专利名称：一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子探测载体及其构建方法和应用，特别是一种棒状杆菌启动 子探测载体以及应用该载体筛选到的强启动子，属于微生物基因工程领域。
背景技术：
棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高GC含量的放线菌。自人们首次 分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来(Kinoshita等，1957年)，棒状杆菌的三个主要代 表谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌，和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。这里 特别指出，通过DNA-DNA杂交实验发现，这三个不同物种之间只有很小的差别(Liebl等， 1991)。由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识 (Eggeling andBott,2005 ；Burkovski，2008)，代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒 状杆菌菌种改良的主要策略。应用表达载体对氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因的 过表达，是代谢工程最常用的策略之一。目前几乎所有的现存棒状杆菌表达载体都使用大 肠杆菌启动子如lacUV5、trp、tac、λ PkP1和araBAD启动子来表达外源基因(Srivastava and Deb, 2005)；然而，在棒状杆菌中，这些启动子的活性较弱，外源基因在他们的控制下的 表达水平通常不高，这会限制氨基酸的产量。因此，应用探测载体寻找用于棒状杆菌代谢工 程改造的强启动子，具有重要的意义。在本发明中，我们首先构建了一个新的棒状杆菌启动子探测载体pDXW-11，应用该 载体探测了四种已知的启动子PilvA，Pkan, PF104, tac以及两种我们设计tac衍生物，即 tac-Ml, tac-M启动子在黄色短杆菌中的活性。我们发现tac_M启动子在黄色短杆菌中能 高水平表达报告基因cat编码的氯霉素酰基转移酶CAT。tac-M启动子是一个适用于棒状 杆菌代谢工程研究的强启动子，它的发现具有如下的重要意义目前棒状杆菌中存在的使 用tac启动子控制外源基因表达的弱表达载体，可以通过定点突变技术，转变成使用tac-M 启动子的强表达载体。
发明内容
本发明提供了一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方案，通过此探测载体筛选 到一个强启动子。一种本发明所要解决的技术问题是提供一种棒状杆菌启动子探测载体pDXW-11。本发明所述的探测载体包括筛选标记、复制子片段及多克隆位点，其特征在于含 有用于检测外源DNA片段启动子活性的氯霉素酰基转移酶基因(cat)；用于控制报告基因 上游启动子转录通读的rrnBTlT2终止子序列。探测载体pDXW-11含有使质粒能在棒状杆菌宿主中复制并稳定存在的rep片段， 从4786位到2010位。探测载体pDXW-11含有用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因kan，从5789位到6604位。探测载体PDXW-Il含有用于检测外源DNA片段启动子活性报告基因cat，从823位 到164位。探测载体PDXW-Il含有用于控制报告基因上游启动子转录通读的rrnBTlT2终止 子序列，其中rrnBTl从1121位到1080位，rrnBT2从947位到940位。本发明提供的表达载体pDXW-11，{Escherichia coli DH5 α (pDXff-11)}已保 藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号CCTCC NO =M 2010006保藏日期 2010-1-13。本发明所要解决的另一个技术问题是提供表达载体pDXW-11的构建方法。为解决上述问题，所采用的技术方案是第一步用限制酶XbaI和BglI双酶切载体pET28a，去除含IacI基因及T7启动 子的DNA片段，将大片段自身环化，构建成的重组质粒命名为pDXW-Ι ；第二步以质粒大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pC2为模板，rep-F和r印-R为引 物，通过PCR扩增2686bp的棒状杆菌复制子片段r印，PCR产物用SmaI酶切，并连接到用 BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-Ι上，构建的穿梭载体命名为为pDXW_2 ；第三步以含有cat基因的载体为模板，cat-F和cat-R为引物，通过PCR扩增 686bp报告基因cat的开放阅读框，在扩增产物的5'和3'末端分别引入限制酶内切酶 酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到用同样限制性内切酶双切后的 pDXff-2上，构建的重组质粒命名为pDXW-2-cat ；第四步以含有终止子rrnBTlT2的载体为模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R为引 物，通过PCR扩增294bp的终止子π·ηΒΤ1Τ2，在扩增产物的5'和3'末端分别引入限制酶 内切酶酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到同样用同样限制性内切酶 双切后的pDXW-2-cat上，构建的重组质粒命名为pDXW-11。