专利名称：小鼠Leptin超表达载体的构建及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种小鼠L印tin基因超表达载体的构建方法及用 途。
背景技术：
L印tin是由肥胖基因(ob)编码，由脂肪细胞分泌的一种蛋白类激素。它由167个 氨基酸组成，分子量为16KD，它进入血液循环后，N末端的21个氨基酸的信号肽被去除，形 成含146个氨基酸的成熟瘦素，在血液中游离或与瘦素结合蛋白结合，到达中枢和外周与 多种受体结合而发挥生物学效应。L印tin具有广泛的生物学效应，可调节摄食、能量利用、 生长、繁殖和免疫等生物学过程，而且可能在动物脂肪沉积和肌肉发育中起着关键的调控 作用。因此，开展Leptin在动物脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。基因超表达就是采用强启动子和增强子等调控元件增强基因的表达量，能特异、 高效地表达特定基因，已经成为研究基因功能的一种有力工具。由于超表达载体pVR-mob 的构建，可以特异性地使L印tin表达量增强，因此超表达载体pVR-mob可以作为一种用于 功能基因组的研究强有力的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过亚克隆技术构建小鼠度素(Leptin)超表达载体的 方法，通过以下步骤实现(1) 含有小鼠 1 印tin基因的pBlue-script-mob质粒禾口含有小鼠 erythropoietn 基因的pVR mEPO表达质粒进行Ml I和Bgl II双酶切反应，得到mob和pVR载体的特异 性片段，即得到小鼠mob DNA片段；反应条件如下
1)pBlue-script-mob1 μ 1
Bgl II1 μ 1
Sal I1 μ 1
H(Buffer)1 μ 1
TE(Ruffer)6 μ 1
总量10 μ 1
2)pVR1 μ 1
Bgl II1 μ 1
Sal I1 μ 1
H(Buffer)1 μ 1
TE (Buffer)6 μ 1总量10 μ 1按上述反应体系增大反应量，37度的水浴中孵育1小时。对反应物用的琼脂凝胶电泳。用DNA纯化试剂盒对1印tin、PVR DNA片段进行纯化，分别得到大小为500bp的 mob基因片段及4900bp大小的pVR载体片段； (2)将小鼠L印tin DNA片段通过DNA连接试剂盒进行连接反应，连接到pVR表达 载体上；连接反应条件如下试管1 试管2试管3
Leptin DNA(41. 23ng/μ 1)1510 μ 1
ρVR DNA (345. 96ng/ μ 1)111 μ 1
IOXbuffer222μ 1
IOOmM ATP111 μ 1
ddH2021394μ 1
LiRase222μ 1
总体积20 μ 1
将反应液放置在4度过夜，分别取5μ 1反应液分别加到210 μ 1大肠杆菌菌液并
放置在冰上30分钟，然后再42度孵育90秒再度冰上冷却。加入含0. 02MMgCl2的LB培养 基800 μ 1在37度震荡培养1小时，取少量菌液涂布在Kanamycin抗生素平板上并培养M 小时，对形成的单克隆用PCR反应进行筛选，PCR反应条件为PCR反应条件94度1分钟变 性，55度1分钟退火，72度延长，30个循环。用1. 2%的琼脂糖凝胶电泳并观察是否有327bp 大小的特异性条带。L印tin的特异性引物正向5' -GAC CCC TGT GTC GGT TCC TGT-3'； 反向5' -GCT TCT GCA GGC CAC TGG TCT-3'。将阳性克隆进行少量增幅培养、质粒提取 酶切鉴定。进一步对插入片段进行序列分析。L印tin的特异性引物为正向5' -ATG TGC TGG AGA CCC CTG TG-3'插入片段的序列分析结果如下ATGTGCTGGAGACCCCTGTGTCGGTTCC TGTGGCTTTGGTCCTATCTGTCTTATGTTCAAGCAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGGATGACACCAAAACCCTCATC AAGACCATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCGGTATCCGCCAAGCAGAGGGTCACTGGCTTGGA CTTCATTCCTGGGCTTCACCCCATTCTGAGTTTGTCCAAGATGGACCAGACTCTGGCAGTCTATCAACAGGTCCTCA CCAGCCTGCCTTCCCAAAATGTGCTGCAGATAGCCAATGACCTGGAGAATCTCCGAGACCTCCTCCATCTGCTGGCC TTCTCCAAGAGCTGCTCCCTGCCTCAGACCAGTGGCCTGCAGAAGCCAGAGAGCCTGGATGGCGTCCTGGAAGCCTC ACTCTACTCCACAGAGGTGGTGGCTTTGAGCAGGCTGCAGGGCTCTCTGCAGGACATTCTTCAACAGTTGGATGTTA GCCCTGAATGCTGA该结果与NM_008493. 