专利名称：特异性扩增hBex1基因的引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一对特异性扩增/^exl (Homo sapiens brain expressed, X-linked 1 )基因的引物及其在检测生物样品中/^exl基因的表达水平中 的应用。
(二)
背景技术：
目前，化学药物治疗是临床治疗慢性髓系白血病细胞的主要方法，然 部分患者在获得一定时间的緩解期后，由于对化疗药物产生了继发性耐 药，导致病情迅速展。判断患者是否发生了继发性耐药，目前只能通过患 者用药后的临床表现来评价，缺乏经济、迅速有效的检测手段。
Bex (Brain expressed, X-linked)是一类小分子信号转导中介体，目 前发现5个高度同源的成员，即Bexl (TCEAL8), Bex2, Bex3, Bex4 (TCEAL7 )， Bex5, —般认为Bex位于P75NTR/TrkA/B通路下游的细胞 死亡前体(NADE)。 Bex基因属X染色体连锁基因家族，其基因的功能 目前尚未完全明了 ，近期的研究显示/z5exl基因在获得性耐药的慢性髓系 白血病细胞中表达水平明显下降。
(三)
发明内容
本发明正是基于此研究发现，设计了一对可以特异性扩增/^exl基因 的引物，通过PCR技术检测生物样品中/^exl基因的表达水平，以协助 判断慢性髓系白血病细胞是否存在获得性耐药。
本发明采用的技术方案是
特异性扩增/^exl基因的引物，序列如下上游序列5'画GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA-3'; 下游序列5'-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC画3'。
本发明还涉及所述的引物在检测生物样品/28exl基因的表达水平中
的应用，应用所述的引物通过PCR技术特异性扩增生物样品中的/LBexl 基因，从而检测其/z5exl基因的表达水平，判断慢性髓系白血病细胞是 否存在获得性耐药。若Mexl基因的表达水平若表达水平明显下降，则 说明样本待检测生物样品的/^exl基因获得性耐药，反之没有产生耐药 性。应用本发明的引物进行PCR,扩增效率高，特异性强，只扩增出一 条DNA条带。因此可用于检测生物样品中/z5e:d基因的表达水平，协助 判断慢性髓系白血病细胞是否存在获得性耐药。/LBexl基因序列如SEQ IDNO.l所示。
具体的，所述的应用为以待分析样品RNA反转录获得的cDNA为 模板，加入所述特异性扩增/z&xl基因的引物、PCR緩冲液、脱氧三磷 酸核苷混合物、DNA聚合酶和Mg"配成PCR反应液，进行PCR扩增反 应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得DNA片段即为/^exl基因。 所述应用的关键在于特异性^ 1物的设计，PCR反应液中的其他组分， 比如DNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物等，均可参照本 领域常规组成。所述脱氧三磷酸核苦混合物通常为dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物质的量比l: 1: 1: 1的混合物。
具体的，所述PCR反应液终浓度组成如下 PCR緩冲液 终浓度为lx dNTP(dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP )各100~400 ju mol/L 特异性扩增/z&:cl基因的引物 各50 200 ja mol/L
模板 1(T3 10"g/LTaqDNA聚合酶 1 5U/反应 Mg2+: 0.5 5mmol/L 溶剂为ddH20。
所述PCR扩增反应条件如下94。C变性2分钟后，进行如下35个循 环94。C变性15S， 58。C退火30S, 72。C延伸30S。
PCR緩冲液终浓度为lx,是指PCR緩沖液中各组分在反应液中的 终浓度与1 x PCR buffer相同。10xPCR buffer组成为100mmol/l Tris-HCl pH8.3, 15mmol/LKCl， 0.01% (W/V)明胶，溶剂为DEPC水。
本发明的有益效果主要体现在应用本发明的引物进行PCR,扩增 效率高，特异性强，只扩增出一条条带，可用于检测生物样品中/^exl 基因的表达水平，协助判断慢性髓系白血病细胞是否存在获得性耐药。
(四)
图1为ASexl基因在耐长春新i成的K562细胞和K562细胞中的表达量比较。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例1:
所用引物
上游序列Pl: 5'國GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA國3';
下游序列P2: 5'-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC-3'。 所述引物P1、 P2,由上海生工按照引物核香酸序列合成。 模板为红白血病细胞(K562细胞，购于ATCC)和耐长春新碱(VCR)的K562细胞(K562/VCR细胞，浙江大学肿瘤研究所提供)提取RNA 反转录后得到的cDNA。具体方法为德国Qigen公司的RNA提取试剂 盒提取对数生长期细胞总RNA后，用01igodT7-T24 (长度为7、 8、 9、 10……、22、 23、 24的Oligo dT等比例的混合物)作为引物，美国Ambion 公司的IVT MEGAscript T7试剂盒反转录合成双链cDNA，苯酚/氯仿/异 戊醇抽4是纯化，然后经RNeasy mini columns (Qigen,德国)纯化。
所用PCR缓沖液为10xPCR buffer (购于上海生工)，组成为 100mmol/lTris國HClpH8.3, 15mmol/LKCl， 0.01% ( W/V )明胶。
PCR反应液组成
10xPCR buffer: 10uL
四种dNTP混合物 各200umol/L
引物P1、 P2: 各100pmo1
模板 lug
Mg2+: 1.5mmol/L TaqDNA聚合酶(上海生工) 2.5U
上述混合物再加入ddH20至反应体系为lOOuL,弹指混勻，离心15S 将液体甩至底部，在PCR仪上94°C变性2分钟后，进行如下35个循环 94。C变性15S, 58。C退火30S, 72。C延伸30S。运行完毕后各取20uL样 品，进行1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
