河南华溪蟹生殖标记基因vasa及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及河南华溪蟹(sinopotamonhenanense)一种生殖标记基因，具体为生殖细胞特异表达基因vasa的全长cdna克隆及其应用。

背景技术：

甲壳动物十足目(decapoda)短尾次目(brachyura)中的一个特殊分支—淡水蟹(freshwatercrabs)，终身生活在淡水环境中。溪蟹是野生水资源中广泛分布的淡水蟹类，其生殖发育方式与其它十足动物存在显著差异。溪蟹卵粒特别大，产卵量小，卵壳厚，胚胎直接发育，卵内变态。而大多数海蟹和洄游性绒螯蟹卵粒非常小，产卵量很大，卵壳薄，胚胎间接发育。

然而，迄今为止，溪蟹的生殖发育调控方式尚不清楚，其人工繁殖一直无法掌控。主要原因是溪蟹的生殖规律仍属未知，如溪蟹卵子发生过程中的细胞学规律如何？生殖细胞是否发育良好，其质量如何？哪些重要分子在卵子发生中发挥关键作用？因此，在溪蟹中鉴定并开发生殖标记分子，成为解决相关问题的有效快捷手段。

基因vasa所编码的蛋白为atp-依赖的rna解旋酶dead-box家族蛋白。vasa蛋白具有非常保守的结构域：n端rgg(arg-gly-gly)重复序列和解旋酶核心结构，包含dead-box的8个保守结构域，分别为dexdc和helicc结构域。解旋酶的核心结构不仅在rna解旋中发挥关键作用，而且解旋酶活性本身为vasa蛋白在生殖质中定位所必须。

基因vasa最早是在果蝇中被发现，在生殖细胞中特异表达。在模式生物中，vasa已被作为生殖标记分子广泛用于生殖细胞的迁移、分化和发生等研究。vasa蛋白的生物学功能也已在模式生物中得到证实。蛋白功能的研究表明，vasa蛋白作为参与生殖细胞中如转录、pre-mrna剪切、rna转运、翻译起始、核糖体生物发生等几乎所有rna的代谢过程。研究表明，突变果蝇vasa基因导致生殖细胞分化异常、卵子发生缺陷，并引起雌性个体不育。突变小鼠vasa基因，导致卵巢不育，造成精子发生过程被阻断、精子缺失。

甲壳动物中，如中华绒螯蟹(eriocheirsinensis)、拟穴青蟹(scyllaparamamosain)、日本沼虾(macrobrachiumnipponense)、罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)、凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)和中国明对虾(fenneropenaeuschinensis)等不同物种中分别克隆了生殖基因vasa。尽管，vasamrna在这些物种中都特异存在于生殖细胞中，但是vasa基因和蛋白的序列与结构因物种不同而存在着明显差异。中华绒螯蟹中克隆了2369bp的vasa基因全长cdna，包含dead-box蛋白家族的8个保守结构域和两个锌指结构(cchc)和一个q-结构域。利用race-pcr方法，在拟穴青蟹中克隆了2,851bp的vasa基因全长cdna。

目前，有关溪蟹的基因组数据非常缺乏，生殖分子的信息几乎未知，因此，对了解溪蟹的特殊生殖方式，指导溪蟹的生产繁殖及保护溪蟹的种质资源等理论、实践中带来诸多不便，亟待寻找并开发一种生殖标记，为溪蟹人工繁殖中确定生殖细胞的状态和发育质量提供便捷有效的检测手段。

河南华溪蟹，属于甲壳纲，十足目，短尾次目，华溪蟹科，不仅是重要的资源动物，而且在水生态环境保护中，已被用作水环境污染监测的指示生物。虽然，课题组在河南华溪蟹中对部分vasa基因进行了分离，但是，所获得的序列仅为vasa的部分序列。涉及编码重要功能域的序列，以及决定vasa在不同细胞中的表达和定位的3’utr序列仍未获得(李怡婷，河南华溪蟹生殖调控基因vasa的克隆和原核表达，2016，硕士论文，王兰，孙敏)。因此，到目前为止，在具有特殊生殖发育方式的溪蟹中，有关基因vasa的分离仍待进一步研究。

技术实现要素：

本发明目的是为探索溪蟹的特殊生殖和发育机制提供一种生殖细胞特异表达的标记分子-基因vasa及其在表达鉴定中的应用。本发明为溪蟹生殖细胞的鉴定和分期提供快捷准确的方法。

本发明的另一目的是获得河南华溪蟹基因vasa的全长cdan序列和完整的蛋白序列，进而鉴定其物种特有的结构特征，分析决定其在河南华溪蟹中表达定位的序列特征。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：

