农用化学品的特异性输送的制作方法

农用化学品的特异性输送的制作方法
【专利说明】农用化学品的特异性输送
[0001] 本发明是申请日为2011年4月6日，申请号为201180027994. 0,标题为"农用化 学品的特异性输送"的专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及向植物特异性输送农用化学品。更具体来说，它涉及基本上由靶向剂 和农用化学品或农用化学品的组合组成的组合物，所述靶向剂包含至少一个可特异地与完 整活植物上的结合位点结合的结合结构域。本发明还涉及特异地与所述完整活植物上的 结合位点结合的结合结构域。更具体来说，涉及结合结构域，其含有包含4个框架区和3 个互补决定区或其任何合适的片段的氨基酸序列，其中所述结合结构域能够使载体结合或 保留在植物上。在一个优选的实施方案中，本发明涉及结合结构域，其特异地结合表皮毛 (trichome)、气孔、角质层（cuticle)、皮孔、棘（thorn)、刺（spine)、根毛或赌质层。本发明 还涉及用于向植物输送农用化学品的方法，其用于改善农用化学品在植物上的沉积，并用 于使所述农用化学品保留在植物上（其使用包含所述结合结构域的靶向剂），和涉及使用 同样的化学品保护植物免受生物和非生物胁迫或控制植物生长的方法。本发明还涉及用于 制造特异性靶向的农用化学品载体的方法。
[0003] 许多年来，园艺家和农学家已通过大田喷施将化学品应用于杂草防治、植物保护 和植物生长调节。对需要应用于植物（例如叶）的组合物来说，仅小部分组合物结合并保 留在其可发挥生物学活性的植物部分上，而大量组合物没有附着于植物表面，并通过滴落 或被雨水冲走而损失。除了引起化学品的效力降低，由于在喷施时从植物滴落至土壤中或 由于降雨过程中的冲刷引起的化学品损失可能导致地下水污染、环境破坏、生物多样性丧 失以及人和动物的健康后果。
[0004] 若干研宄者已尝试通过向植物应用可粘着于叶并在一段时间内释放它们的内容 物的缓释颗粒来解决此问题。US 6180141描述了可用于输送植物保护活性成分的复合凝胶 微粒。WO 2005102045描述了包含至少一种植物活性化合物和包囊化佐剂的组合物，其中所 述佐剂包含真菌细胞或其片段。US 20070280981描述了载体颗粒，其表面包被有亲脂性增 粘剂，由此载体颗粒附着于植物、禾本草和杂草表面。
[0005] 这些旨在输送农用化学品的微粒的特征在于，它们通过非常弱的、非特异的相互 作用，例如亲脂性相互作用粘着于植物。尽管其与正常喷施相比具有优势，这样的输送方法 的效力仍然是有限的，并且所述颗粒可能非最优地分布于叶，或在化合物的释放完成之前 就在自然多变的气候条件下被冲走。为了微粒的特异性分布和保留效率，需要特异的、强烈 的结合分子，其可保证载体粘着于植物直至其内容物完全输送。
[0006] 纤维素结合结构域（CBD)已被描述为对将分子物质连接于纤维素有用的试剂（US 5738984和US 6124117)。事实上，由于棉花的90%由纤维素组成，已证明CBD对将所谓 的"效益剂（benefit agent)"输送至棉花组织（cotton fabrics)上是有用的，如在WO 9800500中所公开，其中使用直接融合的CBD和酶以利用CBD的亲和力来与棉花组织结合。 WO 03031477要求了相似的多功能融合蛋白用于传输包囊化的效益剂的用途的权利，其中 所述多功能融合蛋白质由第一结合结构域（其为碳水化合物结合结构域）和第二结合结构 域组成，其中第一结合结构域或第二结合结构域可与微粒结合。WO 03031477示例性地使用 了双功能融合蛋白，其由CBD和结合微粒的抗RR6抗体片段组成，其中复合物沉积于棉花表 面（cotton treads)或李氏禾（cut grass)上。