专利名称：SRY特异性TaqMan探针引物对与实时荧光SRY基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于性别决定基因(Sex-determining region Y，本专利申请文件中简称SRY基因)检测领域，特别涉及检测SRY基因的TaqMan探针引物对及实时荧光检测试剂盒。
背景技术：
性别分化异常是一种常见的遗传病，其发病率约为1% 3%。这类疾病长期困扰着患者及其亲属，他(她)们无法分辨患者的性别，对患者身心和婚姻等造成严重伤害。人类性别决定和分化是一个及其复杂的过程，其中SRY基因是性别分化的关键基因。SRY基因在未分化的性腺中表达以后，大量与睾丸分化相关的转录因子和生长因子基因开始特异性表达。SRY基因一直被认为是睾丸决定因子的最佳候选基因，在胚胎发育早期的性组织中有短暂的表达，导致原始性腺组织向睾丸组织分化。SRY基因的缺失或突变是造成性发育异常的主要原因之一。对性发育异常患者进行SRY基因检测，有利于了解该类患者的遗传学病因，为其诊断和治疗提供科学依据。 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,本专利申请文件中简称PCR)是一种选择性体外扩增DNA或cDNA的技术，为最常用的分子生物学技术之一。它包括三个基本
步骤(l)变性加热模板DNA，使其解离成为单链；(2)退火使人工合成的一对寡聚核苷
酸引物在较低温度条件下(常为37-60°C )与模板DNA上需扩增目的序列结合；(3)延伸在适宜温度下(一般为72tO，T叫DNA聚合酶以dNTP为原料使引物端向前延伸，合成与一条与模板碱基序列完全互补的DNA新链。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，新合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，使体系中目的片段呈指数迅速增长，将目的基因或某一 DNA片段于数小时内体外扩增至百万倍、千万倍。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与PCR相比，它特异性更强，由引物和探针双重保证，非特异性双链DNA不会产生荧光信号、灵敏度更高、能实现多重反应，具有自动化程度高、有效解决PCR污染、实时性和准确性的优势。
目前检测SRY基因一般采用PCR技术，其观察结果主要为凝胶电泳成像法，耗时、耗力、灵敏度低且易污染。在现有技术中，尚未见应用实时荧光PCR技术检测SRY基因的报道，也未见实时荧光PCR技术中涉及的SRY特异性TaqMan探针引物对及试剂盒的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供SRY特异性TaqMan探针引物对和实时荧光SRY基因检测试剂盒，以提高SRY基因检测的准确性和效率，并有效解决PCR的污染问题。 本发明所述SRY特异性TaqMan探针引物对，由第一引物对、第一探针、第二引物对
3和第二探针组成；所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:l所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO :3所示；所述第二引物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO :5所示，第二探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:6所示。 本发明所述实时荧光SRY基因检测试剂盒，包括样品处理液、PCR反应液I和PCR反应液II ;所述样品处理液为含Chelex 100和蛋白酶K的水溶液，所述水溶液中，ChelexlOO的质量浓度为5% 20X，蛋白酶K的浓度为0. 01 0. lmg/ml ;所述PCR反应液I为含PCR缓冲液Premix Ex T叫、上述第一引物对和上述第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50%，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0. 1 0. 8nmol/ml，第一探针的浓度为0. 1 0. 4nmol/ml ;所述PCR反应液II为含PCR缓冲液Premix Ex T叫、上述第二引物对和上述第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50% ，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0. 1 0. 8nmol/ml，第二探针的浓度为0. 1 0. 4nmol/ml。 使用此试剂盒时，还需要阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为女性外周血白细胞DNA溶液，白细胞DNA的浓度10 g/ml，所述阴性对照为男性外周血白细胞DNA溶液，白细胞DNA的浓度lOi! g/ml ;阴性对照和阳性对照既可由使用者制备，也可作为试剂盒的组分提供。 所述试剂盒中，样品处理液、PCR反应液I、PCR反应液n、阴性对照和阳性对照分别各自单独存放。 