3GI :34328437 提供的 cDNA 序列一致。本发明的另一个目的是提供该小鼠L印tin超表达载体在制备治疗肥胖及代谢性 综合症(糖尿病)药物中的应用。或在建立动物模型进行1印tin对糖和脂肪代谢的调节 及肌纤维生长，发育的影响研究中的应用。作为本发明的小鼠L印tin超表达载体的用途，通过以下步骤实现(1)将含小鼠Leptin超表达载体的大肠杆菌扩大培养后，利用去内毒素试剂盒提 取高纯转染级质粒；(2)将含小鼠L印tin超表达载体的高纯转染级质粒进行小鼠体内流体效应法超 表达实验，流体效应法参数为质粒15ug，尾静脉注射超表达载体体积0. Iml/体重(g)，时 间为10s。流体效应法通过大量液体迅速进入体内，产生瞬时高压，导致肝静脉窦内皮细胞 膜产生大量小孔让质粒进入细胞内；此方法简单易行，效果明显；
(3)小鼠尾静脉注射超表达载体，一周后，分析pVR-mob超表达载体对L印tin及 脂肪代谢，肌纤维生长发育的关键功能基因SIRTl、LPL、ATGL、PGC-la, F0X03a、肌纤维分型 MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx基因表达的影响，研究L印tin的功能。本发明具有以下有益效果无需通过RACE技术克隆得到小鼠L印tin全长cDNA序 列，而是将含有小鼠mob基因的pBlue-script-mob的质粒进行Ml I和BAl II双酶切，得 到小鼠mob基因。通过将pBlue-script-mob质粒双酶切后得到的小鼠L印tin片段连接到 pVR mEPO表达载体上并转化大肠杆菌DH5 α，构建得到pVR-mob超表达载体的重组质粒，构 建好的pVR-mob超表达载体对L印tin具有很好的增强基因表达量的效果。本发明是利用 基因超表达技术，开拓了目前研究动物脂肪代谢调控和基因功能研究的新思路。此法所用 的超表达载体方便易得，载体构建方法简单、可行，省去普通构建方法中目的基因编码蛋白 序列的合成步骤。同时构建的超表达载体能够特异、高效地增强L印tin基因的表达，是研 究L印tin功能的一种强有力的研究技术，为开展L印tin在动物脂肪代谢和肌纤维分型的 功能研究具有重要的意义。可用于研究小L印tin基因对脂肪代谢和肌纤维分型功能产生 的影响，并为进一步研究L印tin基因的功能及调控脂肪代谢和肌纤维分型的作用途径打 下基础。
图1是pVRmob超表达载体构建后的酶切鉴定图谱。图2是pVR-mob载体及GFP载体经流体效应法导入体内后在小鼠肝脏内表达的实 体显微镜检测图。图3是pVR-mob载体在肝脏表达后1印tin基因表达和蛋白水平检测图。图4是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠血清1印tin浓度的变化。图5是pVR-mob载体在肝脏表达后一周的小鼠摄食量的变化。图6是pVR-mob载体在肝脏表达后一周的小鼠体重变化变化。图7是pVR-mob载体在肝脏表达后一周的小鼠白色脂肪和褐色脂肪变化。图8是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠腓肠肌和趾长伸肌sirtl mRNA表达水平 变化。图9是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠腓肠肌和趾长伸肌PGC_1 a mRNA表达水
平变化。图10是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠腓肠肌和趾长伸肌R)xo 3a mRNA表达水
平变化。图11是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠腓肠肌ATGL、HSL、LPL mRNA表达水平变 化。图12是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠趾长伸肌ATGL、HSL、LPL mRNA表达水平变化。图13是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠腓肠肌MyHC_I、MyHC-IIa, MyHC-IIb, MyHC-IIx mRNA表达水平的变化。图14是pVR-mob载体在肝脏表达后小鼠趾长伸肌MyHC_I、MyHC-IIa, MyHC-IIb, MyHC-IIx mRNA表达水平的变化。