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一个应用棒状杆菌启动子探测载体筛 选得到的强启动子tac-M，该启动子根据杂合性启动子tac进行人工改造后得到，其核苷酸 序列为 SEQ ID NO :2ο所述启动子通过寡核苷酸链退火法获得。本发明的有益效果本发明的探测载体pDXW-11在大肠杆菌及棒状杆菌中皆能稳定存在，可用于检测 DNA片段在棒状杆菌中有无启动子活性及活性的相对大小；应用本发明构建的探测载体， 筛选到一种在棒状杆菌中能高效表达外源基因的强启动子tac-M，解决了目前棒状杆菌启 动子普遍较弱的问题，尤其适用于棒状杆菌生产次生代谢产物的研究和生产。
图1表达载体pDXW-11的构建。图2表达载体pDXW-11的构建。图3不同黄色短杆菌菌株全蛋白SDS-PAGE图。图4不同黄色短杆菌菌株CAT活性图。图5启动子探测载体pDXW-11的物理图谱。
具体实施例方式实施例1表达载体pDXW-11的构建表达载体pDXW-10的构建过程如图1，2所示。第一步，以表达载体pET28a(NOVagen，USA)为基础，去除IacI基因及T7启动子， 构建质粒PDXW-I (图1)。用限制酶XbaI和BglI双酶切载体pET28a，将获得的大片段纯化， 用T4连接酶将大片段自身环化，构建成的重组质粒大小为3524bp，命名为pDXW-Ι (图1)；第二步，构建穿梭载体pDXW_2(图1).以质粒大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒 pC2 (Goyal etal.，1996Plasmid. 36 :62_66)为模板，r印-F 和 r印-R 为引物，通过 PCR 扩增 2686bp的棒状杆菌复制子片段r印，在扩增产物的5’和3’末端引入限制酶SmaI酶切位点。 PCR 扩增反应体系为 50 μ 1，包括 10 μ 15 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus)，4 μ 1 dNTP 混合 物(各2. 5mM)，ly 1质粒模板pC2(100ng/y 1)，1μ 1正向引物r印-F (20 μ Μ)，1 μ 1反向引 物 r印-R (20 μ Μ), 0. 5 μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反应程序94°C预变性分钟； 94°C变性30秒，60°C退火15秒，72°C延伸2分45秒，35个循环；72°C再延伸10分钟；10°C 保存。PCR产物用SmaI酶切，并连接到用BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW_l， 由此产生的穿梭载体大小为6216bp，命名为为pDXW-2。第三步，向质粒pDXW-2引入将报告基因cat，cat编码氯霉素酰基转移酶(CAT) (图 2)。以质粒 pDXW-10-cat (Xu et al. ,2010FEMS Microbiology letters. In review) 为模板，带有三个串联终止密码子和SD序列的引物cat-F和cat-R为引物，通过PCR扩增 686bp报告基因cat的开放阅读框，在扩增产物的5'和3'末端分别引入限制酶NotI和 XhoI 酶切位点。PCR扩增反应体系为 50 μ 1，包括 10 μ 1 5 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus)， 4 μ 1 dNTP 混合物(各 2. 5mM)，1 μ 1 质粒模板 pDXff-10-cat (IOOng/ μ 1)，1 μ 1 正向引物 cat-F(20yM)，ly 1 反向引物 cat-R(20yM)，0. 5μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反 应程序94°C预变性分钟；94°C变性30秒，54°C退火15秒，72°C延伸45秒，35个循环；72°C 再延伸10分钟；10°C保存。PCR产物用NotI和XhoI双切，并连接到同样用NotI和XhoI双 切后的pDXW-2，构建的重组质粒大小为6901bp，命名为pDXW-2-cat (图2)。第四步，为了消除报告基因上游pDXW-2自身序列对报告基因转录的干扰，在cat 上游的多克隆位点前面引入转录终止子rrnBTlT2(图2)。