乳腺特异性表达载体及其构建方法

专利名称：乳腺特异性表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及乳腺特异性表达载体及其构建方法。
技术背景目前常用的蛋白质表达系统主要有细菌、酵母、哺乳动物细胞、动物生物反应 器等，上述几种蛋白质表达系统各有其优缺点和适用范围，不同特性的蛋白质需要 选择相应的表达系统。动物乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)属于动物生物反应器中的 一个重要分支，又称动物个体乳腺表达系统，它属于转基因动物的范畴，其核心内 容是通过各种转基因技术，将乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因，在动物乳腺 组织高效表达，在乳汁中生产目的产品。如何使外源基因高效、稳定、特异性表达 是制备乳腺生物反应器的一个主要难题，存在的主要障碍包括1)表达量低或不 表达，不具有商业开发价值；2)转基因的位点效应导致各转基因动物系表达水平 差异大，需要大量筛选工作，导致工作量和成本大幅上升；3)异位表达问题，即 在乳腺以外的部位渗漏表达外源蛋白，导致动物生理健康受损而难以获得生产系。克服以上难题的关键在于表达载体的构建。早期研究中大多将目标基因的cDNA 加上乳蛋白基因有限的上下游调控序列构建表达载体，也有少数使用目标基因的基 因组序列或微小基因，鉴于克隆载体的容量有限，这样的载体一般都不超过30Kb， 为了对抗位点效应的影响，有时也会在表达载体中加入一些调控元件如鸡溶菌酶 的核基质结合区(MAR)序列、e-球蛋白的位点控制区(LCR)序列等。使用这样 的小表达载体得到了一批动物乳腺生物反应器，但绝大多数表达量无法达到商业开 发的要求，不具备实际应用价值。大量试验证明，小表达载体无法满足制备乳腺生 物反应器的要求，尽管有少量成功的案例，但是小表达载体显然不具有通用性，无 法可靠地获得高效稳定特异性的表达模式。鉴于乳腺生物反应器制备中出现的问题，国外很多相关研究组加强了对一些重 要乳蛋白基因表达调控的研究工作，从国内外长期的相关研究积累来看，要想获得 良好的表达效果，需要满足以下几个要素1)要有足够完善的表达调控序列，除 了启动子外，还需要增强子、激素应答区(hormone response element ;HRE)、位点控制区(LCR)、脚手架/核基质结合区(S/MAR)、绝缘子(insulator)等一系 列调控元件；另外，估计还有很多我们尚未发现其功能的重要因素参与表达调控； 2)最好能够使用目标基因的基因组序列而不是cDNA，基因组序列更有利于高效表 达，这已经获得公认；3)表达载体要处于一个良好的染色体环境之中，避免位点 效应的影响，或者表达载体具有对抗位点效应的能力。最近发展出来的基因座(gene locus)表达载体为满足以上要求提供了契机。 基因座是指某个基因在染色体上占有的一段区域，长约数十到数百Kb不等，在基 因座的两侧往往有绝缘子等元件，如同一个小王国的边界，把这个基因座和周围的染色体环境分割开来。使用整个基因座进行转基因表达具有以下几个优势1)基 因座内具有天然完善的表达调控序列和基因组序列，使用整个基因座进行转基因表达一般都能够达到或超过该基因的内源性表达水平；2)基因座的转录是相对独立 的，不受周围染色体环境的影响，因此使用整个基因座进行转基因表达一般都能够 获得插入位点非依赖、拷贝数依赖的表达模式。由于基因座长约数十到数百Kb不等，普通的克隆载体无法容纳， 一般都使用 BAC、 YAC等载体来克隆。 一系列乳蛋白BAC基因座，如小鼠WAP、奶牛asl-酪蛋 白、人乳白蛋白、山羊P-乳球蛋白等的表达效果都在小鼠乳腺中得到了验证，都 获得了位点非依赖和拷贝数依赖的表达模式，并且表达水平都接近或超过了内源性 基因的表达水平，表达量可以达到每升乳汁数十克的水平。然而，如果只使用上下 游数Kb的调控序列加上乳蛋白基因组序列进行表达，表达水平往往只有BAC基因 座表达水平的1/10-1/15，而且很难获得插入位点非依赖的表达模式。这些结果显 示乳蛋白BAC基因座具有惊人的表达能力和良好的对抗位点效应的能力，是开发乳 腺个体表达系统的重要资源。但是直到目前为止，研究结果还只局限在乳蛋白BAC 基因座表达，而人们更感兴趣的是如何利用乳蛋白BAC基因座中的调控序列指导外 源基因的表达，特别是表达一些具有重要医用价值而内源性表达水平又很低的蛋白 因子，只有这样，才能真正地把乳蛋白基因座利用起来，使得动物乳腺生物反应器 成为一个通用而方便有效的表达系统。想要达到这个目的，问题的关键在于如何把 待表达目标基因的编码序列和乳蛋白基因座内的调控序列合理地组装在一起，现在 这方面的研究还处于起步阶段。为了使得cre重组酶在小鼠乳腺组织中特异性地表 达，人们把cre重组酶cDNA序列插入到乳蛋白BAC基因座中的启动子之下进行表 达，结果发现cre重组酶能够在小鼠乳腺中高效特异性地表达。发明内容本发明提供了一种乳腺特异性表达载体及其构建方法。 本发明提供的乳腺特异性表达载体的构建方法，包括如下步骤1) 构建DNA片段M。； M。自上游至下游依次为同源臂T,、同源臂T2、同源臂T3、 同源臂L、同源臂T5、同源臂Te;所述6个同源臂的长度均为400-600bp;同源臂 T5和同源臂T6能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座3'调控区；同源臂 T3和同源臂T4能通过与外源目的蛋白BAC同源重组获得完整的外源目的蛋白基因组 序列；同源臂L和同源臂T2能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座5'调 控区；2) 将所述DNA片段M。插入载体中，得到连续三次基因抓捕载体；3) 通过与所述乳蛋白BAC进行两次同源重组、与所述外源目的蛋白BAC进行 一次同源重组，将步骤2)得到的连续三次基因抓捕载体中的DNA片段M。替换为DNA 片段M,，得到所述外源目的蛋白的乳腺特异性表达载体；Mi自上游至下游依次为所 述乳蛋白基因座5'调控区、完整的所述外源目的蛋白基因组序列、所述乳蛋白基 因座3'调控区。所述乳蛋白基因座5'调控区为所述乳蛋白基因座中的所述乳蛋白开放阅读框 架的起始密码子上游的序列；所述乳蛋白基因座3'调控区为所述乳蛋白基因座中 的所述乳蛋白开放阅读框架的终止密码子下游的序列；这样确保所述乳蛋白基因座 中的所述乳蛋白开放阅读框架(由起始密码子至终止密码子)精确地置换为所述外 源目的蛋白基因组序列。所述乳蛋白基因座可为所有哺乳动物的所有种类的乳蛋白基因座，如牛、羊、 马、猪、兔、人或鼠的乳蛋白基因座。所述乳蛋白基因座具体可为羊P -酪蛋白基因座、牛P -酪蛋白基因座、小鼠WAP 基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊e-乳球蛋白基因座、牛e-乳球蛋白基因座。