抗草甘膦筛选标记基因及其在玉米转基因技术中的应用

抗草甘膦筛选标记基因及其在玉米转基因技术中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗草甘膦筛选标记基因及其在玉米转基因技术中的应用。该抗草甘膦筛选标记基因G23V?EPSPS具有序列表中SEQ ID NO.1所示的碱基序列，其可用于转基因玉米阳性植株的筛选。G23V?EPSPS基因抗草甘磷能力更强，将其转入玉米中获得了具有高抗草甘膦特性的玉米品种，阳性率达到35.7％。
【专利说明】
抗草甘麟筛选标记基因及其在玉米转基因技术中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种筛选标记基因，具体地，涉及一种抗草甘膦筛选标记基因及其在 植物转基因技术中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，转基因作物的种类主要有大豆、玉米、棉花和油菜，其性状主要是抗除草剂、 抗虫、抗病等几类。其中玉米(Zea mays L.)是世界三大粮食作物之一，在农业、畜牧业和工 业中占据重要地位，全球对玉米的需求量正在不断攀升。近年来，玉米作为转基因技术主要 的研究对象受到世界各国科学家的广泛关注。应用转基因技术已获得多个可用的农艺性 状，如在玉米螟，除草剂，食根害虫的抗性以及玉米营养品质的改善等方面都取得了一定的 成果。
[0003] 尽管转基因技术在玉米中已应用较为成熟，但在转基因阳性植株的筛选过程中仍 然存在着筛选效率低，假阳性高的问题，所以探索找到一种高效筛选转基因阳性植株的方 法意义重大。当前所报道的所有转基因玉米成功案例中大部分都是以抗除草剂基因作为筛 选标记基因如bar，CP4-EPSPS等，其中CP4-EPSPS已商业化应用多年。虽然以bar，CP4-EPSPS 基因作为转基因玉米阳性植株的筛选标记基因已比较成熟且筛选效率有所改善，但在实际 转基因研究中假阳率性仍然很高，因此探索找到一个能在玉米中高效表达且高抗草甘膦的 基因对于进一步提尚转基因阳性植株的筛选效率意乂重大。

【发明内容】

[0004] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种抗草甘膦筛选标记基因及其在 植物转基因技术中的应用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0006] 一种抗草甘膦筛选标记基因，命名为G23V-EPSPS，其具有序列表中SEQ ID N0.1所 示的碱基序列；其编码序列表中SEQ ID勵.2所示的氨基酸序列。623￥4?5?5基因是对玉米 rbcS 基因叶绿体引导肽（141bp，Genbank:Y00322·l)与GenBank:GM718572·l的EPSPS基因 (1245bp)的融合序列的优化基因。
[0007] 一种包含上述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS的重组表达载体。在该重组表达 载体中还可以包括其他所需的目的基因以及驱动其表达的启动子和终止子等。
[0008] 在上述重组表达载体中，作为一种优选实施方式，由CaMV35S启动子和玉米Adhl基 因第一内含子驱动G23V-EPSPS基因的表达。
[0009] 在上述重组表达载体中，所述重组表达载体中的基础表达载体（即插入抗草甘膦 筛选标记基因 G23V-EPSPS之前的载体)是基因枪转化或农杆菌介导转化用的常规植物表达 载体。
[0010] 一种包含上述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS或上述重组表达载体的宿主细 胞。
[0011]在上述宿主细胞中，作为一种优选实施方式，所述宿主细胞为EHA105农杆菌。
[0012] 上述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS在转基因玉米阳性植株筛选方面的应用。
[0013] 在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述应用的具体方法为:将上述抗草甘膦 筛选标记基因 G23V-EPSPS导入玉米组织或细胞中，经诱导培养后再经草甘膦逐级筛选后得 到转基因玉米植株。