首先，依据已公布的甲壳动物中vasa基因和蛋白序列的保守结构域，设计引物，如序列表seqidno.3和4所示，pcr克隆获得河南华溪蟹vasa的部分核苷酸序列。其次，选取河南华溪蟹早期性腺组织，制备smartcdna，采用race-pcr方法，在获得的保守序列的基础上，设计基因特异引物，如序列表seqidno.5-8所示，分别克隆河南华溪蟹vasa基因的5’端和3’端序列，连接、转化、测序、拼接获得vasa的cdna全长，其核苷酸序列如序列表seqidno.1所示。使用在线分析软件对获得的核苷酸序列进行分析预测，确定克隆得到的cdna全长为基因vasa的全长。通过预测分析vasa编码的蛋白序列及其结构特征，确定其物种特异的蛋白结构。vasa编码的氨基酸序列如序列表seqidno.2所示。进一步设计特异引物，如序列表seqidno.9-12所示，通过rt-pcr方法，检测vasa在河南华溪蟹不同组织中的表达情况，揭示并鉴定河南华溪蟹基因vasa仅在性腺组织中特异表达。

本发明从河南华溪蟹卵巢或精巢组织的smartcdna文库中克隆的vasacdna全长，名称为河南华溪蟹基因vasa(s.henanensevasa,shvasa)。所述shvasa的cdna序列为序列表seqidno.1中所示的核苷酸序列。通过ncbi/genbank数据库中basiclocalalignmentsearchtool(blast)工具，blastn对核苷酸序列进行比对分析，确定获得的cdna全长为河南华溪蟹基因vasa。进一步分析显示，基因shvasa共有2929个碱基(basepairs，bp)组成；开放阅读框起始于5’端第142bp的起始密码子atg，终止于第2214bp的终止密码子taa，共包含2073bp；编码690个氨基酸残基；具有141bp的5’非翻译区和715bp的3’非翻译区。

本发明所述vasa蛋白名称为河南华溪蟹vasa蛋白(s.henanensevasa,shvasa)，其氨基酸序列如序列表seqidno.2所示。利用expasy在线分析工具protparam分析shvasa蛋白的理化性质，结果表明，shvasa蛋白由10394个原子组成，推测其分子式为c3292h5100n936o1041s25，分子量为75247.8kd；理论等电点为5.00，包含101个带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)，76个带正电荷的氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)；在其氨基酸组成中，甘氨酸比例最高，达到12.3％，天冬氨酸次之，占7.7％；shvasa蛋白的半衰期为30h，属于稳定蛋白；亲水性等级为-0.480，为亲水蛋白。通过signalp-4.1predictionserver在线工具分析，结果表明，shvasa蛋白不存在信号肽，是非分泌型蛋白。netphos2.0server软件预测shvasa蛋白的磷酸化氨基酸及磷酸化位点，结果显示，shvasa蛋白序列中包含34个磷酸化位点，其中20个磷酸化位点为丝氨酸残基，7个为苏氨酸残基，7个为酪氨酸。

所述河南华溪蟹vasa蛋白为典型的dead-box蛋白家族成员。采用ncbi/blastp，对由基因shvasa推导的shvasa蛋白序列进行保守功能域预测和蛋白相似性比对，分析结果显示，shvasa蛋白与拟穴青蟹中克隆的vasa蛋白同源性最高，一致性高达81％，其次与梭子蟹科蟳属的日本蟳(charybdisjaponica)vasa蛋白的相似性高达80％，与中华绒螯蟹中vasa蛋白的相似性达77％；功能域预测显示，shvasa蛋白序列具有2个该蛋白家族的保守功能域：deadc功能域和helicc功能域，其中包含8个dead-box的保守结构域(motif)。采用simplemodulararchitectureresearchtool(smart)在线工具分析shvasa蛋白的序列结构，结果显示，shvasa蛋白的n端具有1个锌指结构域(cchc)，2个rpt重复区(包含14个rg重复)，及1个deadc结构域和1个helicc结构域。

本发明通过rt-pcr方法，揭示并鉴定shvasa仅在河南华溪蟹卵巢和精巢组织中特异表达，而在副性腺、鳃、心、肝胰腺、肠、胃、肌肉等组织中无表达，进一步证实了基因shvasa的生殖特异性，确定其可用于溪蟹生殖标记分子的开发和应用。

本发明在我国溪蟹的代表物种-河南华溪蟹中首次克隆和鉴定了基因vasa的全长cdna序列，获得了完整的河南华溪蟹vasa蛋白序列，分析了该基因及其蛋白序列的结构特征，进一步对其表达特征进行了鉴定，证实了所述基因的生殖特异性。本发明提供的溪蟹生殖细胞的标记分子，对溪蟹的人工繁殖和野生种质资源的保护具有指导意义。

