一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种植物质体表达载体的构建方法及应用。

背景技术：

近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化与核基因转化相比有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无载体序列、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，特别2015年3月份在sciences上关于长链dsrna抗马铃薯甲虫方面的研究(jiangzhang,2015)，可以预见质体基因转化将在植物植保方面发挥着重要作用。

近年来，克隆技术飞快发展，特别是基于同源重组的无缝连接克隆方法如雨后春笋，得到了蓬勃的发展，例如thecreatorsystem，thegatewaysystem，theunivectorsystem，gibsonassedblysystem，in-fusiontm-assembly无缝工程，无酶克隆(seamlessenzyme-freecloning，sefc)，sequence-andligation-independentpcr克隆方法，magic-mating-assistedgeneticallyintegratedcloning,multiplednafragmentswithshortendhomologies。

合成生物学自诞生之日起就备受人们关注。合成生物学的目的在于简化复杂的自然生物系统，将其变为简单、可靠、质量可控的模块或者零件。随着引物合成、基因合成和测序等技术的进步。人工合成dna价格的大幅下降，使得经过密码子优化的基因、启动子及其他调控元件的使用更加广泛，甚至出现了完全由人工合成的基因组。高通量测序技术的快速发展使得测序的速度空前提高，使得测序成本也持续下降，不断有新的物种基因组数据被公开。基因元件功能表征和标准化是设计和构建具有新特征生物的关键步骤，越来越多的基因元件被构建和测试。

目前植物质体转化载体的构建方法有通过定点诱变掉同源片段的限制性酶切位点来增加多克隆位点区的限制性酶切位点构建质体转化载体的方法(sugeyramonasinagawa-garcía,2009)，还有通过gateway系统来构建质体转化载体的方法(johannagottschamel,2013)。

dna导入质体的方法有许多，如花粉管导入法、农杆菌介导转化法、peg介导转化法、激光微束转化法和基因枪法，最常用的是基因枪法。

技术实现要素：

本发明提出了一种植物质体表达载体的构建方法及应用，通过合成生物学技术进行多元件表达盒的构建，运用无酶克隆技术把多个构件一步法克隆到大肠杆菌中，从而节省成本，加快质体表达或转化载体的构建的速度，并通过基因枪法把dna定点导入到质体基因组中，并成功表达。将多个基因表达盒或具有长链双向启动子结构的dsrna和sirna简单有效地组装到一个质体转化载体中，构成多基因或多表达盒结构的质体转化载体，为质体基因工程研究和应用提供有效的工具。

其技术方案如下：

一种植物质体表达载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、gfp表达盒组装：gfp表达盒是由来源于烟草rrna操纵子的启动子prrn和来源于t7噬菌体的t7g10序列组成的强启动子、来源于水母aequoreavictoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的变异gfp基因和来源于大肠杆菌rrnb终止子序列组成，利用计算机辅助设计把这3个片段设计组合在一起通过基因合成gfp表达盒，gfp表达盒序列见序列表，如seq:id:no:1所示；

步骤2、aada表达盒组装：aada表达盒是由来源于莱茵衣藻的psba基因的启动子ppsba、来源于细菌的aada基因和来源于莱茵衣藻的rbcl基因终止子序列和两端同向的loxp序列组成，如seq:id:no:2所示；

步骤3、质体同源片段克隆：由质体基因组psab基因的部分序列、rps14基因序列和trnfm基因序列组成的质体左同源片段，由质体基因组psbz基因序列trnfm基因序列组成的质体右同源片段，质体转化的插入位点为trnfm和trng之间的非编码区，左同源序列和右同源序列见序列表，如seq:id:no:3、seq:id:no:4所示；

步骤4、大肠杆菌表达载体骨架的克隆：为去多克隆位点mcs的质粒pbluescriptiisk(+)序列，大肠杆菌表达载体骨架序列见序列表，如seq:id:no:5；

步骤5、构建植物质体表达载体：把合成的gfp表达盒、合成生物学合成的aada表达盒、质体左同源片段、质体右同源片段和大肠杆菌转化载体骨架这5个片段通过无酶克隆技术(图5就是无酶克隆技术的步骤)一步法克隆到大肠杆菌xl10-gold宿主菌中，在感受态细胞效率在2*10⁸个/μg时，能到19个的阳性克隆，经测序验证后均正确。

本发明所述的植物质体表达载体在dna导入质体过程中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种一步法质体多基因表达载体或转化载体的构建方法，将多个基因表达盒或者长链dsrna或sirna双向启动子结构简单有效地组装到一个质体转化载体中，构成多基因或多表达盒质体转化载体，同时为其他载体的构建提供了一种简单、快速有效的构建方法，并为质体基因工程研究和应用提供有效的工具。

