专利名称：：甘草黄酮的药物用途的制作方法
技术领域：
：本发明属药物用途，涉及甘草黄酮的药物用途，具体涉及甘草黄酮在制备治疗肺部急性炎症性疾病药物或保健品中的应用。
背景技术：
：在我国，甘草药用历史悠久，得到广泛的应用。传统医学认为其有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，有"十方九草"之说。甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(GlycyrrhizaLinn.)多种植物的根和根茎a据(中华人民共和国药典》2005年版一部记载其原植物有3种，即乌拉尔甘草G.uralensisFisch.、胀果甘草G.inflateBat和光果甘草G.glabraL.。随着药学及其相关学科以及科研设备的发展，人们对甘草的认识也越来越丰富。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱和氨基酸等化学成分，具有广泛的生理活性。甘草酸和甘草次酸以前研究较深入，但近年来人们发现其中黄酮类成分有较强的生物活性，已成为新的研究热点。迄今为止，已从甘草中分离出150多个黄酮类化合物，可分为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类、双氢黄酮类、双氢査尔酮类等(中国中药杂志.2003;28(7):593-597)。已经研究证实的有抗肿瘤作用、抗氧化作用、抗HIV作用、抗溃疡作用、抗心律失常作用和保肝作用等，但抗肺部炎症性疾病的作用研究尚未见有报道，特别是用于治疗急性肺损伤(AcuteLungInjury,ALI)，急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome,ARDS),严重急性呼吸器官综合症(SevereAcuteRespiratorySyndrome,SARS)，过敏性哮喘(AllergicAsthma)和慢性阻塞性肺部疾病(ChronicObstructivePulmonaryDisease,COPD)等疾病的报道。ALI、ARDS、SARS、COPD和哮喘都属于各种原因引起的肺部急慢性炎症性疾病，是一种常见而严重的临床综合症并影响病人的生命安全。而目前对上述疾病的药物治疗手段有限，主要是早期应用糖皮质激素的，而糖皮质激素虽然可以抑制炎症细胞的聚集以及炎症介质的释放等优点，但也会带来各种类型的副作用以及不良反应，例如抑制了机体的免疫反应，对机体的代谢功能，水盐平衡等产生不良影响，而这些与患者的症状相互重叠，长期应用糖皮质激素对机体的各个系统也产生深重的不良影响，因此，寻找有效而副作用更低的抑3制急性期炎症细胞聚集和释放的药物是十分必要的。
发明内容本发明的目的是提供甘草黄酮在制备治疗肺部急慢性炎症性疾病的药物中的应用。所述肺部急慢性炎症性疾病包括急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸器官综合症(SARS)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)和哮喘等疾病。本发明所涉及的肺部急慢性炎症性疾病还包括其他原因引起的以肺部的炎症细胞渗出和炎症介质大量释放的炎症性变化。本发明是以甘草黄酮为主要活性成分，单独或加入常规的赋形剂、调味剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适于临床上使用的剂型，如胶囊剂、片剂或口服液体剂等。制剂规格为按每粒(片)含甘草黄酮300mg。本发明的另一个目的是提供甘草黄酮在制备改善肺部急慢性炎症性疾病症状的保健食品中的应用。甘草黄酮来源于天然植物，因此，可以将甘草黄酮制成保健食品，用于改善肺部急慢性炎症性疾病症状引起的咳嗽、痰多和喘息症状。本发明提供的甘草黄酮制备的药物具有很强的抗炎作用，可协同或替代激素在包括急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸器官综合症(SARS)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)和哮喘等疾病中的应用。与激素比较，其特点和优势是不良反应少，引起药源性疾病的可能性较小。图1为LPS诱导小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的聚集及甘草黄酮或地塞米松的影响。图2为LPS诱导小鼠肺水肿及甘草黄酮或地塞米松的影响。图3为甘草黄酮或地塞米松对LPS诱导小鼠支气管肺泡灌洗液中超氧歧化酶下降和肺组织髓过氧化物酶升高的影响。图4为LPS诱导小鼠肺组织TNF-otmRNA和IL-ipmRNA表达及甘草黄酮或地塞米松的影响。图5为甘草黄酮和对LPS气管内滴入2小时后的肺组织和BALF中TNF-a水平上升的抑制作用。