所述外源目的蛋白可为任何外源蛋白，如人血清白蛋白。 下述两种DNA片段也属于本发明的保护范围。一种DNA片段，自上游至下游依次为同源臂L、同源臂L、同源臂L、同源臂 T4、同源臂L、同源臂L;所述6个同源臂的长度均为400-600bp;同源臂^和同 源臂T6能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座3'调控区；同源臂T3和同源臂T4能通过与外源目的蛋白BAC同源重组获得完整的外源目的蛋白基因组序列； 同源臂L和同源臂T2能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座5'调控区。一种DNA片段，自上游至下游依次为乳蛋白基因座5'调控区、完整的外源目 的蛋白基因组序列、乳蛋白基因座3'调控区。所述两种DNA片段中，所述乳蛋白基因座可为所有哺乳动物的所有种类的乳蛋 白基因座，如牛、羊、马、猪、兔、人或鼠的乳蛋白基因座。所述乳蛋白基因座具体可为羊e -酪蛋白基因座、牛P -酪蛋白基因座、小鼠WAP 基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊p -乳球蛋白基因座、牛e -乳球蛋白基因座。所述外源目的蛋白可为任何外源蛋白，如人血清白蛋白。 携带有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌均属于本发 明的保护范围。所述方法、所述DNA片段以及所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌 均可应用于乳腺生物反应器的制备。本发明利用BAC同源重组技术，把乳蛋白基因座5'调控区、完整的外源目的 蛋白基因组序列(从起始密码子到终止密码子)、乳蛋白基因座3'调控区三个基 因片段按顺序组装在一起，实现了乳蛋白基因座内部的基因组序列从起始密码子到 终止密码子精确地置换为外源目的蛋白的基因组序列，从而形成一个乳蛋白-目的 蛋白的杂合基因座，在这种杂合基因座内包含有乳蛋白上下游表达调控序列，中间 却是外源目的蛋白的基因组序列。这个方案的好处在于既获得了完善的乳蛋白表达 调控序列，又使用了外源目的蛋白的基因组序列而不是cDNA序列，使用外源目的 蛋白的基因组序列比使用cDNA序列更有利于高效表达，相对于使用cDNA序列来说， 也更符合真核基因天然的组织状态。本发明将为动物乳腺个体表达系统注入新的活 力，有希望建立一种通用的乳腺生物反应器表达模式，有力地促进乳腺生物反应器 表达系统的推广运用。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。


图i为羊e -酪蛋白-人血清白蛋白连续三次基因抓捕载体 图2为牛e -酪蛋白-人血清白蛋白连续三次基因抓捕载体 图3为羊e -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体构建示意4为牛e-酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体构建示意5为羊e-酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体转基因小鼠southern-blot 鉴定6为牛e -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体转基因小鼠southern-blot 鉴定7为羊0 -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体转基因小鼠乳汁SDS-PAGE8为牛P -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体转基因小鼠乳汁SDS-PAGE9为羊e -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体转基因小鼠乳汁中表达的人血清白蛋白的western-blot鉴定io为牛e-酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换载体转基因小鼠乳汁中表达的 人血清白蛋白的western-blot鉴定图具体实施方式
本发明可利用任何乳蛋白基因座构建表达任意外源目的蛋白的乳腺特异性表 达载体。下面分别以利用羊P-酪蛋白基因座、牛P-酪蛋白基因座构建人血清白蛋 白的乳腺特异性表达载体为例，阐明本发明的技术方案。内切酶、分子生物学方面的试剂购于Promega公司；其他试剂购自 Sigma-Aldrich公司；BAC克隆购自美国国立儿童医院BACPAC中心；pKD46质粒购 自invitrogen公司。pBR322质粒购自New England Biolab公司;pGEM-T载体购自 promega公司<>下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例i、利用羊e-酪蛋白基因座构建人血清白蛋白乳腺特异性表达载体 一、羊p -酪蛋白-人血清白蛋白的同源臂克隆与连续三次抓捕载体的构建三对(共6个)长度为400bp-600bp的同源臂，其中第一对同源臂分别位于羊 酪蛋白基因座的3'端和羊P-酪蛋白基因组序列的终止密码子附近，用于抓捕 羊P-酪蛋白基因座3'调控区；第二对同源臂分别位于人血清白蛋白基因基因组序 列的起始密码子和终止密码子附近，用于抓捕完整的人血清白蛋白基因的基因组序 列；第三对同源臂分别位于羊e-酪蛋白基因座的5'端和羊e-酪蛋白基因组序列 的起始密码子附近，用于抓捕羊e-酪蛋白基因座5'调控区；利用羊e-酪蛋白基因座和人血清白蛋白基因座内存在的天然酶切位点实现6个同源臂的无缝连接，构 建获得连续三次基因抓捕载体。1、 同源臂3fl与3f2的获得以羊0-酪蛋白BAC (目录号CH243-261D1)为模板，以P1和P2为引物，使 用PCR方法克隆获得羊3 -酪蛋白同源臂3fl ，羊P -酪蛋白同源臂3f 1位于羊P -酪蛋白基因3'远端；以羊P-酪蛋白BAC为模板，以P3和P4为引物，使用PCR 方法克隆获得羊P -酪蛋白同源臂3f2，羊0 -酪蛋白同源臂3f2位于羊0 -酪蛋白基 因终止密码子下游近侧；这一对同源臂共同用于抓捕羊3 -酪蛋白基因约8Kb的3' 侧翼区。Pl (上游引物)5，-《^ acGTTTTTCCTGTGGTCATGTATGGATG-3，； P2 (下游引物)5'-^^^ccgcCGGAGTTCACTCAGACTCATGTCCATC-3'; P3 (上游引物)5，-ccaz^gGAGGATTTCAATGTGAATGCCCCCTC-3，； P4 (下游引物)5，-gfc^acAAATTTTGAGATAAAACAATTG-3，。 上述引物中，小写兼斜写部分为酶切位点。分别将羊e-酪蛋白同源臂3fl和3f2与pGEM-T连接，进行测序分析，分析结 果表明，同源臂内部没有突变。