专利名称：产甘草黄酮的重组酵母菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及产甘草黄酮重组酵母菌的技术领域，具体地，本发明涉及通过
离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化获得产甘草黄酮的重组酵母菌。
背景技术：
酵母菌与人类的关系源远流长，目前已建立了酵母菌的基因组数据库和蛋 白质组数据库。酵母菌作为单细胞低等生物，具有易培养、繁殖快、便于基因 操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生或很少有毒物质等特性， 已成为外源基因表达的合适宿主。
甘草(G7j^y r/H'加)是豆科(丄eg讓i"asae)蝶形花亚科(尸—//"幽e 7^6-), 属 多年生深根性草本植物，具有抗寒、耐热、抗盐碱等优良特性，适应性强，生 命力旺盛，根系发达，是荒漠、半荒漠地区保持水土、改良土壤、防风固沙的 重要药用植物，被国家列为重点药材。国内外学者对甘草的化学成分和药理作 用进行了许多研究，认为其主要有效成分是甘草酸和黄酮类化合物。到目前为 止，国内外对甘草酸的研究已经很深入，现已形成规模化生产。而对甘草黄酮 的研究主要集中在化学成分和药理作用上，对它的提取研究较少。所以在甘草 有效成分的生产和开发中，将黄酮作为次要成分随药渣弃去，造成资源的极大 浪费。随着对甘草的深入研究，人们逐步认识到从甘草中提取这两种物质的重 要性，并已做了初步研究，但这些研究大多是利用常规的提取方法，时间长、 成本高、效率低，这些都制约着黄酮工业化生产的发展。
甘草黄酮在医药、保健品、化妆品、食品添加剂等行业上有优良作用，国 内外市场需求日益增大。不少企业投资拟建甘草黄酮生产厂，但目前大部分甘 草加工企业为传统加工，多为原料级粗产品生产，规^莫效益低，生产水平差， 企业粗放经营，粗加工生产附加值低，主要产品单一，产品多限于甘草切片、 甘草膏、甘草霜、甘草酸粉等甘草类制品。甘草作为一种重要药用资源，过于 筒单的原料加工，是对资源的一种严重浪费，而重要有益的甘草黄酮类物质成 分随着甘草废渣一起丟弃，无疑是对企业、国家都是一种重巨大的损失。面对 21世纪天然产物药物提取、药理研究的大浪潮，药用植物的深度开发、应用是 每个中草药加工企业生存的必然要求。
甘草作为国家重点保护的二级野生药材物种。保护甘草资源，合理开发利 用，不仅对现有脆弱的生态环境具有重要意义，而且对国民经济的可持续发展 具有一定的促进作用。甘草黄酮作为一类生物活性较强的成分，在医药、保健 品、化妆品、食品添加剂等方面具有广泛的应用价值，其市场需求日益强劲。 开发出从甘草渣中提取中提取黄酮类物质的研究，有利于资源的科学利用，对 提高产品副加值，农民增收等具有重要的意义。
传统的黄酮提取方法有水浸法、酸碱浸提法、醇提法等，其利用简单的物 理方法提取甘草中的黄酮，效率低且易造成环境污染。而近来利用微波、超声
波辅助提取法、超临界C02萃提法等新型物理仪器提:取黄酮的方法，因提—取效 率较高而受到广泛关注，但由于在生产应用中存在一次性投资过大、操作烦瑣， 使其在工业应用中受到一定程度的制约。
离子束介导转基因是20世纪90年代中国科学院离子束生物技术重点实验 室在研究注入离子与生物体相互作用的基础上，首先提出的一种新的转基因方 法。作为一种全新的转基因手段，离子注入介导转基因有其自身的特点首先， 不需要事先知道或克隆出目的DNA片段，其次可转移DNA大片段，适于多基 因或基因簇的转导；其次，转入的外源DNA是直接整合入宿主总DNA中，因 此具有较好的遗传稳定性。注入离子对细胞具有极强的刻蚀作用，致使细胞表 面形成可使外源DNA进入的通道，这一点与基因枪方法并无差异。注入离子对 细胞的刻蚀和賊射作用属于冷加工性质，不伤及邻近组织和细胞，比产生热效 应的激光束法具有明显的优势。同时由于注入正离子的积累，大大降低了细胞 表面的负电性，从而减少了细胞对溶液中带负电的外源DNA的静电斥力，有利 于外源基因的导入。加之通道局部区域也由于带正电，便于吸引带负电性的DNA 主动进入受体细胞。另一方面，目前离子注入在真空环境中进行，真空造成的 负压使细胞内部的部分水分蒸发，当干燥的细胞进入含有DNA的緩冲液中时， 由于吸胀作用加强，也增加了外源DNA进入通道的机会。此外，离子注入会对 受体细胞内染色体造成直接损伤(如断裂)和间接损伤(如自由基作用)，也增 加了外源DNA与受体细胞DNA重组和整合的机会。正是这些因素使得离子束 介导DNA大分子的遗传转化具有较高的转化率。
实现微生物发酵生产甘草皂苷的技术突破，将对中国干旱半干旱荒漠地区 生态环境的保护和民族制药业的发展产生深远的影响。
发明内容
本发明通过对照现有技术，针对甘草黄酮的提取采用微生物发酵获得未见 报道，而通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化获得有效的微生物菌种 发酵获得甘草黄酮也未见报道。本发明的目的是提供一种为获得甘草黄酮的重 组酵母菌抹。
