一种含人Rad51C启动子的载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含人Rad51C启动子的载体及其应用，包括Rad51C启动子序列和编码具有肿瘤治疗作用的效应蛋白的核酸序列，Rad51C启动子序列如SEQ?IDNo：1所示，编码具有肿瘤治疗作用的效应蛋白的核酸序列的转录过程由Rad51C启动子调控；本发明还公开了该核酸序列在治疗肿瘤药物中的应用。与现有技术相比，本发明提供了一种含人Rad51C启动子的核酸序列，并通过分子克隆的手段将Rad51C启动子和编码DTA的开放阅读框整合构成的质粒载体转染进入细胞，能够明显杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞基本无影响。
【专利说明】一种含人Rad51C启动子的载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种载体及其应用，尤其是涉及一种含人Rad51C启动子的载体及其应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤治疗的目的在于能够选择性地杀伤或者清除恶性增殖细胞而不对正常细胞造成伤害。在2000年，有文献报道根据端粒酶hTER和hTERT在肿瘤细胞中具有活性而在正常细胞中没有活性的特点，利用hTER和hTERT的转录调节序列来调控外源毒性基因在膀胱癌细胞中的表达，从而选择性杀伤肿瘤细胞。随后Christopher等人利用重组酶蛋白Rad51在肿瘤细胞中的高表达的 特点，也成功实现了在体内体外，转录水平上靶向抗肿瘤的治疗。
[0003]重组酶Rad51是大肠杆菌RecA的同源蛋白质，它通过介导DNA链配对以及链交换而参与DNA的同源重组修复。在人类中Rad51有5种家族成员XRCC2、XRCC3、Rad51B /Rad51Ll、Rad51C / Rad51L2、Rad51D / Rad51L3，它们对于形成 DNA 损伤诱导的 Rad51foci的组装是必须的。它们形成两个复合体，辅助Rad51进行DNA双链断裂中的同源重组修复，并且依赖于BRCA-1和BRCA-2途径辅助。这一同源同组修复过程还需要其他的蛋白Rad52，Rad54，Rad55，Rad57，RPA的帮助。因此这些蛋白质也有可能具有与Rad51相同的表达特异性，也存在潜在的靶向抗肿瘤的应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种含人Rad51C启动子的载体及其应用。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0006]一种含人Rad51C启动子的载体，包括Rad51C启动子序列和编码具有肿瘤治疗作用的效应蛋白的核酸序列，所述的Rad51C启动子序列如SEQ ID No:1所示,与序列相同或者具有90%相似性的序列均为该专利的保护范围。
[0007]所述的编码具有肿瘤治疗作用的效应蛋白的核酸序列的转录过程由Rad51C启动子调控。
[0008]所述的Rad51C启动子序列为人类的Rad51C蛋白的启动子序列。
[0009]所述的具有肿瘤治疗作用的效应蛋白为有毒蛋白。
[0010]所述的有毒蛋白包括白喉毒素蛋白A链(DTA)、蓖麻毒蛋白、凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。白喉毒素蛋白 A链(DTA)是ADP-核糖转移酶，能够抑制真核生物蛋白合成，具有高毒性和广毒性，可以通过组织特异性表达杀伤肿瘤细胞；蓖麻毒蛋白(ricin)是蓖麻种子中的一种毒蛋白，它由分子量分别为32KD和34KD的A、B两条链组成，分别为效应链和连接链，是真核细胞核糖体失活蛋白，可以抑制多种肿瘤细胞的蛋白质合成,具有很强的细胞毒性；凋亡蛋白家族的成员caspase3、caspase6、caspase7、caspase8是能够引起细胞程序性死亡的蛋白酶。也可以应用于特异性杀伤肿瘤细胞。[0011 ] 作为优选，所述的有毒蛋白为白喉毒素蛋白A链。当有毒蛋白为白喉毒素蛋白A链时，该载体的序列如SEQ ID No:2所示。
[0012]一种含人Rad51C启动子的载体在治疗肿瘤药物中的应用。
[0013]通过肿瘤细胞中特异性高表达的Rad51C的启动子驱动有毒蛋白DTA在肿瘤细胞中的高表达而针对性地杀伤肿瘤细胞。DTA的开放式阅读框序列如SEQ IDNo:3所示。
[0014]与现有技术相比，本发明提供了一种含人Rad51C启动子的核酸序列，并提供了该核酸序列在治疗肿瘤药物中的应用。将Rad51C启动子和编码DTA的开放阅读框整合构成的质粒载体转染进入细胞，能够明显杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞基本无影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1-1为Rad51、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在14株细胞中的表达水平分析结果;
[0016]图1-2为Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在正常细胞系和肿瘤细胞系的表达水平统计学差异分析结果；
[0017]图2-1 为 Western blot 结果图；
[0018]图2-2为Rad51C蛋白质和Actin蛋白质的表达条带进打量化，并用内参进打标准化分析结果；