羊P-酪蛋白同源臂3fl的序列见序列表的序列l， 自5'端第1至6位脱氧核糖核苷酸为5^7/酶切位点，第357至364位脱氧核糖核 苷酸为AbV酶切位点。羊P-酪蛋白同源臂3f2的序列见序列表的序列2，自5' 端的第1至6位脱氧核糖核苷酸为Afco/酶切位点；自5'端的第451至456位脱氧 核糖核苷酸为&7/酶切位点。2、 同源臂gl与g2的获得以人血清白蛋白BAC (目录号RP11-580P21)为模板，以P5和P6为引物，使 用PCR方法克隆获得人血清白蛋白同源臂gl，人血清白蛋白同源臂gl位于终止密 码子上游近侧；以人血清白蛋白BAC为模板，以P7和P8为引物，使用PCR方法克 隆获得人血清白蛋白同源臂g2，人血清白蛋白同源臂g2位于起始密码子下游近侧; 这一对同源臂共同用于抓捕从起始密码子到终止密码子全长约16Kb的人血清白蛋 白基因组片段。P5 (上游引物)5，-《f t朋cAGCACTTTGTTTTTATCTCCTGCTC-3，； P6 (下游引物)5， -cca z^gTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3，； P7 (上游引物)5'-c^ga^ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTC-3';P8 (下游引物)5'-g〃朋cAACAGCAACCAAGAAGACAGAC-3'。 上述引物中，小写兼斜写部分为酶切位点。分别将人血清白蛋白同源臂gl和g2与pGEM-T连接，进行测序分析，分析结果 表明，同源臂内部没有突变。人血清白蛋白同源臂gl的序列见序列表的序列3，自 5'端第l至6位脱氧核糖核苷酸为^ps/酶切位点，第513至518位脱氧核糖核苷 酸为^o/酶切位点。人血清白蛋白同源臂g2的序列见序列表的序列4，自5'端 的第1至6位脱氧核糖核苷酸为J力oJ酶切位点；自5，端的第514至519位脱氧核 糖核苷酸为^^/酶切位点。3、 同源臂5f 1与5f2的获得以羊0-酪蛋白BAC (目录号CH243-261D1)为模板，以P9和P10为引物，使 用PCR方法克隆获得羊P -酪蛋白同源臂5f 1 ，羊3 -酪蛋白同源臂5f 1位于羊P -酪蛋白基因起始密码子上游近侧；以羊e-酪蛋白BAC为模板，以P11和P12为引 物，使用PCR方法克隆获得羊e-酪蛋白同源臂5f2，羊P-酪蛋白同源臂5f2位于 羊e-酪蛋白基因5'远端；这一对同源臂共同用于抓捕羊e-酪蛋白基因约13Kb 的5'侧翼区。P9 (上游引物)5，-塔&"TAAGTGAATC MCCACTTAA TTTTTC-3，； P10 (下游引物)5，-cz^^^GGCTCTCGATTCCTGTGAATGGGAAG-3'; Pll (上游引物)5，-《c^^ccgcACTCTGGAAC AATTTCTTTT TTG-3，； P12 (下游引物)5，-^taciGCAAAACTCACCTCTCTGAATTGC-3'。 上述引物中，小写兼斜写部分为酶切位点。分别将羊e -酪蛋白同源臂5f 1和5f2与pGEM-T连接，进行测序分析，分析结 果表明，同源臂内部没有突变。羊P-酪蛋白同源臂5fl的序列见序列表的序列5， 自5'端第1至6位脱氧核糖核苷酸为6bs/酶切位点，第460至465位脱氧核糖核 苷酸为X力o/酶切位点。羊e-酪蛋白同源臂5f2的序列见序列表的序列6，自5' 端的第1至8位脱氧核糖核苷酸为#"/酶切位点；自5'端的第459至464位脱氧 核糖核苷酸为5"M/酶切位点。4、 三次抓捕载体的构建 1) pBR322载体的改造合成两个寡核苷酸小片段N1和N2; N1和N2片段退火后形成双链，在两端分 别形成Pstl和Pvul的粘末端；pBR322用Pstl和Pvul酶切后与上述退火的双链寡核苷酸小片段连接，获得带有Notl酶切位点的pBR322质粒，同时破坏掉了pBR322 的氨苄抗性基因，只保留下了四环素抗性。N1和N2序列如下，划线部分为vV"I位点Nl: 5， -CGGCGGCCGCCTGCA-3，；N2: 5'-TAGCGCGGCCGCG-3'。2) 将6个同源臂按次序连接在一起，具体如下羊0 -酪蛋白基因同源臂3f 1与羊P -酪蛋白基因同源臂3f2依靠&7/酶切位 点连接在一起，羊P -酪蛋白基因同源臂3f2与人血清白蛋白基因同源臂gl依靠 # /酶切位点连接在一起，人血清白蛋白基因同源臂gl与人血清白蛋白基因同源 臂g2依靠v^3/酶切位点连接在一起，人血清白蛋白基因同源臂g2与羊e -酪蛋白 基因同源臂5fl依靠Wo/酶切位点连接在一起，羊e-酪蛋白基因同源臂5fl与羊 e -酪蛋白基因同源臂5f2依靠5ba/酶切位点连接在一起。3) 在羊e -酪蛋白基因同源臂3fl的3'端和羊P -酪蛋白基因同源臂5f2的5' 端各有一个^^/酶切位点，将按次序连接到一起的6个同源臂使用U酶切，并 转移克隆到步骤l)改造后的pBR322载体上。将得到的重组载体进行酶切和测序鉴定，证明获得了连接完全正确的连续三次 基因抓捕载体pBRSV。，连续三次基因抓捕载体pBRSV。的结构见图1。二、乳腺特异性表达载体的构建 1、感受态细胞的制备1) 分别将含有羊P -酪蛋白基因BAC的DH10(3菌和含有人血清白蛋白BAC的 DH10(5菌制成化学感受态细胞；2) 将编码Red重组系统pKD46质粒分别热激转化至上述两种化学感受态细胞中；3) 将步骤2)得到的细胞在含有氨苄西林和氯霉素的平板上30°C培养基过夜;4) 挑单克隆转接至液体LB培养基中30°C继续培养至0D600为0. 20~0. 25;5) 然后加入lmol/L的L-阿拉伯糖，使终浓度约为6mmol/L，继续培养45min 至lh，使0D600达到0. 40~0. 50;6) 离心收集细菌，用10%灭菌甘油洗三次，最后用10%灭菌甘油悬浮，得到终 浓度为lx101。 cells/VL的含有pKD46及羊0 -酪蛋白基因BAC的电击感受态细胞， 终浓度为lx101。 cellsAiL的含有pKD46及人血清白蛋白基因BAC的电击感受态细胞。2、基因抓捕连续三次基因抓捕的流程见图3。图3中，T6:羊e-酪蛋白基因同源臂3fl;T5:羊e-酪蛋白基因同源臂3f2; T4:人血清白蛋白基因同源臂gl; T3:人血清 白蛋白基因同源臂g2; T2:羊3-酪蛋白基因同源臂5fl; Tl:羊3_酪蛋白基因同源臂5f2。1) 第一次基因抓捕① 将构建好的连续三次基因抓捕载体pBRSV。用限制性内切酶&7/酶切，打开 羊e-酪蛋白基因同源臂3fl和同源臂3f2之间的连接，释放出两个同源臂，脱磷 后回收，构成线性的基因抓捕载体，浓度约为50ng/uL;② 取2uL步骤①得到的线性化抓捕载体加入50uL含pKD46及羊P -酪蛋白基因 BAC的大肠杆菌感受态细胞中，进行电击，电击参数为2.5kv， 5ms;电击后立即加 入500uL SOC培养液悬浮，37°C， 220r/min，复苏1. 