附图说明

图1为gfp表达盒构建图；

图2为aada表达盒构建图；

图3为左同源片段和右同源片段以及外源基因插入位点；

图4为质粒pbluescriptiisk(+)去除mcs图mcs为多克隆位点序列；

图5为无酶克隆图；

图6为5片段连接转化大肠杆菌阳性克隆图白色箭头所指的发绿色荧光的菌落均为阳性克隆；

图7为质体转化载体一步法构建图；

图8为southernblot验证图，图8a图示了探针所在的位置，还图示用限制性内切酶bglii酶切野生型烟草总dna，可以得到包含左右同源片段与探针杂交后片段大小为3491bp，质体转基因烟草植株的总dna经过bglii酶切后，可以得到包含左右同源片段与探针杂交后片段大小为6301bp；图8b为用地高辛标记的southernblot试剂盒得到的图谱，得到了预期的片段，其中，泳道1为野生型烟草总dna经bglii酶切后与地高辛标记的探针杂交的信号，泳道2、泳道3和泳道4为转基因烟草总dna经bglii酶切后与地高辛标记的探针杂交的信号，泳道5为dna标准分子量标记；

图9为种子测试图，图中nt-wt为野生型烟草，nt-pyy12#1、nt-pyy12#3和nt-pyy12#5为质体转基因烟草的3个株系，质体转基因烟草种子在含有壮观霉素(spec)抗性培养基中均正常生长，而野生型烟草种子则全部白化，而野生型烟草种子在无壮观霉素的条件下正常生长；

图10为野生型烟草和转基因烟草在组培室培养3周和6周时以及在温室培养3周和6周时植株的生长情况图；

图11为质体转gfp烟草植株叶绿体荧光图，其中图11a为在激发光在488nm下观察的gfp发荧光，图11b为在激发光700nm下叶绿体自发荧光，图11c为二者重叠后的荧光图；

图12为质体转gfp植株表达总可溶性蛋白图，泳道1为marker为蛋白质标准分子量,泳道2为5μg野生型烟草可溶性蛋白，泳道3、泳道4和泳道5为5μg质体转gfp基因烟草可溶性蛋白，泳道6、泳道7、泳道8、泳道9和泳道10代表gfp标准蛋白，泳道6为0.1μg，泳道7为0.2μg，泳道8为0.3μg，泳道9为0.4μg，泳道10为0.5μg。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

gfp表达盒组装：gfp表达盒是由来源于烟草rrna操纵子的启动子prrn和来源于t7噬菌体的t7g10序列组成的强启动子、来源于水母aequoreavictoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的变异gfp基因和来源于大肠杆菌rrnb终止子序列组成。通过genbank搜索这3个片段的dna序列，利用计算机辅助设计把它们组合在一起，通过基因合成gfp表达盒。具体设计见图1。gfp表达盒序列见序列表，序列1。

实施例2

aada表达盒组装：aada表达盒是由来源于莱茵衣藻的psba基因的启动子ppsba、来源于细菌的aada基因和来源于莱茵衣藻的rbcl基因终止子序列和两端同向的loxp序列组成。通过genbank搜索这5个片段的dna序列，利用计算机辅助设计把它们组合在一起，通过基因合成aada表达盒。具体设计见图2。aada表达盒序列见序列表，序列2。

实施例3

质体同源片段克隆：由质体基因组psab基因的部分序列、rps14基因序列和trnfm基因序列组成的质体左同源片段，由质体基因组psbz基因序列trnfm基因序列组成的质体右同源片段。质体转化的插入位点为trnfm和trng之间。设计1对引物p1(5'gccttgctctagcttctttagggg3')和p2(5'aaccctaaaatagtttggcaaaacaag3')，以提取的烟草的总dna为模板，通过pcr扩增左同源序列，把得到的片段克隆到克隆载体pmd18-t上，把阳性克隆测序验证，设计1对引物p1(5'gccttgctctagcttctttagggg3')和p2(5'aaccctaaaatagtttggcaaaacaag3')，以提取的烟草的总dna为模板，通过pcr扩增左同源序列，把得到的片段克隆到克隆载体pmd18-t上，把阳性克隆测序验证后获得左同源序列；设计1对引物p3(5'actagtaattaattcccgcctttcgc3')和p4(5'tgattagcgtacccgttgtatttgc3')，以提取的烟草的总dna为模板，通过pcr扩增左同源序列，把得到的片段克隆到克隆载体pmd18-t上，把阳性克隆测序验证后获得右同源序列。具体设计见图3。左同源序列和右同源序列见序列表，序列3和序列4。