本发明具有以下有益效果 1、本发明所述SRY特异性T叫Man探针引物对，针对性别分化异常特殊患者人群设计，该TaqMan探针引物对作为试剂盒的组成部分，提高了SRY基因检测的灵敏度，降低了漏检率的发生。 2、本发明所述实时荧光SRY基因检测试剂盒中的样品处理液实现了从血浆直接检测SRY基因，既大大简化了被检测样品的处理流程，又降低了被检测样品量，使用本发明所述试剂盒运用实时荧光PCR技术进行SRY基因检测，被检测样品仅需10 20 ill血桨，而采用常规PCR技术进行SRY基因检测，被检测样品需100 200 ill全血(被检测样品处理是从全血白细胞中提取核酸)。 3、使用本发明所述试剂盒运用实时荧光PCR技术进行SRY基因检测，整个检测时间縮短为现有常规PCR技术的三分之一，且操作更为简单。 4、使用本发明所述试剂盒运用实时荧光PCR技术进行SRY基因检测，由于实时闭管检测消除了对PCR产物操作，杜绝了 PCR产物的污染。
图1是本发明所述引物探针对的设计示意图。 图2是使用本发明所述SRY特异性引物的普通PCR电泳结果图；图中，1_8 :使用第一引物对，其中1，2为女性样本，3-7为男性样本，8为试剂空白对照；l' -S':使用第二引物对，其中l'，2'为女性样本，3' -7'为男性样本，8'为试剂空白对照。 图3是实时荧光PCR特异性试验结果图，图中，1号曲线、2号曲线为第二探针引物体系男性样本扩增曲线；3号曲线、4号曲线为第一探针引物体系男性样本扩增曲线；5号曲线、6号曲线、7号曲线、8号曲线分别为第一，第二探针引物体系女性对照和试剂空白扩增曲线。 图4是使用本发明所述第一探针引物对的实时荧光PCR敏感性试验结果图，图中，1号曲线为未稀释男性样本扩增曲线，2号曲线为10倍稀释男性样本扩增曲线，3号曲线为100倍稀释男性样本扩增曲线，4号曲线为1000倍稀释男性样本扩增曲线，5号曲线为阴性对照扩增曲线。 图5是使用本发明所述第二探针引物对的实时荧光PCR敏感性试验结果图，图中，1号曲线为未稀释男性样本扩增曲线，2号曲线为10倍稀释男性样本扩增曲线，3号曲线为100倍稀释男性样本扩增曲线，4号曲线为1000倍稀释男性样本扩增曲线，5号曲线为阴性对照扩增曲线。 图6是实施例4中的实时荧光PCR试验扩增结果图，图中，1号曲线为使用第二探
针引物体系的扩增曲线，2号曲线为使用第一探针引物体系的扩增曲线。 图7是实施例5中的实时荧光PCR试验扩增结果图，图中，1号曲线为使用第二探
针引物体系的扩增曲线，2号曲线为使用第一探针引物体系的扩增曲线。 图8是实施例6中的实时荧光PCR试验扩增结果图，图中，1号曲线为使用第二探
针引物体系的扩增曲线，2号曲线为使用第一探针引物体系的扩增曲线。
具体实施例方式
下述实施例中，配制样本处理液、PCR反应液I和PCR反应液II在室温(25 °C )进行，所用水均为无菌水。 实施例1 :SRY特异性T叫Man探针引物对的设计和合成 SRY基因(基因序列号NM_003140)位于Ypll. 3，无内含子，全长897bp，编码204个氨基酸的睾丸决定因子(testis-determining factor，TDF)。所述睾丸决定因子蛋白被分为三个区域，其中间72个氨基酸残基的HMG box(high mobility group box)是主要的功能区域，82%性别分化异常相关突变集中在此结构域。为准确灵敏地检测SRY基因，在设计引物对和探针时，采用了以下设计方案，其设计示意图见图1 : 1.避开突变热点区域和已发现的26个SNPs位点，选择了 SRY基因HMG box以外
的保守区域。 2.考虑到约18X性别分化异常相关SRY基因突变属片段缺失或插入，设计两组引物和探针，分别覆盖HMG box左、右翼区，降低或消除基因缺失引起的假阴性扩增。
3.使用5 'FAM标记和3' TAMRA标记的Taqman水解探针。 SRY特异性T叫Man探针引物对的设计过程中，使用了 NCBI和UCSC数据库，以及NCBI在线Prime 3软件。 所设计的SRY特异性TaqMan探针引物对由第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针组成；所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:1所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列
5表中SEQ ID N0:2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO :3所示；所述第二引 物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:5所示，第二 探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO :6所示。 SRY特异性T叫Man探针引物对的合成采用固相亚磷酰胺三酯法，使用 ABIE^edite 8909核酸合成仪(ABI公司)合成。其合成过程可简述为首先通过固相载 体可控微孔玻璃珠连接、合成、戴帽、氧化四个步骤，将一个脱氧核苷酸连接到固相载体，再 以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团。重复以上步骤直到所有要求合成的碱基被 联接上去。最后通过氨水高温处理，切下寡核苷酸序列。通过聚丙烯凝胶电泳纯化、浓縮、 脱盐、沉淀得到所述探针和引物的纯品。自90年代起，国内外有关核苷酸序列的合成均已 专业化、商品化。因此，将所设计的SRY特异性T叫Man探针引物对交由有关专业公司合成。 本发明的SRY特异性T叫Man探针引物对均交由TaKaRa公司合成。