结果PCR产物由1%琼脂糖凝胶电泳分离，只获得了一条DNA片 段，割胶回收后送上海生工测序显示其序列与SEQ ID NO.l所示的核苷 酸序列完全符合，表明引物P1、 P2能够特异性扩增/zSe;cl基因，结果同 时显示/z5ejd基因表达量在耐长春新碱的K562细胞中较K562细胞明显 下降(见图1, (3-actin为内参，二者表达水平相当)。序列表一ST25.txt
SEQUENCE LISTING <110>浙江大学
<120>特异性扩增hBexl基因的引物及其应用
<130>
<160> 3
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 862
<212〉 DNA
<213> Human astrovirus
<400〉 1
cttggcggtg acgcacggcc ctcacgtgac cgggagctgc agagctacgc agccttcggt 60 gcagtcgtca ctcgtgtctc gctaccagct ccccgctgcc ctgcgctcgg cgggctggca 120 tccggcccgg gggaaagcgg accagccctt ctgcaggtct gcggggccaa gtgtcccggc 180 ggcgcacctc gtggcgagaa tcgggagaag gaggagacta caaggategg cccaggagta 240 atggagtcca aagagaaacg agcagtaaac agtctcagca tggaaaatgc caaccaagaa 300 aatgaagaaa aggagcaagt tgctaataaa ggggagccct tggccctccc tttggatgct 360 ggtgaatact gtgtgcctag aggaaatcgt aggcggttcc gcgttaggca gcccatcctg 420 cagtatagat gggatatgat gcataggctt ggagaaccac aggcaaggat gagagaagag 480 aatatggaaa ggattgggga ggaggtgaga cagctgatgg aaaagctgag ggaaaagcag 540 ttgagtcata gtctgcgggc agtcagcact gacccccctc accatgacca tcatgatgag 600 ttttgcctta tgccctgaat cctgatggtt tccctaaagt tattacggaa acagacccct 660 gctttcgaat ttacatgttc atgatgtgcc cttgttgtaa acctttacct gtcacttgtt 720 tacgtgggtc tcctattacc agcttctaat tgaatattgt gtttttgaac cagtctgtaa 780 gatttttgtt agcagaagaa ttttacctat tgcatggaaa gatgctcatt atagtgaagt 840 taataaagca cctttaaaaa gc 862序列表—ST25.txt <210> 2 — <211> 30 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 2
gatcgtctcg agcaggagta atggagtcca 30
<210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 3
tctgctggat cctcagggca taaggcaaaa etc 3权利要求
1. 特异性扩增hBex1基因的引物，序列如下上游序列5′-GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA-3′；下游序列5′-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC-3′。
2. 如权利要求1所述的引物在检测生物样品/LBexl基因的表达水平中的 应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为以检测生物样 品RNA反转录获得的cDNA为模板，加入所述特异性扩增Mejd基因 的引物、PCR緩沖液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和Mg2+ 配成PCR反应液，进行PCR扩增反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 分离，获得DNA片段即为/z&xl基因。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR反应液终浓度组成如 下PCR緩冲液 dNTP特异性扩增/^exl基因的引物 模板TaqDNA聚合酶 Mg2+:终浓度为1x各100 400|amol/L 各50 200 n mol/Lio-3~ioVl1 5U/反应 0.5 5mmol/L溶剂为ddH20。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下 94。C变性2分钟后，进行如下35个循环94。C变性15S, 58。C退火30S, 72。C延伸30S。
全文摘要
本发明提供了一对特异性扩增hBex1(Homo sapiens brainexpressed，X-linked 1)基因的引物及其在特异性扩增hBex1基因中的应用。所述特异性扩增hBex1基因的引物序列如下上游序列5′-GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA-3′；下游序列5′-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC-3′。本发明的有益效果主要体现在应用本发明的引物进行PCR，扩增效率高，特异性强，只扩增出一条条带，可用于检测生物样品中hBex1基因的表达水平，协助判断慢性髓系白血病细胞是否存在获得性耐药。
文档编号C12Q1/68GK101532059SQ20091009754
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者丁克峰, 庞林荣, 朱永良, 乾 肖 申请人:浙江大学