5h，然后涂布于含四环素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。对四环素抗性的细菌克隆抽提质粒进行鉴定，发现获得的质粒明显比抓捕载体 大，说明已经抓捕获得了第一个基因片段；进行酶切鉴定和测序鉴定，证明已经成 功抓捕获得了8Kb的羊e-酪蛋白基因3，调控区。获得了克隆有羊P -酪蛋白基因座3'调控区的抓捕载体pBRSVi。2) 第二次基因抓捕① 从抓捕载体pBRSV,出发，用限制性内切酶7^s/酶切，打开人血清白蛋白基 因同源臂gl和同源臂g2之间的连接，释放出两个同源臂，脱磷后回收，构成线性 的基因抓捕载体，浓度约为50ng/uL;② 取2uL步骤①得到的线性化抓捕载体加入50uL含pKD46及人血清白蛋白基 因BAC的大肠杆菌感受态细胞中，进行电击，电击参数为2.5kv， 5ms;电击后立即 加入500uL SOC培养液悬浮，37°C， 220r/min，复苏1. 5h，然后涂布于含四环素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。对四环素抗性的细菌克隆抽提质粒进行鉴定，发现获得的质粒明显比第一次抓 捕获得的质粒大，说明已经抓捕获得了第二个基因片段；进行酶切鉴定和测序鉴定， 证明已经成功抓捕获得了从起始密码子到终止密码子16Kb完整的人血清白蛋白基 因组序列。至此获得了克隆有羊P -酪蛋白基因座3'调控区和完整的人血清白蛋白基因基因组序列的抓捕载体pBRSV2。 3)第三次基因抓捕① 从抓捕载体pBRSV2出发，用限制性内切酶5ba/酶切，打开羊e-酪蛋白基因 同源臂5f2和5fl之间的连接，释放出两个同源臂，脱磷后回收，构成线性的基因 抓捕载体，浓度约为50ng/uL;② 取2uL步骤①得到的线性化抓捕载体加入50uL含pKD46及羊e -酪蛋白基因 BAC的大肠杆菌感受态细胞中，进行电击，电击参数为2.5kv， 5ms;电击后立即加 入500uL SOC培养液悬浮，37°C， 220r/min，复苏1. 5h，然后涂布于含四环素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。对四环素抗性的细菌克隆抽提质粒进行鉴定，发现获得的质粒明显比第二次抓 捕获得的质粒大，说明已经抓捕获得了第三个基因片段；进行酶切鉴定和测序鉴定， 证明已经成功抓捕获得了 13Kb的羊P-酪蛋白5，调控区。至此获得了克隆有羊P-酪蛋白基因8Kb的3，调控区、从起始密码子到终止密 码子16Kb的完整的人血清白蛋白基因组序列和13Kb的羊e-酪蛋白5'调控区的羊 P -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换型表达载体pBRS，成功实现了把羊P -酪蛋白 基因座中的基因组序列精确地从起始密码子到终止密码子置换为人血清白蛋白基 因的基因组序列。将羊P -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换型表达载体pBRS进行^z'/^/J/酶切 鉴定，结果出现240bp、 3281bp、 4412bp、 5429bp、 6409bp、 7712bp、 9246bp共6 个片段，与预计的完全相同，表明该羊e-酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换型表达 载体pBRS构建正确。三、转基因小鼠的制备和鉴定1、转基因小鼠的制备将表达载体pBRS用Y"/酶切，回收目的基因片段，显微注射到C57小鼠(军 事医学科学院实验动物中心)受精卵的原核中，经过注射的小鼠受精卵通过输卵管 移植入C57代孕小鼠中，待仔鼠分娩，即得到转基因首建者(Founder)小鼠。应用southern-blot方法对转基因首建者(Founder)小鼠进行鉴定，探针序 列见序列表的序列ll (645 bp)。共获得9只阳性的转基因Founder小鼠(3只雌 鼠；6只雄鼠)。9只阳性的转基因Founder小鼠的southern-blot鉴定结果如图5。图5中，1-9为9只阳性的转基因Founder小鼠；10为普通的C57小鼠；11为 pBRS载体。将阳性的转基因Founder小鼠传代建立了相应的转基因小鼠系。9只阳性转基 因Founder小鼠相互交配，得到的子代转基因小鼠为Fl代，连续传代直至F6代。 2、转基因小鼠的鉴定从F6代转基因小鼠中任选2只雌性小鼠与雄性C57小鼠进行交配产子。转基 因小鼠产子后12天，隔离母子3小时，对母鼠注射0. 2U的催产素，20分钟后麻醉， 挤取乳汁约80ul。同时将普通C57小鼠雌雄交配产子，雌性小鼠产子后12天，隔离母子3小时， 对母鼠注射0.2U的催产素，20分钟后麻醉，挤取乳汁约80ul，作为阴性对照。1) 转基因小鼠乳汁中人血清蛋白表达量的测定将乳汁离心脱脂后按10ul每管分装冻存于-8(TC冰箱中备用，取出后用PBS稀 释20倍，取10ul加上样缓冲液混合，煮5分钟，冰上放置，使用12%的胶进行 SDS-PAGE分析，使用凝胶扫描测定表达的人血清白蛋白的含量。结果见图7。图7中，1:普通阴性小鼠乳汁样本；2:转基因小鼠乳汁样本；M: 低分子量蛋白标准。可见明显的人血清白蛋白条带，分子量约为66Kda，表达量约 为5g/L乳汁。2) 转基因小鼠乳汁中人血清白蛋白的鉴定小鼠乳汁使用PBS稀释1万倍后取10ul进行SDS-PAGE,使用western-blot 方法鉴定表达的产物是否的确为人血清白蛋白，使用的抗体为HRP标记的小鼠抗人 血清白蛋白单抗。结果见图9。图9中，1、 2为两个转基因小鼠系乳汁样本，3为普通阴性小鼠乳 汁样本。证明表达的的确是人血清白蛋白。实施例2、利用牛0 -酪蛋白基因座构建人血清白蛋白乳腺特异性表达载体 一、牛3 -酪蛋白-人血清白蛋白的同源臂克隆与连续三次抓捕载体的构建 三对(共6个)长度为400bp-600bp的同源臂，其中第一对同源臂分别位于牛e-酪蛋白基因座的3'端和牛e-酪蛋白基因组序列的终止密码子附近，用于抓捕牛P-酪蛋白基因座3'调控区；第二对同源臂分别位于人血清白蛋白基因基因组序 列的起始密码子和终止密码子附近，用于抓捕完整的人血清白蛋白基因的基因组序列；第三对同源臂分别位于牛e-酪蛋白基因座的5'端和牛e-酪蛋白基因组序列的起始密码子附近，用于抓捕牛P-酪蛋白基因座5'调控区；利用牛P-酪蛋白基 因座和人血清白蛋白基因座内存在的天然酶切位点实现6个同源臂的无缝连接，构 建获得连续三次基因抓捕载体。1、 同源臂3f 1与3f2的获得以牛P-酪蛋白BAC (目录号RP42-127E3)为模板，以P13和P14为引物，使 用PCR方法克隆获得牛3 -酪蛋白同源臂3f 1 ，牛e -酪蛋白同源臂3fl位于牛P -酪蛋白基因3'远端；以牛3-酪蛋白BAC为模板，以P15和P16为引物，使用PCR 方法克隆获得牛P -酪蛋白同源臂3f2，牛0 -酪蛋白同源臂3f2位于牛P -酪蛋白基 因终止密码子下游近侧;这一对同源臂共同用于抓捕牛e -酪蛋白基因约11 Kb的3' 侧翼区。