[0019]图2-3为Rad51C在正常细胞系和肿瘤细胞系的表达水平Mann-whitney检验分析
结果;
[0020]图3-1为pRad5IC-EGFP质粒构建流程图；
[0021]图3-2为pRad5IC-Luc质粒构建流程图；
[0022]图3-3为pRad5IC-DTA质粒构建流程图；
[0023]图4-1 为 pRad5IC-EGFP 质粒的图谱；
[0024]图4-2为pRad51C_EGFP质粒中EGFP在14株细胞中的表达情况；
[0025]图4-3为对正常细胞组和肿瘤细胞组中的EGFP的表达进行差异分析结果；
[0026]图4-4为pRad51C_Luc质粒的图谱；
[0027]图4-5为pRad51C_Luc质粒中Luc在14株细胞中的表达情况；
[0028]图4-6为对正常细胞组和肿瘤细胞组中的Luc的表达进行差异分析结果；
[0029]图5-1为pRad5IC-DTA质粒的图谱；
[0030]图5-2为pRad51C_DTA质粒转染以后对细胞存活率的影响。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0032]实施例
[0033]一、Real-time-PCR(实时定量 PCR)
[0034]通过实时定量PCR的方法比较Rad51的同系物在正常细胞和肿瘤细胞中的表达情况。
[0035]Rad51 的同系物包括 Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad52。
[0036]其中正常细胞组:WIT和MRT是肺成纤维细胞，MJT是皮肤成纤维细胞，HMECUHMEC2、HMEC3、HMEC4是乳腺上皮细胞，肿瘤细胞组=Hela是人类宫颈癌细胞，GP2-293则是人胚肾细胞，HT1080是人类纤维肉瘤细胞，MCF-7、MDA-MB-231、HCC1954、T47D则是人乳腺
上皮癌细胞。
[0037]实时定量PCR具体方法如下:
[0038]取对数生长期的细胞,用Tr1-reagent (sigma)裂解细胞,按照使用说明提取RNA,用Nanodrop检测浓度和质量,随后取I μ gRNA,与随机引物、gDNAremover、反转录酶及相应的buffer (缓冲液)等(北京全式基因，AT311)混合，25°C孵育10分钟，42°C孵育30分钟，85°C加热5分钟使酶失活，得到cDNA并检测浓度，稀释后进行Real time PCR反应。针对Rad51B、Rad51C、Rad51D 和 Rad52 设计引物(见表 I)，Real time PCR 反应采用 50ng cDNA与相应的引物，与Takara的SYBERGreen试剂盒按照比例相混合，ABI7500系统检测。每个基因对应的Ct值都用内参基因GAPDH校准，得到相应的表达量。
[0039]Rad51的同系物在正常细胞和肿瘤细胞中的表达情况如图1_1与图1_2所示，图1-1是Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在上述14株细胞中的表达水平。图1_2是对Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在正常细胞系和肿瘤细胞系的表达水平的比较，使用Mann-whitney进行统计学差异分析。
[0040]由实验结果可以看到，Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52在肿瘤细胞组中的表达水平普遍高于正常细胞组，通过Mann-whitney检验,发现Rad51C的表达在肿瘤细胞组上调明显，与正常细胞组相比，统计学差异极其显著(p〈0.01)。因而选择Rad51C为研究目标进行
下一步实验。
[0041]表1Real time-PCR 引物
[0042]
【权利要求】
1.一种含人Rad5ic启动子的载体，其特征在于，包括Rad51C启动子序列和编码具有肿瘤治疗作用的效应蛋白的核酸序列，所述的Rad51C启动子序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种含人Rad51C启动子的载体，其特征在于，所述的编码具有肿瘤治疗作用的效应蛋白的核酸序列的转录过程由Rad51C启动子调控。
3.根据权利要求1所述的一种含人Rad51C启动子的载体，其特征在于，所述的Rad51C启动子序列为人类的Rad51C蛋白的启动子序列。
4.根据权利要求1所述的一种含人Rad51C启动子的载体，其特征在于，所述的具有肿瘤治疗作用的效应蛋白为有毒蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种含人Rad51C启动子的载体，其特征在于，所述的有毒蛋白包括白喉毒素蛋白A链、蓖麻毒蛋白、凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。
6.根据权利要求5所述的一种含人Rad51C启动子的载体，其特征在于，所述的有毒蛋白为白喉毒素蛋白A链。
7.根据权利要求6所述的一种含人Rad51C启动子的载体,其特征在于,该载体的序列如 SEQ ID No:2 所示。
8.—种如权利要求1~7任一所述的含人Rad51C启动子的载体在治疗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103952440SQ201310415502
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】许艳, 曹艳, 毛志勇 申请人:同济大学