以质粒pKK223_3 (Pharmacia， Sweden)为模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R为引物，通过PCR扩增294bp的终止子 rrnBTlT2，在扩增产物的5'和3'末端分别引入限制酶NheI和BamHI酶切位点。PCR扩 增反应体系为 50μ 1，包括 10μ 1 5 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus), 4 μ 1 dNTP 混合物 (各 2. 5mM), 1 μ 1 质粒模板 pKK223-3(100ng/y 1)，1 μ 1 正向引物 rrnBTlT2_F(20 μ Μ)， 1 μ 1 反向引物 rrnBTlT2-R(20 μ Μ)，0· 5 μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反应程序 94°C预变性分钟；94°C变性30秒，44°C退火15秒，72°C延伸20秒，35个循环；72°C再延伸 10分钟；10°C保存。PCR产物用NheI和BamHI双切，并连接到同样用NheI和BamHI双切 后的pDXW-2-cat，构建的重组质粒即为最终的启动子探测载体，其大小为7163bp，命名为 pDXW-11，物理图谱见图5，构建过程中使用的引物序列如下rep-F agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatcarep-R agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg
cat-F aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggagacat-R actactcgagttacgccccgccctgccactrrnBTlT2-F :atctagctagccgatggtagtgtggggtctcrrnBTlT2-R :agttggatccagaaaaataaacaaaagagt实施例2应用探测载体pDXW-11探测启动子为了证明pDXW-11的可用性并且寻找能在棒状杆菌中高效表达的启动子，在黄色 短杆菌中，我们对六个不同类型的异源启动子PilvA，Pkan, PF104, tac,, tac-Ml和tac_M进 行了活性检测。？…八是谷氨酸棒杆菌染色体上苏氨酸脱氢酶基因ilvA的启动子序列；Pkan 是来自转座子Tn5的启动子序列；PF104是来自谷氨酸棒杆菌噬菌体Φ GAl的启动子序列； tac是杂合性启动子；tac-Ml和tac_M是我们自己设计的tac启动子的衍生物。首先，设计合成启动子寡核苷酸单链序列，并且在序列中引入限制性酶切位点，应 用寡核苷酸链退火法获得启动子双链DNA序列。寡核苷酸单链序列包括PilvA_F、PilvA_R，用 于通过寡核苷酸链退火法获得PilvA启动子双链DNA序列；PF104-F、PF104-R，用于通过寡核 苷酸链退火法获得PF104启动子双链DNA序列；Pkan-F、Pkan-R,用于通过寡核苷酸链退火法 获得Pkan启动子双链DNA序列；tac-F、tac_R，用于通过寡核苷酸链退火法获得tac启动子 双链DNA序列。为了能够克隆到启动子探测载体的多克隆位点，所有启动子序列的5'和 3'末端都分别引入了限制性切点BamHI和HindIII0将PilvA，Pkan, PF104, tac启动子双链 DNA序列用BamHI和HindIII双切，并连接到同样用BamHI和HindIII双切后的启动子探测 载体 pDXW-11，获得的重组质粒分别命名为 pDXW-1 l-PilvA，pDXff-Il-Pkan, pDXW-ll_PF104 和 pDXW-11-tac。将 pDXW-1 l-PilvA，pDXff-11-Pkan, pDXff-11-PF104 和 pDXW-ll-tac 转化黄色短 杆菌 B. flavumATCC14067,分别形成菌株 14067/pDXff-ll-PilvA, 14067/pDXff-lI-Pkan, 14067/ pDXW-11-PF104和14067/pDXW-ll_tac。将ImL过夜培养的上述黄色短杆菌菌株分别接种 到30mL含卡那霉素的LBG培养基中，培养物生长到在600nm光密度为1. 5时，离心收获 细胞并悬浮在 5mL Tris-HCl 缓冲液(lOOmM，ρΗ7· 8)中。用 Constant Cell Disruption Systems (Constant Systems, Daventry, UK)，在20KPSI条件下，破碎细胞，离心除去细胞碎 片，粗提物用于SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE结果显示所有样品都没 有出现与预测的分子量约为25kD特异性CAT蛋白条带(报告基因cat的编码产物)(图3)， 这意味着检测的启动子在黄色短杆菌中活性不是很强。为了进一步证明上述检测的启动 子是否具有活性以及活性相对大小，我们应用Shaw(1975)等的方法，分别对上述4个菌株 粗提物进行了 CAT的生物活性检测。