然而，这样的多功能融合蛋白用于输送包 囊化的效益剂的用途具有许多严重的缺陷：第一，尽管纤维素是植物细胞壁的主要组分，植 物所有物质的约33%由纤维素组成，在完整活植物中，由角质和蜡质形成的植物角质层使 纤维素避开外部环境，所述角质层是不透水屏障，植物细胞壁由其覆盖，使得纤维素几乎不 可接受CBD的结合。第二，包囊化的效益剂对植物的有效输送需要第一结合结构域与植物 和第二结合结构域与微粒同时结合。由于两个结合事件发生的可能性是由结合结构域和它 们的靶分子的摩尔浓度以及结合复合物的摩尔浓度之间微妙的平衡所决定的，在溶液中几 乎不太可能存在足够使这样的同时结合成为可能的多功能融合蛋白。此外，结合事件的平 衡强烈地受到环境参数例如温度和PH的影响，其对每个结合结构域的最优条件可能极为 不同。因此，两个这样的多功能融合蛋白的结合结构域这样的同时结合几乎不太可能导致 可将包囊化的效益剂保留于植物上的足够强的结合。第三，尽管CBD某种程度上特异地与 纤维素结合，仍可将使用多功能融合蛋白（其中的CBD应可与植物结合）视为通用结合方 法（因为所有的植物都含有纤维素），其因此与非特异地粘着的增粘剂和粘着剂是相似的。 靶向方法具有相当高的价值，其中结合结构域的特异性结合将允许在与一种植物物种结合 和与另一种结合之间区分。WO 03031477还表明（没有进一步的示例），碳水化合物或多糖 的其它结合子可用于产生可将微粒沉积于活生物体上的融合蛋白。然而，WO 03031477中 既没有公开除了 CBD之外的结合结构域，也没有公开与完整活植物结合的结合结构域。
[0007] 因其对特定靶的特异性和高亲和力而众所周知的分子为抗体。可产生针对广泛 不同的靶的抗体，并且已描述了为研宄植物细胞壁结构和动力学而产生的抗体，其可特异 地与特定的植物成分，主要是植物细胞壁成分结合（Penell等人，1989 Jones等人，1997 ; Willats等人，1998 ;Willats和Knox，1999 ;Willats等人，2001)。然而，并不清楚产生的所 述抗体所针对的任何植物细胞壁成分是否可直接接近来自外部环境的抗体。此外，抗体受 其作为适应性免疫系统的组分的性质限制，它们在生理条件下它们的靶结合，其包括严格 调节的PH、温度和血液正常渗透压范围。如果考虑将抗体用于靶向输送农用化学品，所述抗 体不应只能够在农用化学品制剂中与其在完整活植物上的靶结合，其中生理生化特征基本 偏离了生理条件，它们还应该能够足够强地结合以将载体保留在植物上。对任何早先描述 的植物结合抗体，已表明不具备这两个关键特征中的任何一个。
[0008] 重链骆驼抗体的可变结构域（VHH)是特别有趣的抗体片段类型，因为他们是很小 的15kDa的单链蛋白质，其由于对其靶显示出高度亲和力可被选择。另外，作为小单链分子 的性质，VHH是易于生产的并具有超过常规抗体的优越的稳定性特征。然而，目前没有描述 结合植物的VHH。另外，尽管已显示共价连接到固体树脂颗粒的VHH可保持它们能够从溶液 中捕获抗原的功能（W0 0144301)，仍然没有显示或不可预期VHH对其靶的亲和力足够将载 体保留在固体植物表面上。
[0009] 仍存在对特异性输送农用化学品的方法的未满足的需要，其中农用化学品被输送 或沉积至完整活植物上的作用位点上或附近，其利用可特异地并强烈地与完整活植物结合 并能够将农用化学品或包含所述农用化学品的载体保留在植物上的结合结构域。