附图说明

图1河南华溪蟹基因vasa747bp保守序列的pcr扩增电泳图

图2河南华溪蟹基因vasa5’端和3’端序列的race-pcr扩增电泳图

图3signalp软件在线分析河南华溪蟹vasa蛋白序列的信号肽

图4netphos软件在线分析河南华溪蟹vasa蛋白序列的磷酸化位点

图5ncbi/blastp预测河南华溪蟹vasa蛋白的保守功能域

图6smart工具分析河南华溪蟹vasa蛋白序列的结构特征

图7vasa在河南华溪蟹不同组织中特异表达的rt-pcr检测电泳图

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的保护范围。

实施例1、河南华溪蟹基因vasa的克隆分离。

1.1河南华溪蟹vasa部分保守序列的克隆。

1.1.1性腺组织总rna提取与cdna第一链合成。

依据rneasyminikit(qiagen)试剂盒操作说明，提取发育早期的河南华溪蟹卵巢或精巢总rna。1％琼脂糖凝胶电泳检测总rna的完整性，biospectrometer微量分光光度计检测总rna浓度和纯度。按照transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix(全式金)试剂盒说明书，合成cdna第一链。

1.1.2vasa部分保守序列的克隆。

根据公共数据库中报道的甲壳动物中vasa蛋白的保守序列，查找其对应的核苷酸序列，利用primerpremier5.0软件，设计了河南华溪蟹vasa基因的pcr扩增引物，如序列表seqidno.3和4所示，分别以河南华溪蟹卵巢或精巢组织的cdna为模板，使用2×easytaqpcrsupermix(康为世纪)，在0.2ml无菌ep管中加入25μl体系进行pcr扩增，反应体系：2×estaqmastermix12.5μl，forwardprimer0.5μl，reverseprimer0.5μl，无菌水11μl，template0.5μl；pcr反应条件：94℃5min，94℃30s，58℃-62℃30s，72℃1min，72℃10min，35cycles。1.5％琼脂糖凝胶电泳，flurochemhd2凝胶成像系统检测，如图1所示，大小约750bp的电泳条带，为pcr扩增获得的部分保守序列。

1.1.3pcr产物纯化、验证及测序。

参照gelextractionkit(omega)胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收。将目的片段与t-vectorpmd19(simple)载体连接：0.2mlep管中，solutioni5μl，t-vectorpmd19(simple)0.2μl，回收产物4.8μl，共10μl反应体系；16℃连接2h；通过转化，将连接产物转入dh5a感受态细胞，氨苄培养基平板上，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆进行培养，以培养后的菌液为模板，使用2×easytaqpcrsupermix和m13通用引物，进行pcr验证；选取与目的片段大小一致的阳性克隆测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2河南华溪蟹卵巢或精巢smartcdna的制备。

依据实施例1的1.1.1中方法提取发育早期的河南华溪蟹卵巢或精巢组织的总rna，并对其完整性和纯度、浓度进行鉴定，取符合要求的总rna用于建库。按照smartscribereversetranscriptase(clontech)试剂盒说明书构建smartcdna文库，制备smartcdna，具体步骤如下：

(1)0.2mlep管中加入4μl体系，轻微振荡。体系如下：

5×first-strandbuffer2μl

dtt1μl

dntpmix1μl

(2)另取一个0.2mlep管加入以下体系以合成5’-race-readycdna：

rna1-2.75μl

5’-cdsprimera1μl

再另取一个0.2mlep管加入以下体系以合成3’-race-readycdna：

rna1-3.75μl

3’-cdsprimera1μl

(3)无菌水补足步骤(2)中的体系至3.75μl和4.75μl。

(4)混合步骤(2)、(3)中的体系，并轻微振荡离心管。

(5)72℃下孵育3min，42℃再孵育2min，冷却后14000×g离心10s。

(6)仅在5’-racecdna体系中增加1μlsmarteriiaoligo。

(7)加入5.25μl体系，体系如下：

buffermix(步骤(1))4μl

rnaseinhibitor0.25μl

smartscribereversetranscriptase1μl

(8)将该5.25μl体系加入到3’-racecdna体系(步骤(5))和5’-racecdna体系(步骤(6))中，使得整个体系为10μl。

(9)42℃孵育90min，70℃孵育10min，-20℃保存备用。

1.3race-pcr克隆河南华溪蟹vasa基因5’端和3’端。

根据实施例1的1.1.2中获得的保守序列，设计基因特异引物：gsp1，ngsp1，gsp2，ngsp2，如序列表seqidno.5-8所示；使用phusionhigh-fidelitydnapolymerase(thermo)，以5’-racecdna和3’-racecdna为模板，进行racepcr扩增。racepcr体系及pcr程序为：5’-racecdna/3’-racecdna1μl，upm(10×)5μl，preimerf1μl，preimerr1μl；buffer10μl，dntp1μl，phusion0.5μl，h2o31.5μl；98℃30s，98℃10s，62℃-66℃30s，72℃3min，72℃10min，35cycles。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，flurochemhd2凝胶成像系统检测并拍照。如图2所示，5’-race结果为大小约990bp的电泳条带，3’-race结果为大小约1600bp的电泳条带。参照实施例1的1.1.3中所述方法，回收目标产物并纯化；连接至t-vectorpmd19(simple)(takara)，转化大肠杆菌dh5a感受态细胞，挑单克隆进行pcr验证，选取与预期大小一致的阳性克隆测序，将获得的5’端序列和3’端序列进行拼接，获得河南华溪蟹基因vasa的全长cdna(序列表seqidno.1)。