[0014] 在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS 导入玉米中的具体方法如下:将所述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS插入基础表达载体 中构建重组表达载体，然后将所述重组表达载体转化到玉米的组织或细胞中。重组表达载 体可通过基因枪法、使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导、农杆菌介导等常 规生物学方法转化到玉米的细胞或组织中。更优选地，通过农杆菌介导的方法转化到玉米 的细胞或组织中；进一步地，所述重组表达载体中，由CaMV35S启动子和玉米Adhl基因第一 内含子驱动G23V-EPSPS基因的表达。
[0015] 在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述经草甘膦逐级筛选是指转化后的玉 米愈伤组织经诱导培养后依次在含有草甘膦的筛选培养基、含有草甘膦的分化培养基和含 有草甘膦的壮苗培养基中进行筛选。更优选地，所述含有草甘膦的筛选培养基中，草甘膦的 浓度为2_411^/1(包括211^/1、2.511^/1、3.〇11^/1、3.511^/1、和411^/1系列） ；所述含有草甘膦的 分化培养基中，草甘膦的浓度为〇 · 6-1.5mg/L(包括0 · 6mg/L、0 · 8mg/L、1. Omg/L、1.2mg/L、 1.5mg/L);所述含有草甘膦的壮苗培养基中，草甘膦的浓度为0.2-0.8mg/L(包括0.2mg/L、 0 · 4mg/L、0 · 6mg/L、和0 · 8mg/L)。目前，采用CP4-EPSP基因对转基因植株进行筛选时，其对应 的筛选培养基中草甘膦含量为lmg/L;分化培养基草甘膦含量为0.5mg/L;壮苗培养基中草 甘膦含量为〇.lmg/L。
[0016] 本研究提供了一种具有高抗草甘膦功能和超强热稳定性的G23V-EPSPS基因作为 筛选标记基因，成功建立了玉米中G23V-EPSPS基因的遗传转化与植株再生体系。本发明以 玉米自交系501幼胚为受体材料，首先将玉米rbcS基因叶绿体引导肽（141bp)序列与 GenBank:GM718572.1EPSPS的融合序列进行优化与人工合成，并且将其克隆到表达载体 PBAC9200中；然后利用农杆菌介导法将质粒载体转入玉米幼胚中。经过愈伤诱导、草甘膦抗 性筛选和分化培养和壮苗培养最终获得14株转化再生植株。经PCR，RT-PCR检测表明，其中5 颗植株具有目的基因 G23V-EPSPS稳定整合与转录水平获得表达。随后，利用微滴数字PCR技 术对外源基因插入拷贝数进行了检测分析，分析结果表明在5株阳性转基因植株中外源基 因 G23V-EPSPS拷贝数分别为0.12，1.0，0.9，1.89，0.66，介于0-2之间。本研究成功建立了草 甘膦抗性基因 G23V-EPSPS在玉米中的遗传转化体系，为以新型高抗草甘膦G23V-EPSPS基因 作为转基因玉米筛选标记基因奠定了基础;另外，以微滴数字PCR技术代替传统的Southern blot简便快速的完成外源基因拷贝数的分析，进一步证明目的基因 G23V-EPSPS稳定整合到 了玉米基因组中。G23V-EPSPS基因抗草甘磷能力更强，将其转入玉米中获得了具有高抗草 甘膦特性的玉米品种，通过草甘膦筛选后，转基因植株的阳性率可达到35.7%。而目前以 CP4-EPSP作为筛选标记，获得的转化植株的阳性率仅为5-12 %左右，由此可见，采用本发明 的G23V-EPSPS基因作为转基因玉米筛选标记基因对玉米转基因植株进行筛选，其筛选效率 明显提升。
【附图说明】
[0017] 图1是质粒PBAC9200的T-DNA区图谱；
[0018] 其中：P35S:花椰菜花叶病毒35S RNA启动子;adhlintron:玉米adhl基因的第一个 内含子;G23V-EPSPS: G23V型5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因；Tnos:农杆菌胭脂碱 合成酶基因终止子。
[0019]图2是草甘膦筛选后的14株To代转基因玉米G23V-EPSPS基因的PCR扩增产物电泳 图；其中：M: DNA marker; +: pBAC9200阳性质粒;H20:空白对照;WT:非转基因阴性对照；1 -14:获得的转化再生植株。