图6为肺组织病理变化以及甘草黄酮的改善作用。图7A为甘草黄酮明显减少长期吸烟诱导的支气管肺泡灌洗液中白细胞总数和中性粒细胞的数目。图7B为甘草黄酮明显减少长期吸烟诱导的气道上皮细胞表皮生长因子(EGF)-P的表达。图7C为甘草黄酮明显抑制长期吸烟诱导的肺组织MMP-9、TNF-oc和MPO蛋白水平。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例l一、甘草黄酮对小鼠急性肺部炎症的作用ALI、ARDS、SARS、COPD和哮喘等疾病有一个共同的动物模型，即内毒素脂多糖(LPS，Esherichiacoli)诱导的小鼠肺部炎症模型。我们首先模拟临床急性肺部炎症建立了这一小鼠的动物模型，应用该模型研究后发现本发明的甘草黄酮制备的药物，以3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的剂量能降低LPS诱导小鼠ALI模型的肺组织TNF-ct水平升高，减轻肺组织中性粒细胞浸润程度，抑制毛细血管通透性，减少蛋白渗出及肺水含量，降低BALF上清的MPO水平，改善肺组织炎症病理变化。这些结果提示甘草黄酮具有抗炎、抗氧化、减轻肺水肿等多方面作用，可以用于临床治疗急性肺损伤。1实验材料与方法1.1实验动物清洁级(GradeII)ICR品系小鼠(体重2022g)，浙江大学医学院实验动物中心提供，合格证号SYXK(Zhe)20040052。所有的操作和实验流程均遵守《实验动物管理条例》。动物在实验前均自由进食和进水。1.2主要试剂和设备甘草黄酮(简称LF)由本实验室提取，经HPLC测定主要成分为甘草黄酮，含总黄酮50%以上，以甘草苷和甘草苷芹糖为主要成分，不含甘草酸；月旨多糖(LPS，Esherichiacoli0127:B8，Sigma公司，批号056k5062);地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业股份有限公司，批号20070810);髓过氧化酶(MPO)和超氧岐化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所，批号分别为20070509，20080214);01igod(T)18，核糖核酸分解酶抑制剂，逆转录酶M-MLV，5x逆转录酶M-MLV缓冲液，dNTPMixture,Taq，100bpDNAmaker等均购于Takara公司产品；TNF-a和IL-1卩以及p-actinPCR引物购于上海生物工程有限公司；Trizol试剂购于Sigma公司；琼脂糖，BiowestAGAROSE;Tween20，AMRESLO;溴化乙锭(EB)，上海华美公司；小鼠TNF-aELISA试剂盒(E025809,eBioscience);小鼠IL-l卩ELISA试剂盒(20080225，晶美生物工程有限公司)；其余试剂，国产分析级。冰冻离心机(Eppendorf，Germany);低温超速离心机(Beckman，USA);酶标仪Elx800(Bio曙TekInstrumentINC，USA);PCR仪(Eppendorf，Germany);显微镜(OlympusBX51，Japan);PCR仪(Eppendorf，Germany);核酸紫外分析仪(Eppendorf，Germany);凝胶成像系统(UVPcompanylimited,England);水平电泳仪(CLP,USA)。1.3实验设计将实验动物随机分为6组，即对照组(control)、模型组(LPS)、甘草黄酮(3、10、30mg.kg")组+LPS和地塞米松(DXM，1mg.kg陽1)十LPS组。小鼠乙醚麻醉后，找准气管将LPS直接气管内滴入(4mg.kg"，20pl/10g),对照组滴入相同容积的生理盐水，甘草黄酮组和DXM组分别于造模前给药5次(6h/次)和造模后灌胃给药2次(8h/次)，共7次。对照组给予相同容积的生理盐水灌胃给药。1.4支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数和分类计数造模24h后将小鼠麻醉后股动脉放血处死，暴露气管行气管插管，用PBS液1.5ml分3次进行支气管肺泡灌洗，回收率达80%，冰浴保存BALF，混匀后进行细胞计数，剩余BALF4"C，1500rpm离心10min，取细胞沉淀涂片，Wright染色，细胞分类计数；留取上清液，储存于-8(TC备用。1.5MPO和SOD测定取-80'C保存的BALF上清测定SOD的含量，取5%的肺组织匀浆测定MPO。BALF上清和肺组织匀浆在4。C，10,000rpm离心15min，取其上清液，用试剂盒测定MPO和SOD的含量，测定方法参照厂商提供的使用说明书。1.6肺水含量与肺组织学检查造模24h后将小鼠麻醉后股动脉放血处死，暴露气管，结扎左肺，用10%中性福尔马林固定，HE染色后进行肺组织学检查；取右肺称重(湿重)，置6(TC烘箱48h后称干重，肺湿重/干重比值代表了肺水含量，根据(湿重一干重)/湿重公式计算肺水含量。