实施例2、河南华溪蟹vasa基因序列和vasa蛋白序列的结构分析。

对获得的vasa核苷酸序列进行分析比对，利用ncbi/blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行同源比对；利用ncbi/orffinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)和expasy-translatetool(http://web.expasy.org/translate/)在线工具分析并预测基因编码区及其编码的蛋白序列(序列表seqidno.2)。

对预测的蛋白序列和结构进行分析。使用expasy(http://web.expasy.org/protparam/)在线软件对shvasa蛋白的氨基酸组成、基本理化性质进行分析。结果显示，shvasa蛋白的分子量为75247.8kd；理论等电点为5.00，包含101个带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)，76个带正电荷的氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)；在其氨基酸组成中，甘氨酸比例最高，达到12.3％，天冬氨酸次之，占7.7％；shvasa蛋白的半衰期为30h，属于稳定蛋白；亲水性等级为-0.480，为亲水蛋白。signalp-4.1predictionserver在线工具分析显示，shvasa蛋白不存在信号肽，是非分泌型蛋白(图3)。使用netphos2.0server软件预测shvasa蛋白的磷酸化氨基酸数及磷酸化位点，结果显示，shvasa蛋白序列中包含34个磷酸化位点，其中20个磷酸化位点为丝氨酸残基，7个为在苏氨酸残基，7个为酪氨酸(图4)。进一步利用ncbi/blastp，分析所预测的蛋白序列与已知的vasa蛋白的相似性，确定该蛋白的保守功能域，结果如图5所示，shvasa蛋白与拟穴青蟹中克隆的vasa蛋白的同源性最高，一致性高达81％，与梭子蟹科蟳属的日本蟳(charybdisjaponica)vasa蛋白的相似性高达80％，与中华绒螯蟹中vasa蛋白的相似性达77％；功能域预测显示，shvasa蛋白序列具有2个该蛋白家族的保守功能域：deadc功能域和helicc功能域，其中包含8个dead-box保守结构域(motif)。采用smart(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/job_status.pl？jobid＝1711161005170561426932342znseddwujr)在线工具，分析shvasa蛋白的序列结构特征，结果显示，shvasa蛋白的n端具有1个锌指结构域(cchc)，2个rpt重复区(包含14个rg重复)，及1个deadc结构域和1个helicc结构域(图6)。

实施例3、基因vasa在河南华溪蟹性腺组织特异表达的rt-pcr检测。

根据实施例1的1.3中获得的河南华溪蟹vasa全长序列，参考实施例2中序列分析的结果，选定河南华溪蟹vasa序列中物种特有的区段，设计定量pcr所用的基因特异引物，以rpl38基因(60sribosomalproteinl38)作为内参基因，通过定量pcr检测基因vasa在河南华溪蟹不同组织中的表达情况。

采用实施例1的1.1.1中所述方法，提取河南华溪蟹卵巢、精巢、副性腺、鳃、心、肝胰腺、肠、胃、肌肉等组织的总rna；反转录合成第一链cdna；分别以vq、r38为引物，如序列表seqidno.9-12所示；以各个组织的cdna为模板，配置反应体系：2×estaqmastermix12.5μl，无菌水10μl，vqf/r38f0.5μl，vqr/r38r0.5μl，template0.5μl，进行pcr扩增；94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃40s，72℃10min，28cycles；1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。如图7所示，在河南华溪蟹卵巢和精巢组织均有大小为284bp的特异扩增条带，而在副性腺、鳃、心、肝胰腺、肠、胃、肌肉等组织中均未检测到扩增产物。

以上实施例进一步说明了本发明的内容，所述仅为本发明的优选实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在本发明的内容和原则内，对本发明的具体方法、步骤、反应条件等做出的任何改进、修改和润饰，均属于本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>山西大学

<120>河南华溪蟹生殖标记基因vasa及其应用

<130>.

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2929

<212>dna

<213>sinopotamonhenanense

<400>1

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gtgattgggttttaagctgccatggatgaggactgggaagctgacgttggggtgggtcag180

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agccagagtggttttggtagagaaaaccgaggccagggccgtggcaggggttggggccga420

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