[0010] 我们分离了结合结构域，更具体地为含有包含4个框架区（FR)和3个互补决定 区（CDR)(根据Kabat定义FR和CDR)的氨基酸序列的结合结构域，其中所述结合结构域能 够与完整活植物上的结合位点结合，并且令人吃惊的是，通过这样做能够将农用化学品或 包含农用化学品的载体保留在所述植物上。优选地，所述结合结构域在恶劣的条件下（例 如不同的温度、PH、盐浓度、水或水分的可用性）保持稳定并保留其结合能力；更优选地，所 述结合结构域在农用化学品制剂中保持稳定并保留其结合能力。包含4个FR和3个CDR 的结合结构域（优选以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序）是本领域技术人员已 知的，并且已在Wesolowski等人（2009)中作为非限制性的实例被描述。优选地，所述结 合结构域衍生自骆驼抗体，优选来自无轻链的重链骆驼抗体，例如骆驼抗体重链的可变结 构域（VHH)。包含这些结合结构域的靶向剂可将农用化学品保留在植物或植物部分的特异 结合位点上，并可用于向植物，优选向整个活植物输送和保留农用化学品，其中包含于这样 的靶向剂中的结合结构域特异地与植物上的结合位点结合，在那里农用化学品可发挥其活 性。农用化学品组合物包含至少一种靶向剂和农用化学品，优选结合于载体上或包含于载 体中，其可适于允许使用减少剂量的农用化学品和/或减少施用农用化学品的频率，所述 农用化学品在保持其总体效力的同时包含于这样的组合物中。另外，当包含于本发明的组 合物中时，农用化学品可在一段较长的时间里发挥其活性，最终导致更少的农用化学品损 失和环境污染；还有，通过应用本发明的组合物中的农用化学品，向农用化学品活性中引入 原本不存在的特异性是可能的。
[0011] 本发明的第一方面是结合结构域，其能够与完整活植物上的至少一个结合位点结 合。
[0012] 如本文所用，"完整活植物"意指正在生长的植物，不论其是否生长于土壤中、水中 或人工基质中，并且不论其是否生长于田间、温室、庭院、花园、花盆或水耕栽培系统中。完 整活植物优选包括所有正常天然存在于这样的植物上的植物部分（根、茎、枝、叶、针叶、茎 刺、花、种子 ），尽管一些植物部分，例如花，可在植物生命循环的某些时期缺失。完整 活植物不包括从植物移除的植物部分，例如从植物切下并分离的叶和花。然而，应清楚，完 整活植物包括被正常自然事件损伤的植物，例如被天气（例如但不限于，风、雨或冰雹）、动 物（不论是食用所述植物的动物或踩踏到所述植物的动物）、植物病虫害（例如但不限于昆 虫、线虫和真菌）损伤或由农业实践引起的损伤，例如但不限于，修剪、收获果实或收获花。 植物包括裸子植物和被子植物，单子叶植物和双子叶植物，树，果树，田间和蔬菜作物以及 观赏物种。作为非限制性的实例，所述植物可为雪松、柏树、杉树、桧柏、落叶松、松树、红杉、 云杉、红豆杉、银杏、油棕榈、橡胶树、橡树、山毛榉、玉米、棉花、大豆、小麦、稻、大麦、黑麦、 高粱、粟、油菜、蚕豆、豌豆、花生、向日葵、马铃薯、番前、甜菜、甘鹿、木薯、烟草、香蕉、苹果， 橘子、柠檬、橄榄、菠萝、油梨、葡萄、莴苣、甘蓝、胡萝卜、茄子、辣椒、甜瓜、玫瑰、百合、菊花、 禾本草样杂草或阔叶杂草。
[0013] 如本文所用，"结合位点"意指分子结构或化合物，例如蛋白质、（多）肽、（多）糖、 糖蛋白、脂蛋白、脂肪酸、脂质或核酸，或这样的分子结构或化合物上的特定区域，或这样的 分子结构或化合物的特定构象，或这样的结构或化合物的组合或复合物。优选地，所述结合 位点包括至少一个抗原。如本文所用，"抗原"意指能够在动物中诱导免疫应答的分子。优 选地，所述结合位点包含于植物结构例如表皮毛、气孔、皮孔、棘、刺、根毛、角质层或蜡质层 中。甚至更优选地，所述结合位点包含于植物结构例如表皮毛、气孔或角质层中。所述结合 位点对一种特定植物结构可为唯一的，或它可更普遍地包含于多于一种植物结构中。优选 地，所述结合位点存在于特定植物部分，例如叶、茎、根、果实、球果、花、球茎或块茎。甚至更 优选地，所述结合位点存在于这样的特定植物部分的表面，意指结合位点存在于例如叶表 面、茎表面、根表面、果实表面、球果表面、花表面、球茎表面或块茎表面。所述结合位点对一 种特定植物部分可为唯一的，或它可更普遍地存在于多于一种植物部分上。