1.7细胞因子mRNA表达的测定造模6h或24h后将小鼠麻醉后股动脉放血处死，暴露肺，取肺组织置液氮罐备用。实验时肺组织制成10%的组织匀浆，4°C，10，000rpm离心15min，分装吸取的上清至-80。C冰箱保存备用。采用半定量RT-PCR技术检测。TNF-a和IL-1p引物序列见表1。表1TNF-a和IL-ip引物序列细胞因子引物序列序列长度6TNF-aSense:5，-AGCCGATGGGTTGTA-3'Antisense:5，-ACTTGGGCAGATTGA-3'266bpIL-1卩Sense:5，-GCTTCAGGCAGGCAGTAT-3Antisense:5'-ACAAACCGCTTTTCCATCT-3,475bpp-actinSense:5'-CTGCCCTGTATGCCTCTG-3Antisense:5'陽ATGTCACGCACGATTTCC-3218bp1.7.1肺组织总RNA抽提取0.1g左右肺组织加入lmlTrizol匀桨。匀浆液置于4。C，12000rpm离心10min，取上清液。上清中加入0.2ml氯仿，振荡摇匀，静置5min。4°C12000rpm离心15min，取最上层。最上层中加入0.5ml异丙醇，混合均匀，静置5min。4°C12000rpm离心10min，弃上清。沉淀中加入l.Oml冷75°/。乙醇(DEPC水配置)振荡。4°C7500rpm离心5min，去上清，挥干。每管中加入20plDEPC处理的水，使总RNA溶解，经核酸紫外分析仪检测，根据A260/A280比值，确定样品中RNA纯度和含量。1.7.2RT-PCR:RT，l)总RNA2|ug/|il取2pl，加入Oligod(T)182|il、DEPC水8pl，70。C保温10min后迅速冰浴5min。2)每管再加入dNTPMixture10mM2pi、ReverseTranscriptaseM國MLV1|til、5xReverseTranscriptaseM-MLVBuffer4pl、RibonucleaseInhibitorl|ul，42。C保温lh，冰浴5min。3)70。C保温15min后冰浴，得妾(JcDNA，-20°(2备用。PCR扩增CDNA2pl，10xBuffer2.5(^1，25mMMgcl21.5|il,dNTPmix2.5mM0.5nl,上下游引物工作液各l|til,Tag酶0.2(xl，加DEPC水至25pl。1.7.3PCR条件TNF-a和IL-ip(按以下35循环)94°C3min，94°C45s，51.8。C45s，72。C45s，72°C5min;卩画actin(按以下35循环)94°C3min，94°C45s，52°C45s，72°C45s，72°C5min。PCR产物检测采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以P-actin为阳性对照，经凝胶成像分析系统成像、条带密度扫描，以积分光密度(IOD)dL,/(IOD)(p-actin)和(IOD)(F.a)/(IOD)(卩-actin)比值进行半定量分析。1.8细胞因子蛋白水平的测定取BALF灌洗液和10%的肺组织匀浆测定；采用酶联免疫吸附法测定各组小鼠BALF中的TNF-和IL-1的含量。测定步骤按照试剂盒说明书。1.9统计学处理实验数据以平均值士标准差(i±5)表示，采用SigmaStat3.0统计，方法采用Student-Newman-Keuls检验；统计学检验水准a=0.05(双侧)，PO.05表示有显著性差异。2.结果2.1对BALF中白细胞总数和中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数的影响小鼠气道内滴入LPS24h后，模型组支气管肺泡灌洗液(BALF)中的白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目显著上升。白细胞总数和中性粒细胞与对照组比较分别增加了8.6倍和515倍(尸<0.001)，淋巴细胞和巨噬细胞与对照组比较也有明显差异(户O.Ol)。与LPS(模型)组比较，甘草黄酮3、10、30mg.kg"+LPS组和DXM1mg'kg"+LPS组均能显著抑制BALF中的白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目显著增加，参见表2和图1。