专利名称：高效表达弹性蛋白酶的毕赤酵母及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达弹性蛋白酶的毕赤酵母及其构建方法和应用。
背景技术：
弹性蛋白酶具有较高的经济价值，广泛用于医疗卫生、食品加工、日用化工及环境治理行业中。目前国内弹性蛋白酶的生产方法主要是从动物胰脏中提取，受到脏器资源及生产工艺的限制，成本较高，产量较低，大大落后与市场需求。国内外广泛开展利用微生物发酵生产弹性蛋白酶，在一定程度上缓解了工业用酶，如肉类嫩化剂、化妆品添加剂等方面的需求，但作为医用生化药物仍然有很大的局限。这主要是由于微生物发酵生产的弹性蛋白酶在生物安全性及毒理方面还有一定的不足，其产品的活性和纯度还不能让人满意。
黄春基等人成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的成熟蛋白编码区，并在大肠杆菌中表达(2005)，但基本上为无活性的包涵体形式，还需进一步将蛋白纯化和复性。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种能够高效表达弹性蛋白酶的毕赤酵母。
本发明通过基因工程的方式构建弹性蛋白酶毕赤酵母表达系统，即将弹性蛋白酶基因克隆的载体中，利用酵母表达载体系统，在酵母细胞中真核表达外源弹性蛋白酶。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。此外，它对外源蛋白具有很高的表达量和高分泌性，能够进行翻译后加工，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。
具体地说，通过如下方法构建 1)构建含有弹性蛋白酶基因的表达载体； 2)将所述表达载体转入毕赤酵母，并筛选阳性克隆。
上述弹性蛋白酶基因为编码弹性蛋白酶的任何核苷酸序列，优选编码序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该序列可由产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板克隆得到； 上述表达载体衍生于毕赤酵母表达载体pPIC3.5K，即将所述弹性蛋白酶基因克隆到表达载体pPIC3.5K多克隆位点获得。
上述毕赤酵母优选为毕赤酵母KM71菌株，之所以选择毕赤酵母表达系统，是因为它具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。此外，它对外源蛋白具有很高的表达量和高分泌性，能够进行翻译后加工，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。
上述将表达载体转入毕赤酵母的方法可以是电转化法，当然，可以应用本领域技术人员所知道的任何将表达载体转入酵母细胞的方法，例如采用氯化锂转化法、PEG法等。
上述筛选阳性克隆的方法，包括用MD培养基初步筛选阳性克隆，再用G418抗性进行二次筛选，得到具有弹性蛋白基因高拷贝数的克隆，最后采用酪蛋白-MM平板诱导法，筛选得到高分泌表达的重组菌株。
更具体地说，可通过如下方法进行构建 以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，经PCR扩增得到1.67kb的弹性蛋白基因(扩增的程序为94℃预变性5min；98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃再延伸10min)，扩增结果如图1所示。然后对PCR产物进行T-A克隆，获得质粒pGEM T-easy/PAE，测序后与GenBank中的铜绿假单胞菌序列对比发现同源性99％。仅有三个碱基发生置换如图2，但未引起氨基酸序列的变化。用BamH I和EcoR I分别对pGEMT-easy/PAE(美国Promage公司)和毕赤酵母表达载体pPIC3.5K(美国Invitrogen公司)进行双酶切，将弹性蛋白酶基因切下，转入到表达载体pPIC3.5K中，置于5’AOX启动子的后面，构建了质粒pPIC3.5K/PAE。经过双酶切(图3)和测序验证，证明插入方向正确且未引起碱基序列的变化。
用Sac I对表达载体pPIC3.5K/PAE进行线性化，用电转的方式，将质粒转入毕赤酵母KM71中，利用MD培养基筛选到近500个转化子，再经G418抗性的二次筛选，获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子，如图4。采用酪蛋白-MM平板诱导的方法，成功筛选出高效分泌表达的重组菌株，如图5。