P13 (上游引物)5， -cafa&AGTGAAAGTG AAAATGAAGT TGCTC-3'; P14 (下游引物)5'-^^^cc^cGAGATGGTGAGGGACAGGGAGGTC-3，； P15 (上游引物):5，-cca ^gGTCTAAATTT ACTAACTGTG CTG-3，； P16 (下游引物)5， -ca"^ATAATTGTGATAAGGAGAACTTC-3'。 上述引物中，小写兼斜写部分为酶切位点。分别将牛e -酪蛋白同源臂3f 1和3f2与pGEM-T连接，进行测序分析，分析结 果表明，同源臂内部没有突变。牛P-酪蛋白同源臂3fl的序列见序列表的序列7， 自5'端第1至6位脱氧核糖核苷酸为#&/酶切位点，第416至423位脱氧核糖核 苷酸为^W/酶切位点。牛P -酪蛋白同源臂3f2的序列见序列表的序列8，自5' 端的第1至6位脱氧核糖核苷酸为7fco/酶切位点；自5'端的第441至446位脱氧 核糖核苷酸为yW/e/酶切位点。2、 同源臂gl与g2的获得以人血清白蛋白BAC(目录号RP11-580P21)为模板，以P5和P6为引物，使用 PCR方法克隆获得人血清白蛋白同源臂gl，人血清白蛋白同源臂gl位于终止密码 子上游近侧；以人血清白蛋白BAC为模板，以P7和P8为引物，使用PCR方法克隆 获得人血清白蛋白同源臂g2，人血清白蛋白同源臂g2位于起始密码子下游近侧； 这一对同源臂共同用于抓捕从起始密码子到终止密码子全长约16Kb的人血清白蛋 白基因组片段。P5 (上游引物)5， -g"朋cAGCACTTTGTTTTTATC TCCTGCTC-3';P6 (下游引物)5，-ccaz^gTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3，； P7 (上游引物)5，-"c卵MTGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTC-3'; P8 (下游引物)5，-《"朋cAACAGCAACCAAGAAGACAGAC-3，。 上述引物中，小写兼斜写部分为酶切位点。分别将人血清白蛋白同源臂gl和g2与pGEM-T连接，进行测序分析，分析结果 表明，同源臂内部没有突变。人血清白蛋白同源臂gl的序列见序列表的序列3，自 5'端第l至6位脱氧核糖核苷酸为^^/酶切位点，第513至518位脱氧核糖核苷 酸为^o/酶切位点。人血清白蛋白同源臂g2的序列见序列表的序列4，自5'端 的第1至6位脱氧核糖核苷酸为化o/酶切位点；自5，端的第514至519位脱氧核 糖核苷酸为^/^/酶切位点。3、 同源臂5f 1与5f2的获得以牛P-酪蛋白BAC (目录号RP42-127E3)为模板，以P17和P18为引物，使 用PCR方法克隆获得牛e -酪蛋白同源臂5f 1，牛e -酪蛋白同源臂5fl位于牛e -酪蛋白基因起始密码子上游近侧；以牛P-酪蛋白BAC为模板，以P19和P20为引 物，使用PCR方法克隆获得牛P-酪蛋白同源臂5f2，牛0-酪蛋白同源臂5f2位于 牛e-酪蛋白基因5'远端；这一对同源臂共同用于抓捕牛e-酪蛋白基因约15 Kb 的5'侧翼区。P17 (上游引物)5， -a《&ciCTAAGACATATCTGGCAATAAAAATTA-3'; P18 (下游引物)5， -cz^ga^GGCTCTCAATTCCTGGGAATG-3，； P19 (上游引物)5，-《c^rc《cTCAAGAAGAT CCCCTGGAGA AGG-3，； P20 (下游引物)5'-^tacz^ATGGTGACCAGAACGCCTTGTGG-3，。 上述引物中，小写兼斜写部分为酶切位点。分别将牛e-酪蛋白同源臂5fl和5f2与pGEM-T连接，进行测序分析，分析结 果表明，同源臂内部没有突变。牛0-酪蛋白同源臂5fl的序列见序列表的序列9， 自5，端第1至6位脱氧核糖核苷酸为5ba/酶切位点，第505至510位脱氧核糖核 苷酸为J力o/酶切位点。牛P-酪蛋白同源臂5f2的序列见序列表的序列10，自5， 端的第1至8位脱氧核糖核苷酸为iV"/酶切位点；自5'端的第459至464位脱氧 核糖核苷酸为5ba/酶切位点。4、 三次抓捕载体的构建 1) pBR322载体的改造同实施例1的步骤一的4的1)。2) 将6个同源臂按次序连接在一起，具体如下牛e -酪蛋白基因同源臂3fl与牛P -酪蛋白基因同源臂3f2依靠7W/eJ酶切位 点连接在一起，牛e -酪蛋白基因同源臂3f2与人血清白蛋白基因同源臂gl依靠 AfcoJ酶切位点连接在一起，人血清白蛋白基因同源臂gl与人血清白蛋白基因同源 臂g2依靠i^a/酶切位点连接在一起，人血清白蛋白基因同源臂g2与牛P -酪蛋白 基因同源臂5f 1依靠Z力o/酶切位点连接在一起，牛0 -酪蛋白基因同源臂5f 1与牛 P -酪蛋白基因同源臂5f2依靠6bs/酶切位点连接在一起。3) 在牛e -酪蛋白基因同源臂3fl的3'端和牛P -酪蛋白基因同源臂5f2的5' 端各有一个M^/酶切位点，将按次序连接到一起的6个同源臂使用yV"/酶切，并 转移克隆到步骤1)改造后的PBR322载体上。将得到的重组载体进行酶切和测序鉴定，证明获得了连接完全正确的连续三次 基因抓捕载体pBRCV。，连续三次基因抓捕载体pBRCV。的结构见图2。 二、乳腺特异性表达载体的构建1、 感受态细胞的制备1) 分别将含有牛e -酪蛋白基因BAC的DH10P菌和含有人血清白蛋白BAC的 DH10卩菌制成化学感受态细胞；2) 将编码Red重组系统pKD46质粒分别热激转化至上述两种化学感受态细胞中；3) 将步骤2)得到的细胞在含有氨苄西林和氯霉素的平板上30°C培养基过夜；4) 挑单克隆转接至液体LB培养基中30°C继续培养至0D600为0. 20~0. 25;5) 然后加入lmol/L的L-阿拉伯糖，使终浓度约为6mmol/L，继续培养45min 至lh，使0廳0达到0. 40~0. 50;6) 离心收集细菌，用10%灭菌甘油洗三次，最后用10%灭菌甘油悬浮，得到终 浓度为lxl01Q cells/(iL的含有pKD46及牛e -酪蛋白基因BAC的电击感受态细胞， 终浓度为lxl01D cellsAiL的含有pKD46及人血清白蛋白基因BAC的电击感受态细 胞。2、 基因抓捕连续三次基因抓捕的流程见图4。图4中，T6:牛e-酪蛋白基因同源臂3fl; T5:牛P-酪蛋白基因同源臂3f2; T4:人血清白蛋白基因同源臂gl; T3:人血清白蛋白基因同源臂g2; T2:牛e-酪蛋白基因同源臂5fl; Tl:牛P-酪蛋白基因同 源臂5f2。1) 第一次基因抓捕① 将构建好的连续三次基因抓捕载体pBRSV。