表2甘草黄酮和地塞米松对BALF中白细胞总数和中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目的影响组别剂量mg/kg白细胞总数中性粒细胞淋巴细胞(108丄")巨噬细胞(10S'L-1)对照组2.08±0.640.32±0.641.06±0.210.70±0.61LPS0.9%Nacl22.04士3.1(f^16.83士1.99鹏4.19±2.17##1.02±0.57##35.94土2.84"'2.03±0.73"*3.35±2.980.56±0.07'*甘草黄酮+LPS105.38±2.60"*2.75±1.74"*2.34土1.09'0.29±0.19**303.61±2.08"*0.52±0.58***2,82土0.99'0.27土0.1广地塞米松+LPS14.13土2.67'"1患1.01'"2.63±1.53*0.45±0.46*n=7~8;糾户O.01,并并弁户<0.001wcontrolgroup(C);*尸<0.05，**尸<0.01***尸<0.001vsLPSgroup(M).2.2对肺水含量的影响对照组肺水含量为32.95±3.27%，模型组为39.48±2.06%，与对照组比较(尸O.01);甘草黄酮3mg.kg"组为36.25±2.74%，与模型组比较(尸〈0.05);10mgkg-1组为36.77±1.83%(尸<0.05);30mg.kg"组为35.06±4.61%CPO.05);DXM1mgkg"为33.47±4.51%(户O.Ol)，参见图2。2.3对BALF中MP0和S0D的含量的影响小鼠气道内滴入LPS24h后，模型组BALF中的SOD活力单位明显下降，肺组织中的MPO活力单位明显升高CP<0.05)。与LPS(模型)组比较，甘草黄酮3、10、30mg.kg"+LPS组和DXM1mgkg"+LPS组均能显著提高BALF中的SOD活力单位，显著减少肺组织中的MPO活力单位，参见表3和图3。表3甘草黄酮或地塞米松对LPS诱导小鼠支气管肺泡灌洗液中超氧歧化酶下降和肺组织髓过氧化物酶升高的影响组别剂量超氧歧化酶髓过氧化物酶(U/ml)(U/glungtissue)对照组0.9%Nacl3.47±0.390.89±0.13LPS0.9%Nacl2.41土0.70#1.30±0.30,甘草黄酮+LPS33.88±0.56**0.95±0.10*'103.77±0.27**0.77±0.33303.80±0.23**0.63±0.11地塞米松+LPS13.43±0.51**0.74±0.10**'^±s，n=7;x±y,n=8;Comparingwithmodel*尸<0.05;**尸<0.01;***尸<0.001.2.4对肺组织匀浆中TNF-amRNA和IL-1PmRNA表达影响小鼠气道内滴入LPS6h或24h后取肺组织，匀浆后测定TNF-amRNA和IL-1(3mRNA表达。结果显示参见图4，滴入LPS6h的TNF-amRNA和IL-lpmRNA表达水平高于24h(见表4)。滴入LPS6h的TNF-amRNA与对照组比较有明显差异(尸O.Ol)，24h的TNF-amRNA与对照组比较无明显差异(尸>0.05)。滴入LPS6h或24h的IL-113mRNA表达与对照组比较均有明显差异(尸<0.05)。甘草黄酮30mg.kg"能明显抑制滴入LPS6h或24h的IL-l卩mRNA表达(尸<0.05)，也能明显抑制滴入LPS6h的TNF-amRNA表达(尸<0.01)，但对24h的TNF-amRNA表达无作用。DXM1mg.kg"仅对6h的TNF-amRNA和IL-l(3mRNA表达有明显作用(尸<0.05)，对24h的两个细胞因子表达均无作用。表4甘草黄酮对LPS诱导小鼠肺组织TNF-a和IL-lpmRNA表达的影响.组别Dosemgkg-1xtimesTNF-amRNAIL-l卩mRNA6h24h6h24h对照组0.16±0.0510.15±0.0300.40±0.190.36±0.20LPS0.31±0.017##0.24±0.0310.78±0.28#0.54±0.21##甘草黄酮+LPS10x70.39±0.100.24±0.0770.79±0.150.60±0.1630x70.24±0.039*'0.23±0.0330.45土0.06'0.30±0.077*地塞米松+LPS1x70.24±0.048*0.28±0.0410.57土0.19'0.56±0.18王±5，n=5~6;存尸<0.05,**尸<0.01vscontrolgroup;*尸<0.05,**尸<0.01wLPSgroup.2.5对LPS气管内滴入2小时后的肺组织和BALF中TNF-ot水平上升的抑制作用小鼠气道内滴入LPS2h后支气管肺泡灌洗和取肺组织，离心和匀浆后用ELIESA法测定TNF-a蛋白水平。结果显示滴入LPS2h的TNF-a蛋白水平与对照组比较有明显差异(尸O.OOl)。甘草黄酮IO、30mg'kg"能明显抑制滴入LPS2hTNF-a蛋白水平，阳性对照药地塞米松lmg'kg"也有明显抑制作用，参见表5和图5。表5LF对LPS气管内滴入2小时后的肺组织和BALF中TNF-a水平上升的抑制作用.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3:hs,n=7~8;,i*<0.001uscontrolgroup;**尸<0.01，***P<0.001wLPSgroup.2.6对肺组织变化的影响气道内滴入LPS24h后，模型组小鼠肺组织间隙可见大量的红细胞渗出和中性粒细胞浸润，肺泡破坏严重，肺泡间隙结构增宽，有透明膜存在，水肿现象明显。