将菌株在新鲜YPD平板上划线，于30℃，倒置培养2天。分别挑取菌株的单菌落，接种于25mL BMGY培养基中，用500mL三角瓶进行培养，直至细胞浓度达到OD600＝2～6。培养条件为28℃、摇床转速为225rpm。室温4000rpm条件下离心5min，收集菌细胞，弃去上清液，用20mL BMMY培养基重悬细胞，开始诱导表达。总共表达4天，诱导表达的培养条件为30℃、摇床转速为250rpm。取发酵液与4℃，10000rpm离心5min去除菌体，将上清液于Tris-HCL缓冲液(pH8.0)中透析过夜，即得到粗酶液(图6)。通过DEAE-Sepharose FF柱纯化，即可获得纯酶(图7)。
把发酵上清直接进行SDS-PAGE电泳，能够得到与天然弹性蛋白酶大小相近的条带(34kDa)，以弹性蛋白为底物的平板水解实验，发现发酵上清能够专一水解底物弹性蛋白，证实了表达产物具有一定的生物活性如图8。以刚果红-弹性蛋白为底物，特定地测定重组弹性蛋白酶的酶活，发现发酵液中粗酶的酶活比铜绿假单胞菌发酵产物高26倍。
测定酶活的方法如下 准确称取10mg刚果红-弹性蛋白，加入pH7.4，0.2mol/L的硼酸缓冲液2mL，再加1mL经过适当稀释的上清酶液，28℃振荡反应3h后，立即用pH6.0，浓度为0.7mol/L的磷酸缓冲液2mL终止反应，10000r/min离心5min后，取上清液于495nm处的测定光密度值，以不加底物的上清酶液作为空白对照。在此反应条件下，每5mL反应混合液495nm处增加0.01个吸光度所需的酶量定义为1个弹性蛋白活性单位(u)。
弹性蛋白酶活性(U/mL)＝(样品的OD495-空白的OD495)×100×稀释倍数 本发明的优点是 (1)首次在真核酵母表达系统中高效表达了具有很高酶活的重组弹性蛋白酶。
(2)重组蛋白的产量高达400mg/ml，发酵液中粗酶的酶活为1060u/ml，比铜绿假单胞菌发酵产物高26倍。
(3)重组蛋白分泌到培养基中，无需破碎细胞且培养基中杂蛋白的含量极少，纯化步骤简单，只需通过一步纯化即可获得纯酶。
(4)适合于大工业规模的高密度发酵，培养基廉价，操作简单。产物具有很高的生物安全性适用于食品和医药等领域。
图1高保真酶扩增铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的琼脂糖凝胶电泳图 其中，1～3PCR扩增产物；MDL2000plus从上至下分子量依次为4000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp； 图2重组质粒的酶切鉴定电泳图 其中，MDL2000 DNA marker从上至下分子量依次为2000、1000、750、500、250、100bp；1重组质粒双酶切产物；2重组质粒； 图3弹性蛋白酶全长基因lasB与GenBank上序列比对结果，方框框出的为不同的碱基； 图4His+转化子含G418的YPD平板上的筛选； 图5在含酪蛋白的MM平板上的筛选高表达转化酵母 其中，1～3转入弹性蛋白酶基因的酵母菌株；4转入空载体的酵母菌株 图6重组毕赤酵母不同菌株诱导表达上清的SDS-PAGE 其中，M低分子量蛋白Marker从上到下依次为(kD)94，62，40，30，20，12；1阴性对照菌株(含pPIC3.5K)；2、3不同的转化酵母菌株； 图7重组弹性蛋白酶通过DEAE-Sepharose FF梯度洗脱图； 图8重组毕赤酵母不同菌株诱导表达上清的活性检测 上排为不同的转化酵母菌株；下排为对照菌株KM71(含pPIC3.5K和不含pPIC3.5K)。
具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1弹性蛋白酶基因的扩增 1.铜绿假单胞菌基因组的提取 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(No.10647)购自北京农学院。
在50mL三角瓶中加入20mL的LB培养基，用牙签挑取新鲜的铜绿假单胞菌单菌落，37℃摇床200rpm震荡培养过夜。将新鲜的菌液倒入10mL离心管中，10000r/min离心5min集菌。倾去培养基上清，加入4mL预热CTAB裂解缓冲液，震荡混匀，置于65℃水浴锅温浴30min，期间每隔10min颠倒混匀数次。10000r/min离心5min，取上清到新的10mL离心管中。加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀。10000r/min离心5min，取上清到新的10mL离心管中。加入等体积的氯仿抽提，10000r/min离心5min，取上清到新的10mL离心管中。加入水相体积2/3的异戊醇于-20℃沉淀1h，随后以12000r/min离心10min。吸净上清液，用适量的75％的乙醇洗涤沉淀，以12000r/min离心5min。吸净上清液，在通风处吹干，然后将沉淀溶于适量的灭菌蒸馏水中，电泳检测其纯度。结果证明基因组提取效果很好。