[0014] 如本文所用，"结合结构域"意指蛋白质性质的分子（蛋白质、蛋白质样或含蛋白 质）的整体或部分，其能够使用特异的分子间相互作用与靶分子结合。结合结构域可为天 然存在的分子例如纤维连接蛋白，它可衍生自天然存在的分子例如来自先天性或适应性免 疫系统的组分，或它可为完全人工设计的。结合结构域可为基于免疫球蛋白的，或它可为基 于存在于蛋白质中的结构域的，所述蛋白质包括但不限于，微生物蛋白质、蛋白酶抑制剂、 毒素、纤维连接蛋白、脂质运载蛋白、单链反平行卷曲螺旋蛋白或重复基序蛋白。这样的结 合结构域的非限制性的实例为，碳水化合物结合结构域（CBD) (Blake等人，2006)、重链抗 体（hcAb)、单结构域抗体（sdAb)、微抗体（minibody) (Tramontane)等人，1994)、重链骆马它 抗体的可变结构域（VHH)、新抗原受体的可变结构域（VNAR)、亲和体（affibody) (Nygren 等人，2008)、阿尔法体（alphabody) (W0 2010066740)、设计的锚蛋白重复结构域（DARPin) (Stumpp 等人，2008)、抗转运蛋白（anticalin) (Skerra 等人，2008)、打结素（knottin) (Kolmar等人，2008)和工程化的CH2结构域（纳米抗体；Dimitrov，2009)。优选地，所述 结合结构域由单一多肽链组成并且是未经翻译后修饰的。更优选地，所述结合结构域不是 CBD。甚至更优选地，所述结合结构域衍生自先天性或适应性免疫系统，优选来自先天性或 适应性免疫系统的蛋白质。仍然更优选地，所述结合结构域衍生自免疫球蛋白。最优选地， 所述结合结构域包含4个框架区和3个互补决定区，或其任何合适的片段（然后其通常至 少含有形成至少所述互补决定区之一的一些氨基酸残基）。优选地，结合结构域易于以高产 量（优选在微生物重组表达系统中）生产，并且随后方便地分离和/或纯化。还优选地，结 合结构域在储存和利用期间是稳定的，意指在储存和/或利用的条件下保持结合结构域的 完整性，所述条件可包括温度升高、冻-融循环、pH或离子强度变化、UV辐射、存在有害化 学品等等。更优选地，所述结合结构域在农用化学品制剂中是稳定的。如本文所用，"农用 化学品制剂"意指用于农用化学品用途的组合物，如进一步所定义的，其包含至少一种活性 物质，任选地含一或多种有利于农用化学品的最优分散、雾化、沉积、叶湿润、分布、保留和/ 或摄取的添加剂。作为非限制性的实例，这样的添加剂为稀释剂、溶剂、佐剂、表面活性剂、 润湿剂、铺展剂、油、粘着剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、酸化剂、抗沉降剂、抗冻剂、光保护剂、 消泡剂、生物杀伤剂和/或漂移控制剂。最优选地，当在环境温度下储存2年时间或在54°C 储存2周时间，所述结合结构域在农用化学品制剂中保持稳定。优选地，所述结合结构域选 自DARPin、打结素、阿尔法体和VHH。更优选地，所述结合结构域选自阿尔法体和VHH。最优 选地，所述结合结构域为VHH。