甘草黄酮10、30mgkg"和DXM1mgkg"能明显改善这些病理变化，甘草黄酮lmg'kg"作用不明显，参见图6。3.讨论LPS给小鼠气管内直接滴入可诱导免疫细胞介导的炎症反应网络，引起一系列的前炎因子释放，最终导致肺部急性炎症反应]。本研究应用LPS气管内直接滴入法诱导ICR小鼠肺部炎症反应，结果显示滴入LPS(4mg/kg)24h后BALF中的白细胞总数和中性粒细胞数目明显增加；肺水肿明显，表现为肺干/湿重指数增高，病理检查肺组织间隙水肿现象明显；BALF中的SOD下降，肺组织中的MPO增高，IL-ipmRNA表达水平上升，但对TNF-amRNA表达变化不明显。相反，LPS滴入6h后BALF中的白细胞总数和中性粒细胞数目和肺干/湿重指数变化不明显(未显示结果)，而TNF-amRNA表达则明显增高。提示在LPS气道内滴入后首先诱导TNF-a上升，这与Remick等报道的结果一致。有些报道显示LPS气道内滴入后或静脉注射后诱导TNF-a快速上升，肺灌洗液或血液中的TNF-amRNA表达在0.52h达到高峰。LPS首先激活单核吞噬细胞，导致不同的细胞因子和趋化因子释放，其中包括TNF-a，TNF-a在LPS诱导的炎症反应起着重要的作用，可诱导中性粒细胞黏着于内皮细胞，促进中性粒细胞的移动和渗入肺组织，而中性粒细胞活化后释放活性氧代谢产物和蛋白酶，损害耙细胞和耙器官。IL-l(3晚于TNF-a表达和释放。IL-lp与TNF-a一样，也是急性肺损伤病理过程中的一个主要前炎因子，单独应用也可以诱导急性肺损伤，IL-ip诱导的急性肺损伤主要表现为血管渗透性的增强和形成肺水肿，其诱导机制与黏附分子wP6整联蛋白(avP6integrin)和转移生长因子(5(TGF-P)有关，抑制wP6integrin和/或TGF-p可减轻IL-ip诱导的急性肺损伤。IL-1P受体阻断剂可阻断急性肺损伤病人肺水肿液体诱导的肺泡上皮细胞的修复作用，提示在急性肺损伤后IL-1P有修复损伤肺泡上皮细胞的作用。此外，TNF-a与IL-ip也都能通过刺激NF-kB信号传导途径放大炎症介质对靶细胞的作用。本研究的结果表明甘草黄酮对LPS诱导的小鼠肺部急性炎症有很强的保护作用。甘草黄酮能明显抑制TNF-a和IL-lpmRNA表达，这与它抑制中性粒细胞的肺内聚集有密切关系。中性粒细胞在急性肺损伤中是一个主要效应细胞，中性粒细胞释放许多化学介质和细胞因子以及蛋白酶，可增加肺毛细血管的通透性，导致肺水肿。甘草黄酮在抑制BALF和肺组织中的中性粒细胞方面表现出很强的作用，因此，在病理组织检查中可见甘草黄酮对炎症细胞的浸润、出血、肺泡结构破坏和水肿现象均有明显的改善作用。中性粒细胞释放的MPO有很强的氧化作用，氧化反应也是急性肺损伤病理过程中一个重要环节。甘草黄酮对氧化/抗氧化反应有明显的调节作用。体外研究证明，甘草总黄酮对氧自由基的羟自由基有清除和抑制作用，且作用强于维生素E和甘露醇。但整体试验是否有抗氧化作用未见报道，本研究结果表明甘草黄酮能下调MPO水平，上调SOD水平，对氧化/抗氧化反应有调节作用。本研究首次发现甘草黄酮对LPS气管内滴入诱导的肺部炎症反应有明显的保护作用，其抗炎作用可能与抑制肺组织TNF-a和IL-ipmRNA和蛋白表达水平，调节氧化/抗氧化反应有关。二、甘草黄酮对小鼠慢性肺部炎症的作用甘草黄酮对吸烟诱导小鼠急性肺损伤模型的影响每天2次，每次1小时，连续吸烟30天诱导小鼠慢性肺部炎症模型，观察甘草黄酮口服给药对吸烟诱导慢性肺部炎症的保护作用，结果发现甘草黄酮能明显减少支气管肺泡灌洗液中白细胞总数和中性粒细胞的数目(图7A，甘草黄酮与模型组比较*P<0.05;^PO.01)，减少气道上皮细胞EGF-p的表达(图7C，免疫组化，)，抑制肺组织金属蛋白酶(MMP)-9、肿瘤坏死因子(TNF)-a和中性粒细胞髓过氧化酶(MPO)蛋白水平(图7B，ELISA测定)。三、甘草黄酮胶囊处方及制备工艺l处方甘草黄酮300g淀粉32g羟丙基纤维素(L-HPC)6g微粉硅胶4.5g硬脂酸镁1.5g淀粉浆(10%)_适量制成1000粒2处方依据及处方的筛选过程2.1处方依据根据药效学试验制订甘草黄酮胶囊，规格甘草黄酮含量300mg/粒。淀粉本方中为玉米淀粉，色泽好，吸湿性弱，产量大，价格低；为白色细微粉末，不溶于水和乙醇，在空气中很稳定，与大多数药物不起作用，吸湿而不潮解，遇水膨胀，为最为广泛的稀释剂和崩解剂，本方中主要用作稀释剂崩解剂。羟丙基纤维素(L-HPC)本品为白色或白色或结晶性粉末，在水中不溶但可吸水溶胀，由于L-HPC粉末有很大的比表面积和孔隙率，故有较大的吸湿速度和吸水量，增加了膨胀性。本品用量，一般可为1%-5%左右，本方中用量为2%。