实施例2 :SRY特异性引物的普通PCR试验 使用全血DNA提取试剂盒(QIAamp DNA mini kit， Qiagen)提取女性和男性外周 血白细胞DNA。然后使用紫外分光光度计(Smart Spec Plus,Bio-rad)测量所提取的女性 和男性外周血白细胞DNA的浓度，并将所述DNA的浓度调整到500ug/ml。所需时间为45 60分钟。 采用普通PCR电泳体系，反应体系由PCR缓冲液(10XPCR buffer,含2. 5mmo1/ L Mg2+)、 dNTP、 T叫DNA聚合酶和实施例1所设计和合成的第一引物对和第二引物对组 成。其中，dNTP浓度为250iimol/L， Taq DNA聚合酶用量为每个反应0. 5U，第一引物对 和第二引物对浓度均为0.5nmol/ml。模板用量为2 iU，总反应体积20 iU。扩增程序 95°C 60s — (95°C 20s — 58°C 20s — 72°C 35s) X40循环。扩增时间70分钟。
扩增结束后在2%琼脂糖凝胶，上样5 iU， 150V电压，电泳35分钟。以DL2000 (上 海闪晶分子生物科技有限公司)为分子量指示(片段从小到大依次为100， 250， 500， 750， 1000， 2000bp)。电泳结果见图2，电泳结果显示，女性样本无扩增，男性样本均有相应扩增产 物(第一引物对应扩增产物长度为135bp，第二引物对应扩增产物长度为95bp)。上述结果 表明实施例1中所设计和合成的SRY特异性引物的普通PCR试验是成功的。
实施例3 :实时荧光PCR试验的特异性和敏感性
试剂组成 (1)样本处理液含Chelex 100 (Sigma-Aldrich公司)禾P蛋白酶 K(Sigma-Aldrich公司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为10X，蛋白酶K的浓度 为0. 05mg/ml。 (2) PCR反应液I :含PCR缓冲液Premix Ex Taq (TaKaRa公司)、第一引物对和第 一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50%，第一引物 对中正向引物和反向引物的浓度均为0. 5nmol/ml，第一探针的浓度为0. 2nmol/ml。
(3)PCR反应液II :含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶 液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50%，第二引物对中正向引物 和反向引物的浓度均为0. 5nmol/ml，第二探针的浓度为0. 2nmol/ml。 所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
特异性试验 取正常男性和女性EDTA抗凝的血浆各10 分别与样品处理液10 混匀， IO(TC孵育8min， 14000rpm离心5min获处理样本上清液。将18 ii 1 PCR反应液I禾P 18 ii 1 PCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的上清 液2iU。将加样后的扩增管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler(Roche公司)上进 行扩增检测，扩增程序为95°C 10s — (95°C 5s — 60°C 20s) X40循环一37°C 5s，运行时间 35min。结果分析选择F1通道。结果见图3，结果显示第一引物探针对和第二引物探针对 扩增体系中，男性样本均有典型扩增曲线，而女性样本均无扩增。上述结果表明采用实施例 1中设计和合成的探针引物及样本处理的实时荧光PCR具有特异性。
敏感性试验 取实施例2中提取的男性外周血白细胞DNA溶液，用灭菌水IO倍稀释，构成 500ii g/ml，50ii g/ml，5ii g/ml，0. 5ii g/ml稀释系列样品。以实施例2中的女性外周血白细 胞提取DNA溶液为阴性对照。将上述配方的18 ii 1 PCR反应液I禾P 18 ill PCR反应液II 分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上稀释系列样品和阴性对照2iU。 将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler (Roche公司)上进 行扩增检测，扩增程序为95°C 10s — (95°C 5s — 60°C 20s) X40循环一37°C 5s，运行时间 35min。结果分析选择F1通道。结果见图4和图5，结果显示第一引物探针对体系和第二 引物探针对体系，稀释系列样本扩增曲线呈间隔3. 2CT值的典型稀释系列扩增曲线。阴性 对照无扩增。上述结果表明采用实施例1中设计和合成的探针引物及样本处理的实时荧光 PCR具有足够的敏感性。
实施例4 :
试剂盒组成 样本处理液含Chelex 100 (Sigma-Aldrich公司)和蛋白酶K(Sigma-Aldrich公 司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为5X，蛋白酶K的浓度为0. 01mg/ml。