2.引物的合成 全长扩增上游引物 5′＞GGACCGAGCCAGGGGAGTGCAGTTC＜3′ 全长扩增下游引物 5′＞CGACCCCGACCGGCATTCCTTCCTG＜3′ 引物合成由北京生工公司完成。
3.目的基因的PCR扩增 PCR反应采用50μL体系进行，以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，在0.5mL Eppendorf管中依次加入 无菌蒸馏水 34.75μL 10×Pyrobest Buffer II(Mg2+plus)5μL dNTP Mixture(各2.5mM) 4μL 上游引物(10μM) 2μL 下游引物(10μM) 2μL 基因组DNA(25ng/μL) 2μL Pyrobest高保真聚合酶(10U/μL) 0.25μL 总计50μL 瞬时离心混匀后，按如下反应条件进行扩增94℃预变性5min；98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃再延伸10min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果如图1所示，在1.67kb出现目的条带，与预期相符。
实施例2克隆质粒pGEM-T easy/PAE的构建及鉴定 1.回收铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的PCR产物 将扩增铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的PCR产物，以1％琼脂糖凝胶进行电泳。在紫外灯下迅速切下目的条带，按照TiangenDNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)的说明进行回收。
2.PCR回收产物加A尾巴 在0.5mL Eppendorf管中依次加入 无菌蒸馏水 27μL 10×buffer 5μL dNTP(10mM) 1μL 回收产物 15μL Taq DNA聚合酶2μL 总计 50μL 瞬时离心混匀后，在PCR仪内72℃保温25min后取出，采取胶回收策略回收片段。
3.与pGEM-T easy连接，构建质粒pGEM-T easy/PAE 连接反应采用10μL体系，全部操作均在冰上进行。在0.5mL的Eppendorf管中，依次加入 无菌蒸馏水 3μL 2×Lig Buffer 5μL pGEM-T easy 0.5μL 回收加A尾片段 0.5μL T4DNA Ligase 1μL 总计 10μL 以上各溶液经瞬时离心混匀后，于4℃冰箱进行过夜连接。
4.连接产物对大肠杆菌感受态的转化 开盖前将连接产物离心至管底，于冰上吸取10μL连接产物加入1.5mL的Eppendorf管中；取出-70℃冻存的DH5α感受态细胞，置冰上使其缓慢融化，轻弹管壁使细胞混合均匀；取100μl感受态细胞置于连接管中，混匀，置于冰上30min；于42℃水浴中热击90s，立即冰浴2min；加入800μl无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预培养45min；吸取200μl菌液涂布于LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上，37℃培养16-24h，观察菌落生长情况，利用蓝白斑初筛重组转化体。
5.阳性克隆的鉴定 (1)小量碱法提取质粒 从LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上挑取白色单菌落接种于25mLLB/Kan液体培养基中，37℃振荡过夜。
吸取1mL菌液于1.5mL的Eppendorf管中，于4℃，12000×g离心5min收集菌体。
用0.5mL STE溶液(0.1M NaCl，0.01M Tris-Cl(pH8.0)，0.001MEDTA(pH8.0))重悬菌体沉淀，于4℃，12000×g离心5min，倾去上清，并使沉淀尽量干燥。
用预冷(冰箱放置可直接使用)的100μL溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))重悬，在振荡器上剧烈振荡后，于冰上静置5min。