微粉硅胶，本品为轻质的白色粉末，无臭无味，不溶于水及酸，化学性质稳定，与绝大多数药物不发生反应，良好的流动性，对药物有较大的吸附力，亲水性能强，有利于药物的吸收，本品用量一般仅为0.15%-3%，因为主药甘草黄酮流动性差，本方中用于改善颗粒的流动性，用量为1.5%。硬脂酸镁为白色粉末，细腻轻松，有良好的附着性，颗粒混合后分布均匀而不易分离，仅少量即可显示出良好的润滑作用，一般用量为0.3%-1%，本方中用量为0.5%。2.2处方的筛选过程设计以下三个处方(IOOO粒)规格300mg/粒12表6-l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>按照以上三个处方试制样品，并进行以上处方筛选试验。(1)、进行溶出度试验①、测定方法按中国药典2000年版第二部甘草黄酮胶囊溶出度测定法(附录XC第二法)操作，以0.1mol/L醋酸盐缓冲液(取无水醋酸钠82g加水7500ml，用冰醋酸pH值至5.0，加水使成10000ml)为溶剂，转速为每分钟50转，依法操作，按时取溶液经0.8nm微孔滤膜滤过，取续滤液在482nm处测定吸收度，计算溶出百分率。②、溶出度测定结果分别取供试品，按测定方法测定溶出度，取样时间5，10，15，20，25，30，45，60min，结果见表6-26-2三个处方溶出度测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>处312.924.957.162.875.984.392.194.1方416.127.361.966.776.888.496.397.4513.425.458.963.978.786.194.294.6614.828.858.565.877.886.993.597.1平均溶出(％)14.627.259.865.477.787.194.596.3标准偏差(S)±1.3±1.9±2.1±1.8±1.3±1.9±1.8±1.7116.551.265.786.895.299.198.197.8219.353.168.189.498.199.398.199.3处313.949.463.684.292.496.796.196.1方418.149.966.289.295.498.397.898.3三516.352.364.485.196.798.999.397.1615.451.667.186.393.4111.297.198.5平均溶出(％)16.651.365.886.895.299.198.197.8标准偏差(s)±1.9±1.4±1.7±2.1±2.1±1.6±1.4±1.1根据上表对应的溶出度结果见表6-3。表6-3溶出度测定结果(n=6X±S)溶出度(％)处方5_^__^_^_^__60处方l11.7±1.516.1±2.654.2±2.361.3±3.171.9±1.985.5±2.991.8±1.995.4±1.8处方215.6±1.327.2±1.959.8±2.165.5±1.877.7±1.387.1±1.995.5±1.896.3±1.7处方315.5±1.951.3±1.555.8±1.785.8±2.195.2±2.199.1±1.598.1±1.597.8±1.1结果表明处方3在20分钟溶出度可达到86.8%，30分钟溶出度几乎达到最大。处方l、处方2在20分钟吸光度仅有60分钟的60%，30分钟时溶出度为85%。根据中国药典在30分钟时溶出度达到80%，它们都符合药典要求。由此可见，处方3中低取代羟丙基纤维素(L-HPC)的用量仅为2%，溶出速率明显快于处方l、处方2，可见本方3中加入L-HPC之后，有助于胶囊的崩解而加快了主药甘草黄酮溶出。(2)、休止角试验按处方l、2、3制成颗粒，经口径7cm的长颈漏斗流下，并呈圆锥形状，测其休止角，结果见表6-4表6-4序号处方l处方2处方3休止角31.929.528.314可见处方2、3的休止角小于处方1，说明处方2、3的流动性好于处方1。结论微粉硅胶能显著改善颗粒的流动性能。综上所述，处方3的溶出度、流动性好于处方l、2,所以选定处方3。3生产工艺3.1制备方法制法称取处方量的甘草黄酮、淀粉、和L-HPC混合，过60目的筛三次，混合均匀；加入10%的淀粉浆适量制软材，用16目制粒，60eC干燥，用16目整粒后，加入微粉硅胶、硬脂酸镁混合均匀，用0号胶囊制成1000粒。3.2工艺条件的筛选按处方进行试制1000粒样品。3.2.1堆密度试验将试制的颗粒装入100ml量筒中，以一定的高度落下两次，(每次保持条件一致，松紧适宜，称其重量计算其堆密度，结果见表7-l表7-1堆密度试验数据01=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>因此，根据以上数据可知，颗粒平均堆密度是0.46g/ml，每粒装量要求为30mg，所以选择O号胶囊。3.2.2吸湿性试验考察环境湿度对胶囊填充过程中影响程度，为此测定了颗粒的吸湿性。称取颗粒12份，每份约2g，精密称定，将其置于不同相对湿度环境下放置7天，测其重量变化，结果见表7-2。