用限制性内切酶T^e/酶切，打开 牛P-酪蛋白基因同源臂3fl和同源臂3f2之间的连接，释放出两个同源臂，脱磷 后回收，构成线性的基因抓捕载体，浓度约为50ng/uL;② 取2uL步骤①得到的线性化抓捕载体加入50uL含pKD46及牛e -酪蛋白基因 BAC的大肠杆菌感受态细胞中，进行电击，电击参数为2.5kv， 5ms;电击后立即加 入500uL SOC培养液悬浮，37°C， 220r/min，复苏1. 5h，然后涂布于含四环素 (50ug/mL)的LB平板上，37"C孵育24h。对四环素抗性的细菌克隆抽提质粒进行鉴定，发现获得的质粒明显比抓捕载体 大，说明已经抓捕获得了第一个基因片段；进行酶切鉴定和测序鉴定，证明已经成 功抓捕获得了 11 Kb的牛P-酪蛋白基因3'调控区。获得了克隆有牛P -酪蛋白基因座3'调控区的抓捕载体pBRCV,。2) 第二次基因抓捕① 从抓捕载体pBRCK出发，用限制性内切酶i^a/酶切，打开人血清白蛋白基 因同源臂gl和同源臂g2之间的连接，释放出两个同源臂，脱磷后回收，构成线性 的基因抓捕载体，浓度约为50ng/uL;② 取2uL步骤①得到的线性化抓捕载体加入50uL含pKD46及人血清白蛋白基 因BAC的大肠杆菌感受态细胞中，进行电击，电击参数为2.5kv， 5ms;电击后立即 加入500uL SOC培养液悬浮，37°C， 220r/min，复苏1. 5h，然后涂布于含四环素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。对四环素抗性的细菌克隆抽提质粒进行鉴定，发现获得的质粒明显比第一次抓 捕获得的质粒大，说明已经抓捕获得了第二个基因片段；进行酶切鉴定和测序鉴定， 证明已经成功抓捕获得了从起始密码子到终止密码子16Kb完整的人血清白蛋白基 因组序列。至此获得了克隆有牛P -酪蛋白基因座3'调控区和完整的人血清白蛋白基因基 因组序列的抓捕载体pBRCV2。3) 第三次基因抓捕①从抓捕载体pBRCV2出发，用限制性内切酶5b3/酶切，打开牛P-酪蛋白基因同源臂5f2和5fl之间的连接，释放出两个同源臂，脱磷后回收，构成线性的基因 抓捕载体，浓度约为50ng/uL;②取2uL步骤①得到的线性化抓捕载体加入50uL含pKD46及牛P -酪蛋白基因 BAC的大肠杆菌感受态细胞中，进行电击，电击参数为2.5kv， 5ms;电击后立即加 入500uL SOC培养液悬浮，37°C ， 220r/min，复苏1. 5h，然后涂布于含四环素(50ug/mL) 的LB平板上，37。C孵育24h。对四环素抗性的细菌克隆抽提质粒进行鉴定，发现获得的质粒明显比第二次抓 捕获得的质粒大，说明已经抓捕获得了第三个基因片段；进行酶切鉴定和测序鉴定， 证明已经成功抓捕获得了 15 Kb的牛e-酪蛋白5'调控区。至此获得了克隆有牛e-酪蛋白基因11Kb的3，调控区、从起始密码子到终止 密码子16Kb的完整的人血清白蛋白基因组序列和15 Kb的牛P-酪蛋白5'调控区 的牛e -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换型表达载体pBRC，成功实现了把牛0 -酪 蛋白基因座中的基因组序列精确地从起始密码子到终止密码子置换为人血清白蛋 白基因的基因组序列。将牛P -酪蛋白-人血清白蛋白基因组置换型表达载体pBRC进行^^/酶切鉴 定。鉴定结果出现10个条带，分别为663bp、 803bp、 2194bp、 2221bp、 3080bp、 3385bp、 3647bp、 5350bp、 9250bp、 11865bp，表明牛P -酪蛋白-人血清白蛋白基 因组置换型表达载体pBRC构建正确。三、转基因小鼠的制备和鉴定1、 转基因小鼠的制备将表达载体pBRC用y^f/酶切，回收目的基因片段，显微注射到C57小鼠(购 自军事医学科学院实验动物中心)受精卵的原核中，经过注射的小鼠受精卵通过输 卵管移植入C57代孕鼠中，待仔鼠分娩，即得到转基因首建者(Founder)小鼠。应用southern-blot方法对转基因首建者(Founder)小鼠进行鉴定，探针序 列见序列表的序列ll (645 bp)。共获得7只阳性的转基因Founder小鼠。7只阳 性的转基因Founder小鼠的southern-blot鉴定结果如图6。图6中，1为pBRC载 体；2为普通C57小鼠；3-9为7只阳性的转基因小鼠。将阳性的转基因Founder小鼠传代建立了相应的转基因小鼠系。7只阳性转基 因Founder小鼠相互交配，得到的子代转基因小鼠为Fl代，连续传代直至F6代。2、 转基因小鼠的鉴定从F6代转基因小鼠中任选3只雌性小鼠与雄性C57小鼠进行交配产子。转基 因小鼠产子后12天，隔离母子3小时，对母鼠注射0. 2U的催产素，20分钟后麻醉， 挤取乳汁约80ul。同时将C57小鼠雌雄交配产子，雌性小鼠产子后12天，隔离母子3小时，对 母鼠注射0.2U的催产素，20分钟后麻醉，挤取乳汁约80ul，作为阴性对照。1) 转基因小鼠乳汁中人血清蛋白表达量的测定将乳汁离心脱脂后按10ul每管分装冻存于-8(TC冰箱中备用，取出后用PBS稀 释20倍，取10ul加上样缓冲液混合，煮5分钟，冰上放置，使用12%的胶进行 SDS-PAGE分析，使用凝胶扫描测定表达的人血清白蛋白的含量。结果见图8。图8中，1:转基因小鼠乳汁样本；2:普通阴性小鼠乳汁样本； M:低分子量蛋白标准。可见明显的人血清白蛋白条带，分子量约为66Kda，表达量 约为8g/L乳汁。2) 转基因小鼠乳汁中人血清白蛋白的鉴定小鼠乳汁使用PBS稀释1万倍后取10ul进行SDS-PAGE，使用western-blot 方法鉴定表达的产物是否的确为人血清白蛋白，使用的抗体为HRP标记的小鼠抗人 血清白蛋白单抗。结果见图IO。图IO中，I、 2、 3为三个转基因小鼠系乳汁样本，4为普通阴性 小鼠乳汁样本。证明表达的的确是人血清白蛋白。序列表<110〉中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>乳腺特异性表达载体及其构建方法〈130〉 CGGNARY81247〈160〉 11〈210〉 1<211〉 364<212> DNA <213〉人工序列<400〉 1gtcgacgttt ttcctgtggt catgtatgga tgtgagagtt caccgaagaa ttgatgcttt tgaactgtgg tgttggagaa actgcaagga gatccaacca gtccattctg aaggagatca gtaatgatgc taaagctgaa actccaatac tttggccacc ttggaaaaga ctctgatggt gggagggatt gggggcaaga atgagatggc tgaatggcat cactgeictcg atggacatga ccgc〈210> 2 <211> 456 <212〉 靈 <213>人工序列<400> 2ccatgggagg atttcaatgt gaatgccccc tcctcactttggactgtg肌gaaggctgag gactcttgag agtcccttgg gccctgggat