本发明的技术方案本发明提供了重组酵母工程菌菌抹，通过离子注入介 导甘草总DNA在酵母菌中转化的方法获得的二林产甘草黄酮的重组酵母菌，其 分别为酉良酒酵母(SaccAarawycM cwev/v/ae ) CGMCC 2181和热带假丝酵母 (Cawc/Wa fro/ /cafe) CGMCC 2179,这两种菌种通过传统的发酵工艺都可以 有效获得甘草黄酮。
本发明技术方案中所述的两种菌种都为酵母菌属，具有常规酵母菌的一些 共同的技术特征，都通过传统的发酵技术有效获得甘草黄酮，是基于提取甘草 黄酮共同技术要求前提下实现。
具体地，本发明采用已公开的技术，具体技术已经通过申报国家发明专利， 其申请号为，即通过改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(G7yc;;n^&a wra/era/力并获得总DNA,通过在酵母中转化从而获得本发明产甘草黄酮的两抹
重组酵母菌。
本发明技术方案所用酵母菌并不限于酵母属(&cc/wramyc")、假丝酵母属 (Caw^/a)和其他酵母属通过发酵可获得甘草黄酮，本发明技术效果的再现，同 时在于，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。具 体地，本发明优选为酉良酒酵母(Sacc/wramyces cerev/v/ae) CGMCC. No.2181的 和热带假丝酵母(C朋^fo ^ p/ca/^ ) CGMCC.No.2179。
一方面，本发明提供了一种重组酵母菌抹的菌抹，命名为1027，其主要次 生代谢产物为甘草黄酮。该菌抹已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际 保藏单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京 市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2007 年9月19日，保藏号是CGMCC.No. 2181。根据受体菌的来源，经微生物学鉴 定，1027菌为酿酒酵母(Sacc/zaramycas ce v/v/ae )，该菌林的菌落呈颜色乳白 色，中央隆起，边缘圓整；斜面菌种培养温度28-30。C，培养时间24h;液体 摇瓶培养温度28 _ 30°C ,转速200 - 220 r/m,培养时间96 h。可采用如下方法 对其进行保存采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌种接种于只 要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面，常规培养和保存即可。或是利用真空 冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏即可。本发明进一步 建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。
另一方面，本发明提供了一种重组酵母菌抹，命名为2163,其主要次生代 谢产物为甘草黄酮。该菌林已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏 单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市北 京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2007 年9月19日，保藏号是CGMCC.No.2179。根据受体菌的来源，经微生物学鉴 定，2163菌为热带假丝酵母(Caw^/a fra/ /cafc),该菌株的菌落呈乳白色， 中央隆起，边缘圓整；斜面菌种培养温度30-32。C,培养时间24h;液体摇瓶 培养温度30 - 32°C ，转速200 - 220 r/m，培养时间96 h。可采用上述保存1027
菌的方法对其进行保存。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以通过技术方案获
得的二才朱重组酵母菌，即酿酒酵母(Sacc/iaramyces cereWWae ) CGMCC 2181和
热带假丝酵母(Ca"^fo frap/ca/^ ) CGMCC2179,通过传统的微生物发酵技术
手段有效获得甘草黄酮的有益效果。
附图
i兌明无
具体实施例方式
实施例一产甘草黄酮的重组酿酒酵母菌
采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(G/yc;w^za wra/m^)的总 DNA
取细胞浓度为1.0 x 107CFU/mL的酿酒酵母菌体稀释液0.1mL均匀涂布于直 径90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于LCD1000型离子注入机 小真空靶室的无菌靶台上进行Ar+注入。Ar+注入能量10KeV、剂量15 x 1015ions/cm2,真空度10.3pa。
