家蚕BmP56基因启动子及其重组表达载体和应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及家蚕BmP56基因启动子及其重组表达载体和应用，其中家蚕BmP56基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将该启动子构建重组表达载体，发现该启动子能够在家蚕中肠特异表达目的基因；因此家蚕BmP56基因启动子及其含有家蚕BmP56基因启动子的重组表达载体能够特异标记家蚕中肠细胞，该启动子的发现为研究家蚕中肠特异表达基因，特别是免疫相关基因提供了有力的工具。
【专利说明】
家蚕BmP56基因启动子及其重组表达载体和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及家蚕BmP56基因启动子，还涉及含有该启动子 的重组表达载体和应用。
【背景技术】
[0002] 家蚕是一种具有重要价值的经济昆虫和鳞翅目模式昆虫，在人类历史文化及经济 生活中占据重要地位。中肠是家蚕的一个重要消化器官，同时也是一个重要免疫器官，幼虫 期家蚕食桑，经过肠道的消化吸收，为全身提供营养，同时也为外界病源物经食桑进入肠道 感染肠道上皮细胞提供可能，因此中肠也就成为家蚕抵御外界病源物感染的第一道屏障。 随着家蚕基因组框架图、精细图及遗传变异图谱的相继完成，有关家蚕中肠的研究也越来 越多，如何更大地提高家蚕中肠对外界病源物的免疫抵抗能力，也成为后基因组时代研究 人员追求的目标，事关蚕业发展。虽然家蚕转基因技术已成熟，相关配套研究工具也越来越 多，也有家蚕中肠高量表达启动子的报道，但仍需探索和完备，毕竟不同启动子驱动目标基 因表达的能力与抵抗病源物的能力极相关，生产上需要高抗品种，启动子驱动能力越强越 好，免疫抵抗能力越高越好。因此，鉴定新的家蚕中肠特异表达基因启动子成为一种试图提 高家蚕中肠自身免疫能力的方法。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕BmP56基因启动子;本发明的目的之二 在于提供含有家蚕BmP56基因启动子的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供家蚕 BmP56基因启动子在家蚕中肠特异启动目的基因表达中的应用；本发明的目的之五在于提 供重组表达载体在家蚕中肠特异启动目的基因表达中的应用。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0005] 1、家蚕BmP56基因启动子，所述家蚕BmP56基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0006] 2、含有所述家蚕BmP56基因启动子的重组表达载体。
[0007]优选的，所述重组载体含有家蚕BmP56基因启动子和SV40终止信号的表达框。
[0008] 优选的，所述重组载体由以下方法制备:将pBac[3 XP3-EGFP afm]载体经AscI酶 切后然后去磷酸化，然后与含有家蚕BmP56基因启动子和SV40终止信号的表达框连接而得。
[0009] 更优选的，所述含有家蚕BmP56基因启动子和SV40终止信号的表达框由以下方法 制得：以SEQ ID N0.1和SEQ ID勵.2为引物，家蚕基因组0嫩为模板克隆所述家蚕&1^56基 因启动子，然后以SEQIDN0.4和SEQIDN0.5为引物，pBac[3XP3-DsRedaf]载体为模板 克隆含有红色荧光蛋白基因及SV40终止信号的片段DsRedSV40,然后将家蚕BmP56基因启动 子与DsRedSV40混合后，以SEQIDN0.1和SEQIDN0.5为引物进行扩增，获得含有家蚕 BmP56基因启动子和SV40终止信号的表达框。
[0010] 3、所述家蚕BmP56基因启动子在家蚕中肠特异启动目的基因表达中的应用。
[0011] 优选的，所述目的基因为标记基因或功能基因。所述标记基因为红色荧光蛋白基 因（DsRed)。
[0012] 4、所述的重组表达载体在家蚕中肠特异启动目的基因表达中的应用。
[0013]优选的，所述目的基因为标记基因或功能基因。
[0014] 本发明的有益效果在于:本发明克隆获得了家蚕BmP56基因启动子，该启动子能够 在家蚕中肠特异表达几丁质代谢相关基因表达，因此可以利用该启动子使目标基因在家蚕 中肠中特异表达目标基因，为免疫抗性相关基因提供有力的工具;本发明还构建了含有家 蚕BmP56基因启动子的重组表达载体，该重组表达载体能够用于转基因家蚕的研究，具有良 好的应用前景。
【附图说明】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0016] 图1为转基因家蚕个体的荧光观察照片(A:成虫（白光下)B:成虫(荧光下））。
[0017] 图2为转基因阳性个体中DsRed基因的表达特征(]?，01^000?1118;1 :转基因个体中 肠组织;2:转基因个体除中肠外剩余所有组织;3:非转基因个体中肠组织;4:非转基因个体 除中肠外剩余所有组织）。
【具体实施方式】
[0018] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0019] 实施例1、克隆家蚕BmP56基因启动子
[0020] 提取家蚕大造基因组DNA，根据现有的家蚕全基因组芯片数据和家蚕基因组数据 库(http://s i lkworm · swu · edu · cn/s i lkdb/)，设计家蚕BmP56基因启动子上、下游引物对：
[0023] 然后以家蚕基因组为模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2为引物进行PCR扩增，扩 增条件为94 °C预变性4分钟;94 °C变性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸2分钟，共30个循环;72 °C延伸10分钟，4 °C保存，进行PCR扩增，扩增产物经回收后经测序获得家蚕BmP56基因启动 子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0024] 实施例 2、构建 T-P56DsRedSV40 载体
[0025] 根据pBac[3XP3_DsRed af]载体(公开号为102296071A的中国专利）中红色荧光 蛋白基因 DsRed序列及终止信号SV40设计特异扩增含DsRed和SV40的片段(DsRedSV40)，
[0026] 上游引物DsRedSV40_F: 5 ' -gattccgaatatcgcgatggtgcgctcctccaagaacg-3 '（ SEQ ID NO.4)；
[0027] 下游引物DsRedSV4〇-R:5'-ctaggcgcgccgtacgcgtatcg_3'（SEQ ID N0.5);