[0015] 结合结构域与结合位点或包含于结合位点中的抗原的结合以高亲和力发生。通常 用解离常数描述结合结构域与其靶分子之间的亲和力。优选地，结合结构域与包含于结合 位点中的靶分子之间的结合的解离常数低于10_5M，更优选地，解离常数低于KT6M,甚至更 优选地，解离常数低于1〇_7Μ，最优选地，解离常数低于10-8Μ。优选地，结合结构域与结合位 点的结合是特异的，意指结合结构域仅在靶分子存在于结合位点时与结合位点结合，以及 结合结构域不结合或以低得多的亲和力结合缺失靶分子的结合位点。可通过例如在实施 例2中描述的ELISA方法分析结合结构域的结合特异性，其中将结合结构域与其靶分子的 结合与结合结构域与无关分子的结合比较，并与结合结构域与反应容器的非特异粘着相比 较。特异性还可表现为结合结构域对其靶分子的亲和力相比于对无关分子的亲和力的差 异。优选地，结合结构域对其靶分子的亲和力相比于对无关分子的亲和力的比值大于10,更 优选地，所述比值大于20,最优选地，所述比值大于100。结合结构域的结合可为对一种特 定植物结构特异的，意指包含于这样的植物结构中的结合位点在其它植物结构中不存在或 存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一种植物结构中，所述结合对多于一 种植物结构是更普遍的。结合结构域的结合可为对一种特定植物部分特异的，意指存在于 这样的植物部分之中或之上（可能包含于这样的植物部分上的植物结构中）的结合位点在 其它植物部分中不存在或存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一种植物部 分中，所述结合对多于一种植物部分是更普遍的。结合结构域的结合可为对一种特定植物 物种特异的，意指存在于这样的植物物种之中或之上的结合位点在其它植物物种中不存在 或存在的程度低得多；或如果所述结合位点存在于多于一种植物物种中，所述结合对多于 一种植物物种是更普遍的。结合结构域的结合可为对一种特定植物属特异的，意指存在于 这样的植物属之中或之上的结合位点在其它植物属中不存在或存在的程度低得多；或如果 所述结合位点存在于多于一种植物属中，所述结合对多于一种植物属是更普遍的。结合结 构域的结合可为对植物的一个特定生长阶段特异的，意指在特定生长阶段存在于这样的植 物之中或之上的结合位点在另一个生长阶段的植物中不存在或存在的程度低得多；或如果 所述结合位点存在于多于一个植物生长阶段中，所述结合对多于一个植物生长阶段是更普 遍的。如下文将解释的，结合结构域的所有类型的结合特异性可具有其特异的用途。
[0016] 优选地，在恶劣的条件下结合结构域与结合位点的结合仍具功能，所述恶劣条件 例如低或高温、低或高pH、低或高离子强度、UV辐射、低水可得性、变性化学品存在等等。在 一个优选的实施方案中，所述恶劣条件定义为PH范围4-9,更优选为pH范围3-10,甚至更 优选为pH范围2-10,最优选为pH范围1-11。在另一个优选的实施方案中，所述恶劣条件定 义为温度范围4°C -50°C，更优选为温度范围0°C -55°C，甚至更优选为温度范围0°C -60°C。 在另一个优选的实施方案中，所述恶劣条件定义为存在如上述定义的农用化学品制剂。
[0017] 优选地，结合结构域与结合位点的结合足够强以能够将载体结合（更优选地保 留）于所述结合位点；根据载体的大小和结合结构域的亲和力，一或多个结合结构域可结 合于一或多个结合位点，并且协作得到的结合结构域对结合位点的亲合力保证了强烈地将 载体结合（优选将载体保留）于植物上。如本文所用，"载体"意指任何固体、半固体或液 体载体，在其中或其上可适当地掺入、包括、固定、吸附、吸收、结合、包囊化、包埋、连接或包 含活性物质。这样的载体的非限制性的实例包括，纳米胶囊、微胶囊、纳米球、微球、纳米 颗粒、微粒、脂质体、囊泡、珠、凝胶、弱离子树脂颗粒、脂质体、螺旋状递送载体（cochleate delivery vehicle)、小颗粒剂、颗粒剂、纳米管、巴基球（bucky-ball)、作为油包水型乳剂 的部分的水滴、作为水包油型乳剂的部分的油滴、有机材料（例如软木、木材或其他植物 来源的材料（例如，以种壳、木肩、纸浆、球、珠、片的形式或任何其它合适的形式）、纸或纸 板）、无机材料（例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝、硅酸盐和沸石）、或甚至是 微生物细胞（例如酵母细胞）或其合适的组分或片段（如本文进一步描述的）。