[0020] 图3是微滴数字PCR引物特异性检测结果；其中（a)是内参基因，通道1-E03样品阳 性微滴数2992阴性微滴数12598;(b)是G23V-EPSPS基因，通道1-E04样品阳性微滴数2705阴 性微滴数12993。
[0021] 图4是5株转基因阳性植株RT-PCR扩增结果；（a)表示RNA完整性验证图；（b)表示 cDNA质量验证图；（c)表示G23V-EPSPS基因的RT-PCR扩增结果，其中，M: DNA marker; +: PBAC9200阳性质粒对照;H20:空白对照;WT:非转基因阴性对照；1-5:获得的5株PCR阳性植 株；由（c)图可以看出在所获得的5颗转化再生植株中，G23V-EPSPS基因都在转录水平获得 表达。
[0022] 图5是CP4-EPSPS与G23V-EPSPS基因在大肠杆菌中草甘膦抗性比较图。
【具体实施方式】
[0023]下面通过实施例对本发明中的G23V-EPSPS基因制备和应用进行详细说明。但本发 明并不限于此。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实 施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规实验条件如 Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版）（科学出版社，2002)中所述的条件，或按照试 剂制造厂家所建议的条件。
[0024]以下实施例中涉及的PCR反应用试剂、限制性内切酶购自大连宝生物公司；各种规 格的分子量标准、RNA simple total RNA kit、质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒等购自天根生化公司；EHA105农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)购自上海迈其生物 科技有限公司。
[0025] To代表示由玉米的愈伤组织得到的转基因植株。
[0026] 实施例1抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS的获得
[0027] 对来源于玉米rbcS基因叶绿体引导肽序列（即Genbank:Y00322.1中第491-631个 碱基序列，共141bp)和66他31^ :61718572.^细？3?3基因（1245&?)的融合序列根据玉米基 因组高表达基因的密码子进行优化，并在基因编码序列的5'端设计添加 BamHI位点，在编码 序列的3 '端添加 ΚρηΙ和SacI位点。添加了酶切位点的G23V-EPSPS基因由上海捷瑞生物工程 有限公司合成。合成后的EPSPS基因命名为G23V-EPSPS，碱基序列如SEQ ID N0.1所示，其 中，自5'端起第1-6个碱基序列为BamHI位点，第13-15个碱基序列ATG为翻译起始密码子，第 154-156个碱基序列ATG为EPSP翻译起始密码子，第1393-1395个碱基序列TAG为终止密码 子，第1397-1402个碱基序列为SacI位点，第1403-1408个碱基序列为ΚρηΙ位点，其编码的氨 基酸序列如SEQ ID勵.2所示。优化后的623￥4?5?5基因碱基共计为1408匕？，翻译蛋白氨基 酸序列为460个。
[0028] 将合成的G23V-EPSPS基因连接到质粒pGH上，形成pGH-G23V重组质粒，其由上海捷 瑞生物工程有限公司完成。
[0029]实施例2合成的G23V-EPSPS基因在大肠杆菌(E.Coli)的草甘膦抗性 [0030] 将含有目的基因 G23V-EPSPS的质粒pGH-G23V和含有CP4型EPSPS基因的质粒pGH- CP4(由上海捷瑞生物工程有限公司制备)分别转入不同的大肠杆菌DH5a中，将G23V-EPSPS 基因与CP4型EPSPS基因进行比较，检测在大肠杆菌中G23V-EPSPS基因与CP4型EPSPS基因的 草甘膦抗性。具体实验步骤如下：
[0031] 1)将质粒pGH-G23V，pGH-CP4通过热击法转入不同大肠杆菌DH5a中，在含有50mg/L 氨节青霉素的固体LB培养基上37 °C过夜培养。
[0032] 2)分别挑取单菌落于含有50mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中37°C过夜培养，然 后提质粒进行酶切验证，验证无误后分别进行保菌，于-80度保存。