结果显示14067/pDXW-ll-PilvA，14067/pDXW-lI-Pkan, 14067/pDXff-ll-PF104 和 14067/pDXW-ll-tac 样品的 CAT 的相对活性分别为 0. 086,0. 785、 0. 128,0. 467U(mg protein—1) (Fig. 4)。结合SDS-PAGE图谱及CAT活性测定数值进行分析 可得出结论PilvA，Pkan, PF104, tac启动子在黄色短杆菌中都具有活性，但活性水平不高。然后，为了发现适用于棒状杆菌代谢工程研究的强启动子，我们设计了两个tac 启动子的衍生物tac-Ml和tac-M。tac、tac-Ml和tac_M启动子的差别仅在于其延伸 的"10区序列，他们的延伸的-10区序列分别为gctcgtataa tgt、tgtgctataa tgg禾口 tgtggtacca tgt。我们应用寡核苷酸链退火法获得tac-Ml和tac_M启动子双链DNA序 列，序列的5'和3'末端都分别引入了限制性切点BamHI和Hindlll。寡核苷酸单链 序列包括tac-Ml-F、tac-Ml-R,用于通过寡核苷酸链退火法获得tac_Ml启动子双链DNA序列；tac-M-F、tac-M-R，用于通过寡核苷酸链退火法获得tac_M启动子双链DNA序 列。将tac-Ml和tac-M启动子双链DNA序列用BamHI和HindIII双切，并连接到同样 用BamHI和HindIII双切后的启动子探测载体pDXW_ll，获得的重组质粒分别命名为 pDXff-11-tac-Ml 和 pDXW-ll-tac_M2。将 pDXW-11-tac-Ml 和 pDXW-ll-tac_M2 转化黄色短 杆菌 B. flavumATCC14067，分别形成菌株 14067/pDXff-ll-tac-Ml 和 14067/pDXW-ll-tac-M。 将ImL过夜培养的黄色短杆菌菌株14067/pDXff-ll-tac-Ml和14067/pDXW-ll-tac-M分别 接种到30mL含卡那霉素的LBG培养基中，培养物生长到在600nm光密度为1. 5时，离心收 获细胞并悬浮在 5mL Tris-HCl 缓冲液(lOOmM，pH7. 8)中。用 Constant Cell Disruption systems (Constant Systems, Daventry, UK)，在 20KPSI 条件下，破碎细胞，离心除去细胞 碎片，粗提物用于SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE结果显示14067/ pDXW-11-tac-M样品显示了分子量约为25kD的CAT蛋白条带(图3)，说明tac_M启动子在 黄色短杆菌中能高效表达活性很强。为了进一步证明tac-Ml和tac-M启动子活性相对大 小，我们应用Shaw(1975)等的方法，分别对上述2个菌株粗提物进行了 CAT的生物活性检 测。结果显示14067/pDXW-ll-tac-Ml和14067/pDXW-ll-tac-M样品的CAT的相对活性分 别为0. 602,5. 526U(mg protein—1)(图4)。结合SDS-PAGE图谱及CAT活性测定数值进行 分析可得出结论tac-M启动子在黄色短杆菌中是一个强启动子。用于获得启动子双链DNA的寡核苷酸单链序列如下PiivA-F :agcggatcccaaagtaggtgcaattctaggagaagattacactagtcaaccatgagtgaaaa gcttagcPiivA-R :gctaagcttttcactcatggttgactagtgtaatcttctcctagaattgcacctactttggg atccgctPF104-F :aataggatcccagcgtatttgaccgatccggacacctgggataatgtgtggattttgtcgg aagctttaatPF104-R :attaaagcttccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctg ggatcctattPkan-F acttggatccccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaaa gcttaatgPkan-R cattaagcttttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccgggg atccaagt tac-F atatggatcctgagetgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgage ggataacaattaagctttaaatac-R tttaaagcttaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattg tcaacagctcaggatccatattac-Ml-F agetggatcctgagetgttgacaattaatcatcgtgtgctataatgggtggaattgtgag cggataacaattaagcttagcttac-Ml-R :agctaagcttaattgttatccgctcacaattccacccattatagcacacgatgattaatt gtcaacagctcaggatccagcttac-M-F agetggatcctgagetgttgacaattaatcatcgtgtggtaccatgtgtggaattgtgag cggataacaattaagcttagct