如本文所 用，"保留"意指由单一结合结构域或两个或更多个结合结构域的组合对它或它们的结合位 点的亲和力或亲合力导致的结合力大于由载体重力所施加的组合的力和力矩、由喷施的农 用化学品溶液流动或滴落引起的力和力矩（如果有的话）和由一或多种外部因子引起的剪 切力所施加的力和力矩（如果有的话）。在优选的实施方案中，所述外部因子为雨、灌溉、 雪、冰雹或风。通过特异性结合来结合载体比非特异性结合的一个特别的好处是特异性结 合对作用于载体的外部剪切力是更耐受的（Cozens-Roberts等人，1990)。
[0018] 优选地，本发明的结合结构域与存在于完整活植物的一或多种特定植物部分之中 或之上的结合位点，或包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述完整活植物的部 分选自叶、茎、根、果实、球果、花、球茎或块茎。更优选地，所述完整活植物的部分选自叶、茎 或根。更优选地，本发明的结合结构域与完整活植物表面上的结合位点或包含于这样的结 合位点中的抗原结合。如本文所用，"表面"可为存在于完整活植物上；或完整活植物的一 或多个部分上的任何表面，然而，它不包括植物组织学制备物。优选地，所述完整活植物的 表面是完整活植物的部分的表面，其选自叶表面、茎表面、根表面、果实表面、球果表面、花 表面、球茎表面或块茎表面；甚至更优选地，所述完整活植物的表面是完整活植物的部分的 表面，其选自根表面、茎表面和叶表面。
[0019] 优选地，本发明的结合结构域与完整活植物的特定结构之中或之上，或完整活植 物的特定部分的特定结构之中或之上，更优选在参与或涉及参与营养、农用化学品或其它 化学品向植物内的运输和/或参与或涉及参与植物防御的特定结构之中或之上的结合位 点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔、皮孔、 棘、刺、根毛、角质层或蜡质层，甚至更优选地，所述特定结构选自表皮毛、气孔和角质层。在 一个优选的实施方案中，所述结合结构域与植物表皮毛之中或之上的结合位点或包含于这 样的结合位点中的抗原结合。植物表皮毛是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于腺 表皮毛和叶毛。植物表皮毛在植物防御中是具活性的（Lai等人，2000)，但尤其是非腺表皮 毛还被引用为可能是感染靶标（Calo等人，2006)。表皮毛，包括腺表皮毛，还涉及极性化 合物穿过植物角质层向植物内部的运输（SChreiber，2005)。这使得表皮毛成为输送农用 化学品的理想靶标，其通过增强天然防御或通过在攻击位点浓缩农用化学品或通过改进的 (极性）农用化学品向植物内的输送。在另一个优选的实施方案中，所述结合结构域与气 孔之中或之上的结合位点或包含于这样的结合位点中的抗原结合。气孔对CO2扩散进入植 物内和最小化水分损失是必不可少的。气孔还用作病原体，尤其是微生物主要的进入位点 (Underwood等人，2007)。如本文所用，"微生物"意指细菌、病毒、真菌等等。另外，它们通过 可使植物在微生物感染时关闭气孔的特异性信号通路直接涉及植物防御（Melotto等人， 2006)。而在另一个优选的实施方案中，所述结合结构域与根毛之中或之上的结合位点或包 含于这样的结合位点中的抗原结合。已知根毛对微生物附着和植物定殖是重要的（Gage， 2004 ;Laus等人，2005)，并因此是农