[0033] 3)将-80度保存的含有质粒pGH-G23V，pGH-CP4的菌分别用10ml M63液体培养基37 °C230rpm过夜培养，培养基中都加入氨苄青霉素，氨苄青霉素浓度为50mg/L;同时将DH5a感 受态细菌也用10ml M63液体培养基37°C 230rpm过夜培养，培养基中不加入任何抗生素，作 为对照。
[0034] 4)第二天同一时间将三组试验取出摇床，分别检测三组的0D6QQ值，并用Μ 63液体 培养基将三组OD600值都稀释成1.00备用。
[0035] 5)分别取上述三组各10yL置于含有草甘膦浓度为0、1、2、3、和4g/L的Μ63液体培养 基，37 °C 230rpm条件下培养，每个浓度设三个重复，培养25h后分别测定0D6QQ值，测定的菌液 OD60Q值如下表1。
[0036] 表1三组试验中菌液的OD6q0值
[0037]
[0038] 6)对每组实验三个重复值求算数平均值，然后比较三组试验草甘膦抗性强度大 小，结果参见图5。实验结果表明：不含外源EPSP质粒的空对照DH5a菌株，在含有草甘膦的培 养基即停止生长，可以看出含有质粒PGH-G23V的菌在不同草甘膦浓度下0D6QQ值都明显高于 对应浓度下的PGH-CP4菌，尤其是草甘膦浓度高于lg/L时，pGH-CP4菌几乎停止生长，而pGH-G23V菌仍然能够生长。充分的说明了 G23V-EPSPS基因具有较高的抗草甘膦能力。
[0039] 实施例3重组表达载体pBAC9200的构建
[0040]由上海捷瑞生物工程公司合成的PGH-G23V质粒，用BamHI/Kpnl双酶切，回收 1.4kbp大小的目的基因，然后将该目的基因插入到pBAC823载体（构建方法参见发明专利 ZL201110294326.6)的BamHI/Kpnl位点之间，即获得以CaMV 35S启动子与玉米Adhlintronl 驱动目的基因 G23V-EPSP的表达载体pBAC9200(碱基数量5895bp)，其T-DNA区图谱参见图1。 [0041 ] 实施例4pBAC9200转化玉米 [0042]遗传转化及植株再生过程所需的培养基如下：
[0043] 侵染液:N6基础培养基+68 · 5g/L蔗糖+36g/L葡萄糖+0 · 7g/L脯氨酸+0 · 5g/L MES (2-吗啉乙磺酸)+2mg/L 2,4-D(2,4_二氯苯氧乙酸)+100mM乙酰丁香酮，pH 5.8;
[0044] 共培养培养基:N6基础培养基+30g/L蔗糖+0.7gAJ|氨酸+0.5g/L MES+2mg/L 2， 4-D+85yg/L硝酸银+0.4g/L L-半胱氨酸+0.154g/L DTT+100mM乙酰丁香酮+0.4%植物凝 胶，pH 5.8;
[0045] 愈伤诱导培养基:N6基础培养基+30g/L蔗糖+0.7g/lJt氨酸+0.5g/L MES+2mg/L 2，4-D+85yg/L硝酸银+250mg/L特美汀+0 · 4 % 植物凝胶，pH 5 · 8;
[0046] 筛选培养基:N6基础培养基+30g/L蔗糖+0 · 7g/L脯氨酸+0 · 5g MES+2mg/L 2，4D+85 yg/L硝酸银+100mg/L Ascorbic Acid(维生素 C)+250mg/L特美汀+0.4%植物凝胶+3mg/L草 甘膦，pH 5.8;
[0047] 分化培养基:MS培养基+30g/L蔗糖+0.7gAJ|氨酸+0· lg/lj几醇+1.5mg/L ΚΤ+50μ g/L硝酸银+100mg/L Ascorbic Acid(维生素 C)+250mg/L特美汀+0.4%植物凝胶+lmg/L草 甘膦，pH 5.8;
[0048] 壮苗培养基：1/2MS培养基+50g/L蔗糖+0 · 7g/lJt氨酸+0 · lg/lj几醇0 · 5mg/L NAA (萘乙酸)+2mg/L多效唑+50yg/L硝酸银+250mg/L特美汀+0 · 4 %植物凝胶+0 · 5mg/L草甘膦， pH 5.8〇
[0049] 以上浸染液和培养基中各中成分前标注的浓度均为相应成分在相应浸染液或培 养基中的浓度。
[0050] (1)农杆菌法转化：
[0051 ]转基因受体材料为玉米(Zea mays L.)自交系501(购自北京市农林科学院玉米中 心)幼胚，玉米幼穗取于自交授粉后11-12d，幼胚大小为0.8-1.5mm。
[0052]利用携带表达载体pBAC9200的EHA105农杆菌菌株介导玉米自交系501幼胚的遗传 转化。具体实验步骤如下：