实施例4

大肠杆菌表达载体骨架的克隆：为去多克隆位点(mcs)的质粒pbluescriptiisk(+)序列。具体设计见图4。大肠杆菌表达载体骨架序列见序列表，序列5。

实施例5

一步法构建植物质体表达载体：利用计算辅助设计把合成生物学技术合成的gfp表达盒、利用合成生物学合成的aada表达盒、质体左同源片段、质体右同源片段和大肠杆菌转化载体骨架这5个片段合理地组合在一起。

具体构建如下：设计一对引物p5(5'gagaagcaaatacaacgggtacgctaatcaccagcttttgttccctttagtgagg3')带有30bp的左同源序列和p6(5'taataacccctaaagaagctagagcaaggctccaattcgccctatagtgagtcg3')，带有30bp的右同源序列以质粒pbluescriptiisk(+)为模板，通过pcr扩增去除多克隆位点(mcs)的质粒pbluescriptiisk(+)得到片段，命名为片段1；设计引物p7(5'gtaatacgactcactatagggcgaattggagccttgctctagcttctttagggg3')带有30bp的质粒pbluescriptiisk(+)序列和p8(5'tccagcttttgttccctttagtgagggttaaaccctaaaatagtttggcaaaacaag3')带有30bp的gfp表达盒序列，以烟草叶绿体基因组dna为模板，克隆左同源序列，命名为片段2；设计引物p9(5'ttcgtatagcatacattatacgaagttatactagtaattaattcccgcctttcgc3')带有30bp的aada表达盒序列和p10(5'ttaaccctcactaaagggaacaaaagctggtgattagcgtacccgttgtatttgc3'

)带有30bp的质粒pbluescriptiisk(+)序列，以烟草叶绿体基因组dna为模板，克隆右同源序列，命名为片段3；以基因合成的aada表达盒序列为模板，设计一对引物p11(cttcgtatagcatacattatacgaagttataagaaaagtgagctattaacgcgtcc3')带有30bp的gfp表达盒序列和p12(5'aaagcgaaaggcgggaattaattactagtataacttcgtataatgtatgctatacgaag3')带有30bp的右同源序列，通过pcr扩增得到片段，命名为片段4；以基因合成的gfp基因表达盒序列为模板，设计一对引物p13(5'catcttgttttgccaaactattttagggtttaaccctcactaaagggaacaaaagc3')带有30bp的右同源序列和p14(5'ataggacgcgttaatagctcacttttcttataacttcgtataatgtatgctatacgaag3')带有30bp的aada表达盒序列通过pcr扩增得到片段，命名为片段5，把这5个片段通过无酶克隆的方法(见图5)克隆到大肠杆菌xl10-gold中(把这5个片段按1:2:2:2:2的比例混匀，然后加入50微升的大肠杆菌xl10-gold感受态细胞中，最后涂布相应的抗生素平板)，在感受态细胞效率在2*10⁸个/μg左右时，能到19个左右的阳性克隆，见图6，通过表型，抗性和测序验证正确，从而得到正确的质体通用表达载体。具体设计见图7。

实施例6

基因枪法转化质体：用qiagen质粒中提试剂盒(qiageninc.,valencia,ca)提取质粒pyy12dna，用0.6μm的金粉包裹dna通过基因枪(bio-rad)去轰击4周左右的柔嫩烟草叶片，轰击后的叶片切除5*5mm²大小放到含有0.1mg/lnaa和500mg/l的壮观霉素的培养基中培养，1个月之后发现长处5个抗性芽，把抗性芽转到生根培养基中，提取叶片总dna通过southernblot验证发现3个抗性苗是阳性苗，而且达到了同质化，见图8，做种子测试后，发现野生型烟草种子在500mg/l壮观霉素条件下白化，而转基因烟草种子在500mg/l壮观霉素条件下全部发芽而且均正常生长，表明转基因烟草植株达到了同质化，见图9，以上两种检测均表明外源基因成功导入到质体基因组中，且达到同质化。外源基因可以在无抗性条件下稳定遗传，转基因植物与野生型一样可以正常生长且无明显差异。见图10。

实施例7

gfp基因在质体中表达：gfp基因在质体中实现高水平的表达，激光共聚焦显微镜证实了gfp的存在于叶绿体中，见图11，通过sds-page法验证了gfp蛋白的表达量达到总可溶性蛋白的9％左右。见图12。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

sequencelisting

<110>湖北大学

<120>一种植物质体表达载体的构建方法及应用

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