PCR反应液I :含PCR缓冲液Premix Ex Taq(TaKaRa公司)、第一引物对和第一探 针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50%，第一引物对中 正向引物和反向引物的浓度均为0. 8nmol/ml，第一探针的浓度为0. 4nmol/ml。
PCR反应液II :含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶液， 所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50%，第二引物对中正向引物和反 向引物的浓度均为0. 8nmol/ml，第二探针的浓度为0. 4nmol/ml。 所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本 处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
实时荧光PCR检测 以正常男性EDTA抗凝血浆为样本，取血浆10 y 1与样品处理液10 y 1混匀，IO(TC 孵育10min， 14000rpm离心5min获处理样本上清液。将上述配方的18 y 1 PCR反应液I和 18iUPCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的 上清液2 iU。将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler (Roche 公司)上进行扩增检测，扩增程序为95°C 10s — (95°C 5s — 60°C 20s) X40循环一37°C 5s，运行时间35min。结果分析选择Fl通道。结果见图6，结果显示第一引物探针体系扩增CT 值为26. 50，第二引物探针体系扩增CT值为26. 14。
实施例5 :
试剂盒组成 样本处理液含Chelex 100 (Sigma-Aldrich公司)和蛋白酶K(Sigma-Aldrich公 司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为12X，蛋白酶K的浓度为0. 06mg/ml。
PCR反应液I :含PCR缓冲液Premix Ex Taq(TaKaRa公司)、第一引物对和第一探 针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50%，第一引物对中 正向引物和反向引物的浓度均为0. 6nmol/ml，第一探针的浓度为0. 3nmol/ml。
PCR反应液II :含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶液， 所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50% ，第二引物对中正向引物和反 向引物的浓度均为0. 6nmol/ml，第二探针的浓度为0. 3nmol/ml。 所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本 处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
实时荧光PCR检测 以正常男性EDTA抗凝血浆为样本，取血浆10 y 1与样品处理液10 y 1混匀，IO(TC 孵育10min， 14000rpm离心5min获处理样本上清液。将上述配方的18 y 1 PCR反应液I和 18iUPCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的 上清液2 iU。将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler (Roche 公司)上进行扩增检测，扩增程序为95°C 10s — (95°C 5s — 60°C 20s) X40循环一37°C 5s， 运行时间35min。结果分析选择Fl通道。结果见图7，结果显示第一引物探针体系扩增CT 值为29. 05，第二引物探针体系扩增CT值为26. 02。
实施例6 :
试剂盒组成 样本处理液含Chelex 100 (Sigma-Aldrich公司)和蛋白酶K(Sigma-Aldrich公 司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为20X，蛋白酶K的浓度为0. lmg/ml。
PCR反应液I :含PCR缓冲液Premix Ex Taq(TaKaRa公司)、第一引物对和第一探 针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50%，第一引物对中 正向引物和反向引物的浓度均为0. lnmol/ml，第一探针的浓度为0. lnmol/ml。
PCR反应液II :含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶液， 所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50% ，第二引物对中正向引物和反 向引物的浓度均为0. lnmol/ml，第二探针的浓度为0. lnmol/ml。 所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本 处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