[0053] (a)农杆菌侵染液的制备：用电击转化方法将表达载体pBAC9200导入农杆菌菌株 EHA105,验证正确后-80°C保存。将含有表达载体pBAC9200的EHA105农杆菌在含有50mg/L卡 那霉素与50mg/L利福平的YEP固体培养基上，28 °C划线培养3天;挑取单菌落涂于含有50mg/ L卡那霉素与50mg/L利福平的YEP固体培养基中20°C培养3天;将培养好的农杆菌用接种环 直接刮取到配好的侵染液中，并用侵染液调节至0D 6Q() = 0.35,放于摇床中，22°C，180rpm，摇 4h; 4h后得到农杆菌侵染液，可直接用于幼胚的侵染；
[0054] (b)遗传转化及植株再生过程:将玉米幼穗于75%乙醇中5min，无菌水洗3次，然后 于25wt%次氯酸钠中消毒3min，无菌水洗3次;之后用无菌刀片将玉米籽粒幼胚逐个剥出放 到已配制好的农杆菌侵染液中30min;然后用无菌滤纸吸干幼胚表面浮液，将幼胚转入共培 养培养基中22 °C进行暗培养3d。
[0055] (2)草甘膦抗性愈伤筛选与植株再生：
[0056] (a)将共培养培养基培养后的幼胚转入愈伤诱导培养基中，25°C暗培养15d进行愈 伤诱导；
[0057] (b)将愈伤转入筛选培养基中25°C暗培养进行筛选，共筛选两次每次为期15d;
[0058] (c)然后将筛选后生长状态良好的愈伤转入分化培养基中25°C光照培养进行分化 成苗；
[0059] (d)将分化的幼苗转入壮苗培养基中25°C光照培养进行壮苗；
[0060] (e)将获得的转化苗室温条件下进行炼苗，7d后移入大田中，共获得14株转基因植 株。
[0061 ]实施例5To代转化玉米植株分子生物学检测
[0062] 经筛选分化的14个转化再生植株，分别进行PCR、G23V-EPSPS插入拷贝数与RT-PCR 等分子生物学检测分析。
[0063] (1)G23V_EPSPS 基因的 PCR 检测
[0064] 采用天根生化科技有限公司的DNA secure Plant Kit提取玉米叶片基因组DNA， 运用primer 5 · 0设计G23V-EPSPS基因的特异引物，PCR产物564bp。引物序列为：上游引物 G23V-130F，5，AGGATTCGCTGCATGGAGACT3,（SEQ ID N0.3);下游引物 G23V-693R，5' GGTGAGGTAGGGCTGGGACA3 '（SEQ ID NO · 4) JCR反应体系：DNA模板3yL(浓度为0 · 05yg/yL)，2 XTaq Master Mix 12.5yL，上下游引物（ΙΟμΜ)各lyL，RNase-Free_water(购自Takara公 司）7 · 5yL，总共 25μΙ^ΡΟ?程序如下：95°C5min;94°C变性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 28 个循环；72°C5min。
[0065] PCR产物在1 %琼脂糖凝胶电泳中进行检测。
[0066]对经草甘膦抗性筛选分化再生获得的14株转化玉米苗进行初步的PCR检测，以检 测外源G23V-EPSPS基因是否转入并整合到玉米基因组中。检测结果如图2所示，14株转化苗 中共有5株即2,9,10,11，12号植株表现出PCR阳性，初步确认这5颗植株发生了 G23V-EPSPS 基因的整合，草甘膦抗性筛选检出的阳性率为35.7%。
[0067] (2)G23V_EPSPS基因的插入拷贝数分析
[0068] 微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是一种利用泊松分布原理对核酸分 子进行绝对定量的新型PCR技术。它既经济又快速，且灵敏度和准确性非常高，与qPCR/qRT-PCR相比是一种更加理想的进行外源基因拷贝数分析的新方法。微滴数字PCR完整的实验流 程包括PCR反应体系的配制、生成微滴、PCR扩增和信号读取4个步骤。微滴数字PCR实验中所 需的仪器及试剂:A.实验仪器:Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量仪(Thermo Scientific); QX200Droplet Digital PCR系统(Bio-Rad包括微滴生成仪、盖膜仪、PCR仪和微滴读取仪）； B ·实验试剂：2 X QX200ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad);微滴生成油drop let generation oil/(Bio_Rad)〇