具体实施例方式本发明结合附图和具体实施例作进一步详细说明。实施例1 GFP和pVRmob (图1)载体在活体小鼠肝脏中的表达为检测pVR-mob载体能否在小鼠体内进行表达，我们利用荧光蛋白GFP做为标记， 将GFP (5 μ g)，pVR-mob (15 μ g)载体混在0. lml/g鼠体重的生理盐水中，从小鼠尾静脉迅速 注射并且该过程必须在10秒内完成。进行流体效应法尾静脉注射GFP，pVR-mob载体一天 后，利用实体荧光显微镜对肝脏内GFP表达进行观察。结果参见图1和图2 对小鼠进行流体效应法尾静脉注射15ug pVR-Leptinexpression vector后，在显微镜下可以清晰地看到试验组的肝脏中有很强的 GFP绿色荧光信号。该试验结果表明GFP、L印tin已经成功导入肝细胞中。图1中M—DNA marker, 1—阳性对照，2—pVR-mob，3—阳性对照酶切，4—pVR-mob酶切，5—pVR空质粒酶 切。图2中箭头所示的绿色荧光信号即为GFP实施例2 pVR-mob在肝脏中表达后L印tin mRNA和L印tin蛋白水平变化为检测pVR-mob载体是否在肝脏内过度表达，我们对通过流体效应法导入 pVR-mob载体的小鼠肝脏中1印tin mRNA表达及蛋白水平利用RT-PCR和Westernblotting 进行检测。进行实验5-6周龄的ICR系雄性小鼠6只，随机分为2组，每组3只，分别为对 照组和实验组。采用流体效应法尾静脉注射15ug pVR-mob，小鼠饲喂1天后解剖。取肝脏 50mg用Trizol试剂抽提总RNA并用分光光度计在^Onm的波长测定浓度，用IygS RNA做 RT反应合成cDNA。以cDNA为模板通过PCR反应。PCR反应条件94度1分钟变性，55度1 分钟退火，72度延长，30个循环。用1. 2%的琼脂糖凝胶电泳。Leptin的特异性引物正向 5' -GAC CCC TGT GTCGGT TCC TGT-3‘；反向5' -GCT TCT GCA GGC CAC TGG TCT-3‘。 取肝脏20mg用裂解液(l%triton X-100,0. 5% sodium deoxycholate,0. l%SDS,and 2mM EDTA)收集细胞。用SDS-PAGE将蛋白分离，然后将蛋白转到PVDF膜上，孵一抗，然后再孵连 有腊根过氧化物酶的二抗。用试剂盒(Amersham，GE Healthcare, Tokyo, Japan)显影。结果参见图3 RT-PCR结果表明试验组的肝脏1印tin mRNA表达水平明显比对照 组要高，大小为372bp。Western Blotting结果表明试验组的肝脏1印tin蛋白条带比对照 组要亮，大小为16kDa。这说明小鼠1印tin mRNA和1印tin蛋白已经成功在肝脏中表达。实施例3 pVR-mob超表达载体在小鼠肝脏内表达后对血清中L印tin的影响为检测pVR-mob进入肝脏细胞后，已合成1印tin蛋白是否可以分泌进入血液，对 经空载体和pVR-mob用流体效应法导入的小鼠，分别于注射后第1天和第7天，采取对照组 及试验组小鼠的血清，用mouse ELISA试剂盒测定小鼠血清中1印tin的浓度变化。结果参见图4 注射质粒后第1天，试验组小鼠血清中1印tin的浓度明显比对照 组要高(P < 0.01)，第7天，实验组小鼠血清也比对照组要高，但差异不显著(P > 0. 05)。 该结果表明pVRmob导入肝脏后迅速大量合成1印tin并分泌进入血液，使血液中1印tin浓 度达到高峰，但是肝脏内1印tin的合成持续时间短，在一周内血液中1印tin浓度恢复到正