ttctttggaa "tcatgtgaag agttgactca_ gg卿agggg acga^cagagg gtctgagtga actccggcgg60 120 180 240 300 360 364tggtaagctt taggagatta60gaggcagactgatcatttttatagttaatatcttttacatttaattttcctggataagac120ccaatagtagcaatttctatcagt3tscc3gcgtaaagattagttttaaatttattttca180gtg3ttg3Ctgttatttactgacctgaaattatgtatctgttatatttcaaataatgcaa240atatggtgttgac3gatttgattggttttctttcaattgcctatatcctt300attattgsttgtaatcatttataga犯aaactgaaaataatttcttatacttttatgtaa3603CCtgtt3g3gcttattttaaagatcaactgcattcacatttctaatctagtcattatga420gcttcaattgttttatctcactt犯肌tttgtcgac456〈210〉 3〈211〉 518〈212〉 DNA〈213>人工序列<400> 3gttaacagcactttgtttttatctcctgctctattgtgccatactgttaaatgtttataa60tgcctgttctgtttccaaatttgtgatgcttatgaatatt肪taggaatatttgt犯ggc120ctgaaatsttttga_tc3tgaaatcaaaacattaMttatttaaacatttacttgaaatgt180ggtggtttgtgatttagttgattttataggCt8Lgtggg3gaatttacattcaaatgtcta240aatcacttaaaattgccctttatggcctgacagtaacttttttttattcatttggggaca300actatgtccgtgagcttccgtccagagattatagtagtaaattgteiattaaaggatatga360tgcacgtgaaatcactttgcaatcatcaatagcttcataaatgttaattttgtatcctaa420tagtaatgctaatattttcctaacatctgtcatgtctttgtgttC3gggt朋aaaacttg■ttgctgcaagtcaagctgccttaggcttataacc3tgg518<210〉 4<211> 519<212〉DNA 〈213〉人工序列<400> 4ctcgagatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcc60鄉ggtgtgtttcgtcgagatgcacgtaagaaatccatttttctattgttcaacttttat120tctattttcccagtaaaataaagtttta^gt3aactctgC3tcttta肌gaattattttgg180catttatttctaaaatggcatagtattttgtatttgtgaeigtcttacaaggttatcttat240caaacatcctaggtaaeiaaacagaattgtttagtgactgt300aattttcttttgcgcactaagg犯agtgcaaagt6L8icttaggtgtgactgEiaacttcacag360aerUgggttgaagattgaattcataactatcccEiaagacctatccattgcactatgcttt420at 11 aaaaaccacaaaacctgtgctgttgatctcataaatag肌cttgt3tttatattta480ttttCElttttagtctgtcttcttggttgctgttgttaac519<210> 5〈211〉 465〈212〉 腿〈213〉人工序列<400> 5agtacttaagtgaatcaaccacttaatttttctgt3犯tatctgtaacttctcttctgtc60tttccaaaaacactcgtaagtactgtgaatgagatg犯aaagagtgaagtagg由tagg120atgttagcagaaa3c3tctgaatggctggcgLgtgaaaicattaacttgaaatgta^gatta180atgagtaatagtaaattttaactttggccatatgataeiaatgtttattaeitatttttcta240aaatacagggctttttgtttttgcca_tga_ggtttgc鄉atcttggttccctgacc3ggg300atcaaacctgcgctcccctgg￡L2lgCatgg￡Lgtcttggacatttgtattatacactatctt360tggttccttgta^ggg肌gtaattttacttaaataagaagaagtaatac420actgtttcctcatcttcccattcacaggaatcgagagccctcgag465<210〉 6〈211> 464〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈400〉 6gcggccgcactctggaacaatttcttttttgctgaaagtgagacaaatgtatcactgtga60attggagaataaaattgaaaattaaggtttagatttcctca^atcaaa/tgttttttatgt120ggatatgttcaagtagctcaaaagttattta_c attest atattagttatgatgat鄉gt180ctgatataaagtttattttctatttccttcttacttta_aaaaaattgtctacttctatta240ttttataaaaaaaataatctgttactgtgatataaataaccaatttgtttttgaaagatc300catgacaacttgttggattaatagaagtcatcttatttcttgaagagtatctcagtaact360agaca/taaagaatatcaa^gtg肌3gtt8Ccactgctttcacaga鄉agaaacaaat 11420agagg肌geitgagagcaattcagagaggtgagttttgca_gtact464<210> 7<211> 423〈212> 腿〈213〉人工序列<400〉 