[0069]为了保证数字PCR分析的稳定性与准确性，我们选择玉米基因组的单拷贝基因 hmga (GenBank: AJ131373.1)作为内参，前期研究中发现该基因在常规PCR与荧光定量PCR分 析中的扩增效率显著优于其它内参基因。hmga和G23V-EPSPS基因的特异引物序列如下：
[0074] 微滴数字PCR体系：玉米基因组DNA模板30ng，2XQX200ddPCREvaGreenSupermix l〇yL(购自Takara公司），上下游引物（10μΜ)各0.2yL，均由上海捷瑞生物工程有限公司合 成，用RNase-Free-water (购自Takara公司）补至20yL。生成微滴需要使用仪器专配的微滴 生成卡和微滴生成仪，将20yL PCR反应体系与70yL微滴生成油一同加入微滴生成卡中，盖 上专用胶垫后放入微滴生成仪中生成微滴。微滴数字PCR反应程序:95 °C 5min; 95 °C 30s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，共40个循环;4 °C 5min; 90 °C 5min; 12 °C保温;每个样品进行3个平行重复实 验，PCR扩增完毕后，将PCR产物放入微滴读取仪中依据荧光信号的有无对阳性微滴和阴性 微滴进行判定读值。最后，在电脑上利用软件QuantaSof t VI. 7.4对数据进行分析，最终得 到核酸绝对定量结果。
[0075] 利用微滴数字PCR技术对PCR表现阳性的5株转基因植株进一步进行拷贝数检测。 本研究中计算外源基因拷贝数的方法如下：
[0076]外源基因拷贝数=外源基因浓度/内参基因浓度(本研究中所选的内参基因 hmga 在玉米中的拷贝数为1)。图3表示在微滴数字PCR实验中，玉米内参基因 hmga与G23V-EPSPS 基因相应引物特异性的情况，表明二者的阳性微滴(蓝色带)与阴性微滴(黑色带)都能够清 楚的区分，证明内参基因 hmga与G23V-EPSPS基因引物的特异性没有问题，且说明系统可以 准确判读出阳性微滴与阴性微滴的数目；表2为微滴数字PCR重复性的分析结果，表明所有 样品内参基因和G23V-EPSPS基因的3个平行实验，每个实验的微滴总数介于13257-18198之 间，均大于12000，满足微滴数字PCR微滴的分析要求。另外，实验中生成微滴的RSD (相对标 准偏差)介于2%-14%之间，小于25%，符合欧盟定量检测的要求，说明实验中建立的微滴 数字PCR体系微滴生成稳定，重复性良好，数据可靠性高；表3为5个转基因植株中G23V-EPSPS基因拷贝数分析结果，结果表明5颗植株的插入拷贝数在0-2之间。
[0077] 表2dd PCR重复性分析
[0078]
[0079] 表3ddPCR G23V-EPSPS基因拷贝数分析
[0080]
[0081]
[0082] (3) G23V-EPSPS基因的 RT-PCR 检测
[0083] 用Trizol reagent(购自Ambion公司）提取玉米叶片总RNA，采用逆转录试剂盒 (PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，出自Takara公司）将RNA逆转录成 cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，采用primer5·0设计G23V-EPSPS基因和内参Actin基因 的半定量特异引物，引物序列如下：
[0084]
[0085] RT-PCR反应体系：稀释5倍的cDNA模板lyL(浓度为50ng/yL)，2XTaq Master Mix 12.5yL(购自Takara公司），上下游引物（10μΜ)各lyL，均由上海捷瑞生物工程有限公司合 成，RNase-Free-water(购自 Takara公司）9 · 5yL，总共25μΙ^Α(3?;?η基因 RT-PCR程序如下：95 °C 5min; 95 °C 20s，54 °C 20s，72 °C 20s，共 30 个循环；72 °C 5min; 16 °C保温；G23V-EPSPS 基因 RT-PCR 程序如下：951€5111丨11;951€3〇8,58 1€3〇8,721€3〇8，共40个循环；721€5111丨11 ;16°(：保温。？0? 产物在1 %琼脂糖凝胶电泳中进行检测，。