6常水平。图4中**表示P < 0. 01，差异极其显著；ns表示P > 0. 05，差异不显著；实施例4 :pVR-mob载体导入小鼠后对小鼠摄食量及体重的影响为检测1印tin对小鼠摄食量、体重的影响，经空载体和pVR-mob用流体效应法导 入的小鼠进行为期7天摄食量和体重的观察。结果参见图5，6 流体效应法注射1印tin超 表达质粒后，和对照组相比，实验组的小鼠摄食量明显减少，在PVRmob导入体内后第一天， 第五天和第七天出现显著性差异(P < 0. 01)。体重明显呈下降趋势(P < 0. 01)。图5中 **表示P < 0.01，差异极其显著；图6中**表示P < 0.01，差异极其显著。实施例5 :pVR-mob载体导入小鼠后对小鼠脂肪的影响经空载体和pVR-mob用流体效应法导入的小鼠饲喂一周，取小鼠白色脂肪组织和 褐色脂肪组织并称重。结果参见图7 注射质粒第7天，解剖小鼠，发现实验组小鼠白色脂肪和褐色脂肪 减少。白色脂肪显著低于对照组(P < 0. 01)，但褐色脂肪没有显著性差异(P > 0. 05)。图 中**表示P < 0.01，差异极其显著。实施例6 =Leptin对肌肉中脂肪沉积相关基因的影响为检测1印tin对肌肉中脂肪沉积相关基因的影响，进行实验5-6周龄的ICR系 雄性小鼠20只，随机分为2组，每组10只，分别为对照组和实验组。采用流体效应法尾静脉 注射15ug pVR-mob表达载体，小鼠饲喂1周后解剖。用RT-PCR对肌肉样品进行分析。所 使用的特异性引物如下SIRTlSense,5' -CAGACCCTCAAGCCATGT TT-3'
Antisense,5‘--ACACAGAGACGGCTG GAA CT
PGC-ISense, 5' -CCG AGAATTCATGGACA AT-3'
Antisense,5' -GTGTGAGGAGGGTCATCG TT-3'
Foxo3aSense, 5' -ATG GGAGCTTGGAATGTGAC-3'
Antisense,5' -CCACATTCAAACCAACAA CG-3'
18srRNASense, 5' -GTA ACCCGTTGAACCCCATT-3'
Antisense,5' -CCATCCAATCGGTAGTAG CG-3'
ATGLSense, 5' -AAC ACCAGCATCCAGTTCAA-3'
Antsense,5' -GGT TCA GTA GGC CAT TCC TC-3'
HSLSense, 5' -TGA GATGGTAACTGTGAGCC-3'
Antsense,5' -ACT GAG ATT GAG GTG CTG TC-3'
LPLSense, 5' -CTG GGCTATGAGATCAACAAG GT-3'
Antsense,5' -AGG GCA TCT GAG AGC GAG TCT-3' 结果注射1印tin超表达质粒后第7天，试验组腓肠肌SIRTl mRNA表达水平和 对照组相比，无明显变化(P > 0. 05)，趾长伸肌SIRTl mRNA表达水平比对照组高，差异 显著(61.45%，P < 0.05)(见图8)；试验组腓肠肌PGC-Ia mRNA表达水平比对照组高， 差异显著(104.67%，P < 0.05)，趾长伸肌PGC-Ia mRNA表达水平比对照组高，差异及其 显著(61. 73%，P < 0. 01)(见图9)；试验组腓肠肌F0X03a mRNA表达水平比对照组高， 差异显著03.73%，P < 0.0 ；趾长伸肌fox03a mRNA表达水平与照组相比，无明显变 化(7. 68%，P > 0. 05)(见图10)；试验组腓肠肌LPL mRNA表达水平比对照组高，差异极其显著(80. 09%, P < 0. 01) ；ATGL、HSL mRNA表达水平比对照组高，差异显著(分别为 144. 79%、102· 43%，P < 0. 05)(见图 11)；趾长伸肌 ATGL、HSL、LPL mRNA 表达水平均比对 照组高,差异显著(162. 25%、1Μ· 69%、110· 13%，P < 0. 05)。(见图 12)。图 8 中 # 表示 P < 0.01，差异极其显著；图9中*表示P < 0. 05，差异显著，ns表示P > 0. 05，差异不显 著；图10中**表示P < 0.01，差异极其显著，*表示P < 0. 05，差异显著；图11中*表示 P < 0. 05，差异显著，ns表示P > 0. 05，差异不显著；图12中*表示P < 0. 05，差异显著。实施例7 =Leptin对肌纤维分型的影响为检测L印tin对肌纤维分型的影响，进行实验(同实施例6)。结果表明试验组腓肠肌MyHc-I mRNA表达水平比对照组高，差异极其显著(118. 75%, P
<0. 01) ；MyHc-Ila, MyHC-IIx mRNA表达水平比对照组高，差异显著(分别为93. 02%, 78. 66%, P < 0. 05) ；MyHC-IIb mRNA表达水平比对照组低，差异极其显著(56. 11%，P