用2mL乌拉尔甘草总DNA的TE緩沖液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28 °C温育2 h后，洗脱至YEPD平板。
其中，YEPD培养基的成分为(w/v):酵母膏1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%、琼月旨2.0%,其余为无菌水。
将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液， 进行薄层色谱(TLC)检测。获得一抹编号为1027的重组酿酒酵母菌，其培养 液中含有与甘草黄酮标准样品相同Rf值的物质。
重组酿酒酵母菌1027于2007年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为2181。 实施例二产甘草黄酮的重组热带假丝酵母菌
采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(G^c^r/H'za wra/era^)的总 DNA。
取细胞浓度为1.0 x 1(^CFU/mL的热带假丝酵母菌体稀释液0.1mL均匀涂布 于直径90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于LCD1000型离子注 入机小真空靶室的无菌靶台上进行八1"+注入。Ar+注入能量10KeV、剂量15、 1015ions/cm2,真空度10-、
用2mL乌拉尔甘草总DNA的TE緩冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28 。C温育2 h后，洗脱至YEPD平板。
其中，YEPD培养基的成分为(w/v):酵母膏1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%、琼月旨2.0%,其余为无菌水。
将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液， 进行薄层色谱(TLC)检测。获得一抹编号为2163的重组热带假丝酵母菌，其 培养液中含有与甘草黄酮标准样品相同Rf值的物质。
重组热带假丝酵母菌2163于2007年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为2179。
实施例三甘草渣中黄酮类物质的定性、定量测定
定性分性以氯仿曱酸曱醇=5: 0.5: l为展层剂，硅胶薄板层析，利 用黄酮类物质与显色剂作用在紫外光下有特异的绿色荧光，确定甘草黄酮存在。 定量分析以芦丁为标准品，吸取lml80。/。乙醇溶解的适量芦丁加入10ml的 容量瓶中，加0. 4ml 5WaN02摇均放置6Min ,加0. 4ml 10%A1 (N03)摇均放置6Min, 再加4ml 4。/。NaOH,加80°/。乙醇定容至10ml摇均;改置15Min，用扫描分光光度计扫 描，可见其在350、 505nm各有一个峰，其中505处为黄酮类物质特有吸收峰， 确定最佳测定波长为505nm。本实施例可以有效验证提供的菌种发酵获得产物。
通过上述的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述， 而不应当被理解为用来限制本发明的范围。本发明所用酵母菌并不限于酵母属 (&cc/7aram3;cM)、假丝酵母属(Ow^fa)和其他酵母属通过发酵可获得甘草黄酮， 同时在于，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。 另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指重量百分比。
权利要求
1、一种产甘草黄酮的重组酵母，其特征在于，所选用的重组酵母优选为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2181和热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2179。
全文摘要
本发明公开一种产甘草黄酮的重组酵母，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的方法获得的二株产甘草皂苷的重组酵母菌，其分别为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2181和热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2179。实现重组酵母菌发酵生产甘草黄酮的技术突破，将对于干旱半干旱荒漠地区生态环境的保护和发展具有重要意义。
文档编号C12N1/19GK101173227SQ20071018000
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月24日 优先权日2007年10月24日
发明者凌海秋, 樊永红, 武宝山, 毛培宏, 湘 金 申请人:新疆大学