[0086] 对PCR表现阳性的5株转基因苗进行RT-PCR检测，以检测目的G23V-EPSPS基因在玉 米机体中是否顺利转录。结果如图4所示：图4 (a)表示RNA完整性验证;图4 (b)表示cDNA质量 验证；图4(c)表示G23V-EPSPS基因的RT-PCR扩增结果，G23V-EPSPS基因的扩增产物为 146bp，内Actin的扩增产物为350bp。由（c)图可以看出在所获得的5颗转化再生植株中， G23V-EPSPS基因都在转录水平获得表达。
[0087]本发明提供的G23V型EPSP合成酶具有高抗草甘膦功能及超强的热稳定性，其Ki/ Km值接近1000;而CP4-EPSP合成酶的Ki/Km值约为345。说明与CP4-EPSP合成酶相比G23V-EPSPS抗草甘磷能力更强。首先，本发明提供的优化后的G23V-EPSPS基因在玉米中的表达效 率高、筛选出的转基因植物阳性率高。其次，基因枪转化法与农杆菌介导转化法相比，农杆 菌介导的外源基因转化系统所产生的外源基因低拷贝事件高于基因枪转化法并且外源基 因的表达水平也要高于基因枪转化法，造成外源基因沉默的几率较基因枪法也要低，所以 本发明采用农杆菌EHA105介导的遗传转化法将外源G23V-EPSPS基因转入玉米自交系501幼 胚中，经过愈伤草甘膦抗性筛选与分化等过程，最终获得5个在转录水平表达的株系。
【主权项】
1. 一种抗草甘膦筛选标记基因，命名为G23V-EPSPS，具有序列表中SEQ ID NO. 1所示的 喊基序列。2. -种包含权利要求1所述的抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS的重组表达载体。3. 根据权利要求2所述重组表达载体，其特征在于，由CaMV35S启动子和玉米Adhl基因 第一内含子驱动所述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS基因的表达。4. 一种包含权利要求1所述的抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS或权利要求2-3任一 所述的重组表达载体的宿主细胞。5. 根据权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为EHA105农杆菌。6. 权利要求1所述的抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS在转基因玉米阳性植株筛选方 面的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为:将权利要求1所述 的抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS导入玉米组织或细胞中，经诱导培养后再经草甘膦逐 级筛选后得到转基因玉米植株。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS导 入玉米中的具体方法如下:将所述抗草甘膦筛选标记基因 G23V-EPSPS插入基础表达载体中 构建重组表达载体，然后将所述重组表达载体通过农杆菌介导的方法转化到玉米的组织或 细胞中；优选地，所述重组表达载体中，由CaMV35S启动子和玉米Adh 1基因第一内含子驱动 G23V-EPSPS基因的表达。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述经草甘膦逐级筛选是指转化后的玉米 组织依次在含有草甘膦的筛选培养基、含有草甘膦的分化培养基和含有草甘膦的壮苗培养 基中进彳丁筛选。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述含有草甘膦的筛选培养基中，草甘膦 的浓度为2_4mg/L;所述含有草甘膦的分化培养基中，草甘膦的浓度为0.6-1.5mg/L;所述含 有草甘膦的壮苗培养基中，草甘膦的浓度为0.2-0.7mg/L。
【文档编号】C12N15/84GK105886521SQ201610245533
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】张晓东, 江颖, 张立全, 徐摇光, 姜志军
【申请人】北京市农林科学院