[0028] 然后以pBac[3XP3-DsRedaf]载体为模板，以SEQIDN0.4和SEQIDN0.5为引物 进行PCR扩增，扩增条件为:94 °C预变性3分钟;94 °C变性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸1分 钟，共30个循环;72°C延伸10分钟，4°C保存，回收扩增产物，获得DsRedSV40片段。
[0029] 将克隆获得的家蚕BmP56基因启动子和DsRedSV40片段等体积混合，以此混合物为 模板，并以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:5为上、下游引物对进行PCR扩增，依扩增条件为:94°C 预变性3分钟;94°C变性30秒，50°C退火1分钟，72°C延伸3分钟，共35个循环;最后72°C延伸 10分钟，4 °C保存)进行搭桥PCR扩增，扩增产物经回收获得以家蚕BmP56基因启动子为启动 信号和SV40为终止信号的表达框，命名为P56DsRedSV40。
[0030] 将P56DsRedSV40表达框片段与T克隆载体pEASY-T simple连接，转化大肠杆菌感 受态细胞，经测序确认，获得含有家蚕BmP56基因启动子的载体，命名为T-P56DsRedSV40载 体。
[0031] 实施例3、构建含家蚕BmP56基因启动子的重组表达载体
[0032] 用限制性内切酶As c I于37 °C分别酶切pBac [ 3 X P3-EGFP af m](公开号为 102296071A的中国专利）和T-P56DsRedSV40约4小时，回收pBac[3XP3-EGFP afm]载体骨架 和P56DsRedSV40片段。pBac[3XP3-EGFP afm]骨架经碱性磷酸酶于50°C处理并纯化，获得 去磷酸化的pBac[3XP3-EGFP afm]骨架。将P56DsRedSV40片段与pBac[3XP3-EGFP afm]骨 架混合后在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应，连接反应完成后转化大肠杆菌感受态细 胞，经筛选获得含家蚕&1^56基因启动子的重组表达载体，命名为?8 &〇[?56081^(13￥40,3\ P3EGFP]重组表达载体。
[0033]实施例4、转基因显微注射和阳性个体的筛选
[0034]将多化性家蚕正常桑叶饲养至化蛹化蛾后，将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后黑暗环 境中产卵。将此蚕卵在干净的载玻片上整齐排列，用Eppendorf显微注射系统将重组表达载 体pBac[P56DsRedSV40,3Xp3EGFP]和辅助质料A3H-起注射进300粒蚕卵中，催青10天左右 获得155头G0代蚁蚕，将成功饲养至化蛹化蛾的蚕，交配产卵，获得55个蛾圈，经荧光显微镜 筛选获得7个阳性蛾圈中有86头阳性个体。将阳性个体饲养至化蛹化蛾，进一步荧光显微镜 观察，结果如附图1所示。结果显示获得的转基因个体眼睛有绿色荧光出现，确认获得转基 因家香。
[0035]实施例5、转基因家蚕的分子检测
[0036]桑叶饲养转基因家蚕至5龄中期，分别取转基因家蚕和非转基因家蚕的中肠组织 及除中肠外剩余所有组织样品，各2个共4个样品，提取4个样品的总RNA，经反转录试剂盒 (Promega)反转录获得cDNA，根据DsRed序列设计下游弓丨物，具体为：5'_ ctacaggaacaggtggtggcg_3'SEQ ID N0:6)。然后以SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6为上、下游 引物对，获得的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。 结果显示，转基因家蚕的中肠组织样品中检测到DsRed的表达，而在非转基因家蚕的中肠组 织、转基因家蚕和非转基因家蚕的除中肠外剩余所有组织样品中都未检测到DsRed的表达， 说明P56启动子确实是家蚕中肠特异表达启动子，可驱动目标基因在家蚕中肠中特异表达。 [0037]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 家蚕BmP56基因启动子，其特征在于:所述家蚕BmP56基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。2. 含有权利要求1所述家蚕BmP56基因启动子的重组表达载体。3. 根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体含有家蚕BmP56基因启 动子和SV40终止信号的表达框。4. 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组载体由以下方法制备： 将pBac[3XP3-EGFP afm]载体经AscI酶切后然后去磷酸化，然后与含有家蚕BmP56基因启 动子和SV40终止信号的表达框连接而得。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述含有家蚕BmP56基因启动子 和SV40终止信号的表达框由以下方法制得：以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2为引物，家蚕基 因组DNA为模板克隆所述家蚕BmP56基因启动子，然后以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引 物，pBac[3XP3-DSRed af]载体为模板克隆含有红色荧光蛋白基因及SV40终止信号的片段 DsRedSV40,然后将家蚕BmP56基因启动子与DsRedSV40混合后，以SEQ ID N0.1和SEQ ID NO. 5为引物进行扩增，获得含有家蚕BmP56基因启动子和SV40终止信号的表达框。6. 权利要求1所述家蚕BmP56基因启动子在家蚕中肠特异启动目的基因表达中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述目的基因为标记基因或功能基因。8. 权利要求2~5任一项所述的重组表达载体在家蚕中肠特异启动目的基因表达中的 应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述目的基因为标记基因或功能基因。
【文档编号】C12N15/113GK105886511SQ201610484773
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】段建平, 孟悦, 李莹, 孟现鑫, 姚伦厂, 刘宗才, 阚云超
【申请人】南阳师范学院