表7-2吸湿性测定数据表(11=2)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>颗粒重2.04782.07122細32.05732.03742.0165水份重0.027870.03450.04170.04350.05840.0745吸水率1.441.652.012.572.873.67颗粒重2.07872.07452.10232.04332.05672.0647水份重0.02750.03270.03770.05740,06110.0787吸水率1.321.471.702.412.773.81平均吸水率(％)1.371.611.762.402.733.74可见，相对湿度在40-90%条件下颗粒重量基本没有变化，吸湿性没有明显增加。因此，可确定该品种的相对湿度要求不严格，在一般的生产环境下可以生产。不会因为水分对药物性质及稳定性造成影响。4工艺流程图参见图8。二、甘草黄酮缓释放片处方及制备工艺1制剂处方组成1.1每1000片含下列物质甘草苷芹1硬脂酸300g40g200g80g60g(类白色)1000mlHMPC聚乙烯吡咯烷酮(K30)30y。丙烯酸树脂IV号1.2包衣液处方(Y-1-7000)乙醇2.制备工艺2.1粘合剂的配制精密称取丙烯酸32.2片芯的制备取处方量主药甘草黄酮与辅料硬脂酸、HMPC、聚乙烯吡咯垸酮充分混匀后过60目筛，加入30。/。丙烯酸树脂IV号适量，制成干湿适中的软材，24目筛制粒，5(TC烘干30分钟，24目筛整粒，测定颗粒含量合格后，压片即得。2.3包衣2.3.1包衣的依据指IV号适量，用95%乙醇配制成浓度为30%的溶液,备用,甘草黄酮缓释片为薄膜衣片，同时考虑到美观等因素，本品制成薄膜衣片。2.3.2包衣液的配制称取(Y-1-7000)适量，缓缓加入70。/。的乙醇溶液中，配制成6%的包衣液，在磁力搅拌器上不停地搅拌，直至完全溶解，即得。2.3.3取素片置包衣锅内，锅转速每分钟3040转，锅内温度为405(TC，不间断喷包衣液至素片上，直至均匀包上一层薄膜衣，干燥即得。2.4临界相对湿度的测定在一定温度下，取按处方和工艺制得的颗粒适量，分别放置在不同的饱和盐溶液中，放置5天后，取出称重，以不同的饱和盐溶液的相对湿度作横坐标，颗粒在不同的饱和盐溶液中增重百分率作纵坐标，作曲线图，并作曲线的切线，所得两切线的交点为临界相对湿度，且从图得出临界相对湿度为74%。测定结果见下表8-1。表8-1临界相对湿度的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本品颗粒的临界相对湿度为74%(>50%)，说明本品颗粒在密封条件下不吸湿。3.处方依据3.1剂量的确定甘草黄酮缓释片其规格为300mg/片，本品临床上常规用量为每日300~900mg，在确定本品的剂量时，并考虑到方便病人服用，便于剂量调节，故确定为每片含甘草黄酮300mg。3.2处方筛选3.2.1辅料的干扰性试验选择在333nm波长处无吸收干扰的辅料如HMPC、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、淀粉、甘露醇、硬脂酸、丙烯酸树脂等，按处方配比取一片量辅料，加入容器中照含量测定项下方法，测定定量溶液的吸收度，实验结果表明在333nm波长处辅料无吸收。3.2.2处方筛选过程甘草黄酮可溶于水，为了使药物缓慢释放，有效血药浓度能维持较长时间，以达到较好的治疗目的，因此，我们制成甘草黄酮缓释片，为骨架型。目前国内常用的缓释材料有聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素、硬脂酸、羟丙甲纤维素、丙烯酸树脂等。以每片含甘草黄酮30mg，采用上述控释材料中的一种或数种以及不同规格、不同用量组方，进行体外释放度试验，从十多个缓释处方中发现l、2号处方缓释效果较好，但2号处方体外释放度最好，且颗粒的可压性、流动性和处方的重现性均佳，故确定处方2为本缓释片处方。处方筛选过程如下表表8國2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.2.3试制的三批样品检测结果根据确定的处方和制备工艺，试制了三批样品，检测结果如下-表8國3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>从三批试制样品检测结果表明该品确定的处方和制备工艺可行。3.2.4以pH6.8的磷酸盐缓冲液作为本品的释放介质，方法采用转篮法(中国药典2000年版二部附录XC第一法)，转速为每分钟100转，取样点为1小时、3小时和10小时，据此我们重新测定了三批样品及进口片的释放度，结果如下:表8-4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>0802211小时32.13小时54.410小时85.9080223l小时32.13小时54.1IO小时84.1同时对试制的样品(080219)进行了影响因素试验(光照试验、高温试验、高湿试验)，方法与结果如下(1)光照试验在室温条件下，本品去除外包装将样品平摊在平皿里，在45001ux光强度下放置5、IO天后取样检测。