<0. 01)(见图13)。趾长伸肌MyHC-I, MyHC-IIa, MyHC-IIxmRNA表达水平比对照组高，差 异显著(分别为140. 05%、113. 94%、24. 38%，P < 0. 05) ；MyHC-IIb mRNA 表达水平比对 照组高，但差异不显著(8.四％，P > 0. 05)(见图 14)。图13中*表示P < 0. 05，差异显著；**表示P < 0. 01，差异极显著；图14中*表 示P < 0. 05，差异显著，**表示P < 0. 01，差异极显著。PCR反应引物如下MyHC-I Sense 5' -ATA GGG GAC CGT AGC AAG AAG-3‘Ant-sense 5' -TCC TCT CAG CCT TTA GCT GGA-3‘MyHC-II a Sense 5' -CGA TGA TCT TGC CAG TAA TG-3'Ant-sense 5' -ATA ACT GAG ATA CCA GCG-3‘MyHC-IIx =Sense 5' -GGA CCC ACG GTC GAA GTT G_3'Ant-sense 5' -GGC TGC GGG CTA TTG GTT-3'MyHC-IIb :Sense 5' -CAA TCA GGA ACC TTC GGA ACA C_3'Ant-sense 5' -GTC CTG GCC TCT GAG AGC AT-3'最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种小鼠Leptin基因超表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)将含有小鼠1印tin基因的pBlue-script-mob和含有小鼠erythropoietin基因的 PVR mEPO质粒进行Ml I和Bgl II双酶切，得到小鼠mobDNA片段；(2)将pBlue-script-mob质粒双酶切后得到的小鼠mobDNA片段连接到pVR表达载体 上，得到L印tin基因超表达载体的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的小鼠Leptin基因超表达载体的构建方法，其特征在于，步骤 (2)中将小鼠mob DNA片段与pVR片段连接是采用热激转化大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的小鼠L印tin基因超表达载体的构建方法，其特征是利用 NCBI上的BLAST工具对小鼠L印tin基因进行比对。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠L印tin基因超表达载体的构建方法，其特征在于， 将步骤( 所得的小鼠L印tin基因超表达载体进行鉴定，通过以下步骤实现通过Kanamycin抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定，PCR反应的引物为正 向引物5，-GAC CCC TGT GTC GGT TCC TGT-3，；反向引物5，-GCT TCTGCA GGC CAC TGG TCT-3，；测序引物为正向引物:5，-ATG GGG CAC GCC CCC CAG AT-3，;反向引物:5，-CTG AGA TAT AAC GAT GAG AC-3'。
5.根据权利要求1所述方法所得的小鼠L印tin基因超表达载体在制备治疗肥胖及代 谢性综合症药物中的应用，所述代谢性综合症为糖尿病。
6.根据权利要求1所述方法所得的小鼠L印tin基因超表达载体在建立动物模型进行 1印tin对糖和脂肪代谢的调节及肌纤维生长，发育的影响研究中的应用。
全文摘要
本发明提供一种通过亚克隆技术构建小鼠Leptin超表达载体的方法，通过将pBlue-script-mob质粒双酶切后得到的小鼠Leptin片段连接到pVR表达载体上并转化大肠杆菌DH5α，构建得到pVR-mob超表达载体的重组质粒，构建好的超表达载体对Leptin具有很好的增强基因表达量的效果。本发明的载体构建方法简单、可行，构建的超表达载体能够特异、高效地增强Leptin基因的表达，为开展Leptin在动物脂肪代谢和肌纤维分型的功能研究具有重要的意义。本发明提供的超表达载体可在制备治疗肥胖及代谢性综合症(糖尿病)药物中的应用。也可在建立动物模型进行糖和脂肪代谢的调节及肌纤维生长，发育的影响研究中的应用。
文档编号C12N15/63GK102061304SQ20101055573
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者向兰, 戚建华, 汪以真, 黄艳娜 申请人:浙江大学