实时荧光PCR检测 以正常男性EDTA抗凝血浆为样本，取血浆10 y 1与样品处理液10 y 1混匀，IO(TC 孵育10min， 14000rpm离心5min获处理样本上清液。将上述配方的18 y 1 PCR反应液I和 18iUPCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的 上清液2 iU。将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler (Roche公司)上进行扩增检测，扩增程序为95°C 10s — (95°C 5s — 60°C 20s) X40循环一37°C 5s， 运行时间35min。结果分析选择F1通道。结果见图8，结果显示第一引物探针体系扩增CT 值为〉35，第二引物探针体系扩增CT值为〉35。
实施例7 :本发明所述方法与现有方法时效性比较 发明所述方法(时间/单个标本)从实施例4， 5和6提取单个样本分析时间。
样本处理时间15分钟； 反应体系配置和上样5分钟； 扩增检测35分钟； 结果分析5分钟； 总时间60分钟。
现有普通PCR方法从实施2例提取单个样本分析时间
样本处理外周血白细胞基因组核酸提取45 60分钟；
反应体系配置和上样5分钟；
扩增普通PCR扩增70分钟； 结果分析电泳上样，电泳和凝胶成像约需45 55分钟；
总时间:165 190分钟。
权利要求
SRY特异性TaqMan探针引物对，其特征在于由第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针组成；所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO1所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO3所示；所述第二引物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO5所示，第二探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO6所示。
2. —种实时荧光SRY基因检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括样品处理液、PCR反应液I和PCR反应液II ;所述样品处理液为含Chelex 100和蛋白酶K的水溶液，所述水溶液中，Chelex 100的质量浓度为5% 20%，蛋白酶1(的浓度为0. 01 0. lmg/ml，所述PCR反应液I为含PCR缓冲液Premix Ex Taq、权利要求1所述第一引物对和权利要求1所述第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为[50 % ，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0. 1 0. 8nmol/ml，第一探针的浓度为0. 1 0. 4nmol/ml，所述PCR反应液II为含PCR缓冲液Premix Ex Taq、权利要求1所述第二引物对和权利要求1所述第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50 % ，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0. 1 0. 8nmo 1/ml ，第二探针的浓度为0. 1 0. 4nmol/ml。
3. 根据权利要求2所述的实时荧光SRY基因检测试剂盒，其特征在于还包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为女性外周血白细胞DNA溶液，白细胞DNA的浓度lOi! g/ml，所述阴性对照为男性外周血白细胞DNA溶液，白细胞DNA的浓度10 g/ml。
全文摘要
SRY特异性TaqMan探针引物对，由第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针组成；所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO1所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO3所示；所述第二引物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO5所示，第二探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO6所示。一种实时荧光SRY基因检测试剂盒，包括样品处理液、PCR反应液I和PCR反应液II。
文档编号C12Q1/68GK101792802SQ20101010824
公开日2010年8月4日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者宋兴勃, 应斌武, 张磊, 王兰兰, 陆小军 申请人:四川大学华西医院