7C3tatgsgtgaaagtgaaeiatgaagttgctcagtcatgtccactcttcgcaaaccca_tgg60acggtagcctaccaggctctgccgtccatgggattttccaggc肪gaat3Ctg33gtggg120ctgccatttccttctccaggggatcttcccaacccagggatcaaacccgggtctcctgca180ttgcagacagacgctttacc3tctg肪ccacccagg朋ggccatttacat卿gtgC3tg240taaatgcataatccataattgcttcca幼caaatttcagt8a^cc3gcaatctaagtaga300agttgaagctatagacatttgtgtgtgtgtgtgtgtttcagtcacc^gttatgtctgac360tcttagcgacctcatggactgcagcacaccagacctccctgtccctcaccatctcgcggc420cgc423<210> 8〈211〉 446〈212〉 DNA <213>人工序列<400> 8ccatgggtctaaat 11 ac t 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10gcggccgctcaagaagatcccctggetgaaggaaatggcaactactccagtattcttgact60ga^3朋tcccacggacagagaaacttccggctacaagccaatgagtcacaaagagttgga120catgatcgaattataaagc3caattagtatact3tgtgt3ccaataagaa180tctactgtataacacagggaagtctactccgtgctctgtgatgttctaactggg卿g朋240gtccaaaaaagagtatatgtgg3tt3ttC3ctttgttgtatgacacagca300gtgtaaaaaagctatactgccccaccccctagaaaaaag3attattgtaatacctatttt360gtccatgggattagaaaagattaggaaaagttcaaggttgtgaaaccgtc420aggaatagcctacaaccacaaggcgttctggtcaccatagtact464〈210> 11<211> 645<212> DNA<213>人工序列〈400> 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1. 乳腺特异性表达载体的构建方法，包括如下步骤1)构建DNA片段M0；M0自上游至下游依次为同源臂T1、同源臂T2、同源臂T3、同源臂T4、同源臂T5、同源臂T6；所述6个同源臂的长度均为400-600bp；同源臂T5和同源臂T6能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座3’调控区；同源臂T3和同源臂T4能通过与外源目的蛋白BAC同源重组获得完整的外源目的蛋白基因组序列；同源臂T1和同源臂T2能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座5’调控区；2)将所述DNA片段M0插入载体中，得到连续三次基因抓捕载体；3)通过与所述乳蛋白BAC进行两次同源重组、与所述外源目的蛋白BAC进行一次同源重组，将步骤2)得到的连续三次基因抓捕载体中的DNA片段M0替换为DNA片段M1，得到所述外源目的蛋白的乳腺特异性表达载体；M1自上游至下游依次为所述乳蛋白基因座3’调控区、完整的所述外源目的蛋白基因组序列、所述乳蛋白基因座5’调控区。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述乳蛋白基因座为牛、羊、猪、 马、兔、人或鼠的乳蛋白基因座。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述乳蛋白基因座为羊e-酪蛋白基因座、牛0-酪蛋白基因座、小鼠WAP基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因 座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊e-乳球蛋白基因座或牛e-乳球蛋白基因座。
4、 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述外源目的蛋白为人 血清白蛋白。
5、 一种DNA片段，自上游至下游依次为同源臂T,、同源臂L、同源臂L、同源 臂L、同源臂Ts、同源臂Te;所述6个同源臂的长度均为400-600bp;同源臂Ts和同 源臂T6能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座3'调控区；同源臂T3和同源 臂T4能通过与外源目的蛋白BAC同源重组获得完整的外源目的蛋白基因组序列；同源 臂L和同源臂T2能通过与乳蛋白BAC同源重组获得乳蛋白基因座5'调控区。
6、 一种DNA片段，自上游至下游依次为乳蛋白基因座5'调控区、完整的外源目 的蛋白基因组序列、乳蛋白基因座3'调控区。
7、 如权利要求5或6所述的DNA片段，其特征在于所述乳蛋白基因座为牛、羊、猪、马、兔、人或鼠的乳蛋白基因座；优选为羊e-酪蛋白基因座、牛e-酪蛋白基因座、小鼠WAP基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊P -乳球蛋白基因座或牛P -乳球蛋白基因座。
8、 如权利要求5至7中任一所述的DNA片段，其特征在于所述外源目的蛋白 为人血清白蛋白。
9、 携带有权利要求5至8中任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细 胞系和重组菌。
10、 权利要求1至4中任一所述方法、权利要求5至8中任一所述DNA片段或权 利要求9所述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌在制备乳腺生物反应器中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种乳腺特异性表达载体及其构建方法。本发明提供的乳腺特异性表达载体的构建方法，包括如下步骤1)构建DNA片段M₀；M₀自上游至下游依次为同源臂T₁-T₆；2)将M₀插入载体，得到连续三次基因抓捕载体；3)通过三次同源重组，T₅和T₆抓获乳蛋白基因座3’调控区；T₃和T₄抓获完整的外源目的蛋白基因组序列；T₁和T₂抓获乳蛋白基因座5’调控区。本发明得到了乳蛋白-目的蛋白的杂合基因座，杂合基因座内包含乳蛋白上下游表达调控序列，中间是外源目的蛋白的基因组序列。本发明将为动物乳腺个体表达系统注入新的活力，有力促进乳腺生物反应器表达系统的推广运用。
文档编号A01K67/027GK101265483SQ20081010501
公开日2008年9月17日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者吴晓洁, 周颜荣, 施庚寿, 陈红星, 黄培堂 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所