的重组人内皮抑素及其应用。该修饰的重组人内皮抑制素结构为：CH3O-(CH2CH2O)m-CH2CH2CH2-NαH-Endostar，中CH3O-(CH2CH2O)m-CH2CH2CH2-的重均分子量为20kD或40kD。该修饰的重组人内皮抑制素增强了体内稳定性，提高了血药浓度，延长了半衰期，抗内皮细胞增殖活性显著增加，从而能够减少给药剂量，降低给药频率，减轻病人身体痛苦及经济负担。该修饰的重组人内皮抑制素可用于制备抗肿瘤药物。
【IPC分类】A61K47/48, A61K38/39, C07K17/08, A61P35/00
【公开号】CN104961831
【申请号】CN201510333514
【发明人】姚文兵, 田浤, 许向阳, 李海瑞, 童玥, 高向东
【申请人】江苏先声药物研究有限公司, 中国药科大学, 山东先声麦得津生物制药有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2007年9月5日
【公告号】CN101381413A, EP2196477A1, EP2196477A4, EP2196477B1, US8802824, US20100210822, WO2009033406A1