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tacagggcgcgtcccattcgcca7163
<210>2
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgagctgttg￡10￡1￡Ι ￡1￡Ι 0atcgtgtggtaccatgtgtggaattgtgagcggataacaa60
tt62
1权利要求
一种棒状杆菌启动子探测载体，包括筛选标记、复制子片段及多克隆位点，其特征在于含有用于检测启动子活性的氯霉素酰基转移酶报告基因(cat)；多克隆位点后为用于控制报告基因上游启动子转录通读的rrnBT1T2终止子序列。
2.根据权利要求1所述的探测载体，其特征在于其核苷酸序列为SEQID NO :1。
3.权利要求1，2任一所述的探测载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤 第一步用限制酶XbaI和BglI双酶切载体pET28a，去除含IacI基因及T7启动子的DNA片段，将大片段自身环化，构建成的重组质粒命名为pDXW-Ι ；第二步以质粒大肠杆菌_棒状杆菌穿梭质粒PC2为模板，rep-F和rep-R为引物，通 过PCR扩增2686bp的棒状杆菌复制子片段r印，PCR产物用SmaI酶切，并连接到用BstZ17I 酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-Ι上，构建的穿梭载体命名为为pDXW-2 ；第三步以含有氯霉素酰基转移酶基因(cat)的载体为模板，cat-F和cat-R为引物， 通过PCR扩增686bp报告基因cat的开放阅读框，在扩增产物的5'和3'末端分别引入限 制酶内切酶酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到用同样限制性内切酶 双切后的PDXW-2上，构建的重组质粒命名为pDXW-2-cat ；第四步以含有终止子rrnBTlT2的载体为模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R为引物，通 过PCR扩增294bp的终止子π·ηΒΤ1Τ2，在扩增产物的5'和3'末端分别引入限制酶内切酶 酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到同样用同样限制性内切酶双切后 的pDXW-2-cat上，构建的重组质粒命名为pDXW-11。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于第一步中的2种限制性内切酶为NotI和 Xhol，第二步中的2种限制性内切酶为NheI和BamHI。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于使用下述引物对 rep-F :agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatcarep-R :agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg cat-F :aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggaga cat-R :actactcgagttacgccccgccctgccact rrnBTlT2_F :atctagctagccgatggtagtgtggggtctc rrnBTlT2-R :agttggatccagaaaaataaacaaaagagt
6.一种应用棒状杆菌启动子探测载体筛选得到的强启动子tac-M，其特征在于该启动 子根据杂合性启动子tac进行人工改造后得到，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
7.根据权利要求6所述的tac-M启动子，其特征在于采用寡核苷酸链退火法获得。
全文摘要
本发明公开了一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明的棒状杆菌启动子探测载体pDXW-11，可用于筛选能在棒状杆菌中高效表达的启动子，通过质粒的探测，筛选到一种棒状杆菌强启动子tac-M，在棒状杆菌中能高效表达，尤其适用于棒状杆菌代谢产物的研究和生产。
文档编号C12N15/77GK101985631SQ20101010846
公开日2011年3月16日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者徐大庆, 李烨, 王小元, 谭延振 申请人:江南大学