结果见表8-5。(2)高温试验本品去除上市包装分别于6(TC的烘箱中放置5、10天后取样检测。结果见表8-6。(3)高湿试验本品去除上市包装分别放入恒湿器皿中，于25t:、相对湿度92.5%敞口放置考核5、IO天后取样检测。结果见表8-7。表8-5光照试验结果条件时间夕卜观*有关物质标示量(%)释放度(%)沃)XXX总杂质lh3h10h5500Lux0510类白色类白色类白色<0.05%<0.05%<0.05%〈0.5%〈0.5%<0.5%99.5199.8898.8942.1±0.442.1±0.841.4±1.155.5±0.855.0±1.554.7±1.485.9±1.385.2±1.085.8±1.1指片芯色泽，薄膜衣均无变化(下同)表8-6.高温试验结果条件时间夕卜观*有关物质标不量(%)释放度(%)沃)Xxx总杂质lh3h10h60°C0510类白色类白色类白色<0.05%<0.05%<0.05%<0.5%<0.5%〈0.5%99.5198.3299.8942.1±0.641.8±1.142.2±1.555.5±0.855.0±1.154.5±1.585.9±1.485.8±1.685.0±1.720表8-7.高湿度试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>4.各辅料在处方中的作用4.1A:具有疏水性，阻止药物的释放。4.2羟丙甲纤维素为亲水性高分子纤维素材料，遇水形成凝胶，降低水向片内渗透的速率，延缓药物的释放，具有缓释作用。国内外已广泛用于缓控释制剂。4.3聚乙烯吡咯垸酮为亲水性高分子材料，遇水形成凝胶，降低水向片内渗透的速率，延缓药物的释放，具有缓释作用。国内外已广泛用于缓控释制剂4.4丙烯酸类树脂商品名为"Eudragit"，因其取代基不同分成各种型号，国外已广泛用来作为控缓释制剂的材料，也用作肠溶衣材料，本处方选择其作为粘合剂，利用其成膜性包裹药物，阻止药物在胃内释放速率。4.5B:为润滑剂。4.6Opadiy:薄膜衣材料，主要成份为羟丙甲纤维素。5.原辅料来源及质量标准5.1甘草黄酮本实验室提取纯化，含量纯度为99%以上。5.2A:符合中国药典2005年版，上海延安油脂化工厂生产。5.3羟丙甲纤维素符合美国药典(USPXXin)，由上海Colorcon公司提供。5.4聚乙烯吡咯烷酮符合美国药典，沈阳东北制药总厂生产。5.5丙烯酸树脂IV:符合中国药典2005年版，由连云港制碘厂生产。5.6B:符合中国药典2005年版，由上海葡萄糖厂生产。5.70padiy:符合英国药典，由上海Colorcon公司提供。权利要求1.一种甘草黄酮在制备治疗肺部急、慢性炎症性疾病的药物中的应用，所述肺部急、慢性炎症性疾病包括急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、严重急性呼吸器官综合症、慢性阻塞性肺部疾病和哮喘疾病。2.根据权利要求1所述的一种甘草黄酮在制备治疗肺部急、慢性炎症性疾病的药物中的应用，其特征在于所涉述的肺部急、慢性炎症性疾病包括其他原因引起的以肺部的炎症细胞渗出和炎症介质大量释放的炎症性变化。3.—种甘草黄酮在制备改善肺部急、慢性炎症性疾病症状的保健食品中的应用。4.根据权利要求1所述的一种甘草黄酮在制备治疗肺部急、慢性炎症性疾病的药物中的应用，其特征在于所制备的制剂以甘草黄酮为活性成分，单独或加入常规的赋形剂、调味剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂或增溶剂中的一种或多种药物辅料制成，制剂规格为按每粒或片含甘草黄酮300mg。5.根据权利要求4所述的一种甘草黄酮制剂，其特征在于所述制剂剂型为胶囊剂、片剂或口服液体剂。全文摘要本发明提供甘草黄酮在制备治疗肺部急、慢性炎症性疾病药物中的应用，所述肺部急慢性炎症性疾病包括急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、严重急性呼吸器官综合症、慢性阻塞性肺部疾病和哮喘等。本发明提供的甘草黄酮制剂具有很强的抗炎作用，可协同或替代激素在包括急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、严重急性呼吸器官综合症、慢性阻塞性肺部疾病和哮喘等疾病治疗中的应用。与激素比较，其特点和优势是不良反应少，引起药源性疾病的可能性较小。甘草黄酮来源于天然植物，也可制成保健食品，用于辅助改善因疾病而出现的症状。文档编号A23L1/29GK101524398SQ20091009749公开日2009年9月9日申请日期2009年4月7日优先权日2009年4月7日发明者吴希美,董新威,谢强敏,谢诒诚申请人:浙江大学