加入200μL新配置的溶液II(0.2M NaOH，1％(m/V)SDS)，盖紧管帽，快速轻轻上下颠倒5次，使之充分混匀，勿要振荡，并在冰上放置5min。
加入150μL预冷的溶液III(5M乙酸钠60.0mL，11.5mL冰醋酸，28.5mL水)，温和振荡10s后，冰浴5min。
于4℃，15000×g离心5min，然后将上清移入另一干净离心管中。
加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻轻混匀后，于4℃，15000×g离心5min，然后将上层水相转移入另一干净的离心管中。
用等体积或2/3体积的异丙醇沉淀质粒DNA，待上下颠倒4～5次，充分混匀后，于-20℃放置10min。
于4℃，15000×g离心5min，吸去上清。
以1mL预冷的70％乙醇振荡洗涤DNA沉淀1次，于4℃，15000×g离心2min。
倾去上清，再离心2min后，吸尽上清，除尽管壁上的液滴，并在超净工作台上吹干10min。
用20μL无菌水(含20μg/mL的RNaes)溶解DNA沉淀，37℃保温降解1h后，以1％琼脂糖电泳检测质粒后，于-20℃冻存备用。
(2)重组质粒酶切鉴定 无菌蒸馏水15μL 2×H Buffer(TaKaRa公司) 2μL pGEM T-easy/PAE 2μL EcoR I(TaKaRa公司)1μL 总计 20μL 以上各溶液经瞬时离心后，于37℃水浴酶切1.5h，取10μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带。
(3)DNA序列测定与分析 随机选取铜绿假单胞菌弹性蛋白酶全长阳性重组子一个，交由中国农科院进行序列测定，并利用DNAMAN(Version5.0)等软件分析测序结果。结果如图2所示。
实施例3重组表达质粒pPIC3.5K/PAE的构建及鉴定 弹性蛋白酶全长基因lasB的PCR产物和表达载体pPIC3.5K均用BamH I和EcoR I切成双粘性末端，T4DNA连接酶4℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α。通过氨苄抗性培养基筛选，分别挑取单菌落培养，提取质粒，经BamH I和EcoR I双酶切鉴定外源片段的插入情况。基因的克隆、重组子筛选均参照Sambrook的《分子克隆》(第二版)的方法进行 1.带酶切位点的PCR引物的设计合成 根据表达质粒pPIC3.5K多克隆位点(MCS)上的单酶切位点BamH I和EcoR I，和GenBank上报告的铜绿假单胞菌序列(登录号E004883.1)，用引物设计软件设计引物，引物合成由北京生工公司完成。
35Q上游引物 5′＞CGGGATCCATGAAGAAGGTTTCTACGCTT＜3′(下划线为BamH I酶切位点) 35Q下游引物5′＞GCGAATTCTTACAACGCGCTCGG＜3′(下划线为EcoR I酶切位点) 2.高保真酶PCR扩增 方法同实施例1.3，采用Pyrobest高保真聚合酶和引物35Q进行扩增，电泳检测扩增产物，产物回收见实施例2.1。
3.双切双连构建pPIC3.5K/PAE 将回收的lasB的PCR扩增产物和表达质粒pPIC3.5K，分别用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切，酶切反应采用20μL体系，根据模板浓度加适量模板，各反应5管，在0.5mL Eppendorf管中依次加入 无菌水 11μL或2μL 10×H buffer(TaKaRa公司) 2μL 0.1％BSA 2μL 0.1％Triton-100 2μL BamH I(TaKaRa公司) 1μL EcoR I(TaKaRa公司) 1μL pPIC3.5K或lasB 1μL或9μL 总计 20μL 以上各溶液经瞬时离心混匀后，于37℃酶切3-4h，两种酶切产物进行1％琼脂糖凝胶制备电泳，分别回收DNA片断，琼脂糖凝胶电泳粗略估计各回收产物的浓度，按照lasB与pPIC3.5K摩尔比1∶3的比例进行连接反应，按如下反应体系进行 无菌水 4μL 10×连接buffer(Promage公司)1μL pPIC3.5K酶切回收产物 1μL lasB酶切回收产物 3μL T4DNA连接酶(Promage公司) 1μL 以上各溶液经瞬时离心混匀后，于16℃进行过夜连接后，取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化操作步骤大致同实施例2.4。
4.重组表达质粒pPIC3.5K/PAE的鉴定 (1)重组质粒菌液PCR鉴定 PCR模板为重组转化菌的菌液，用引物35Q进行扩增。反应程序大致同实施例1.3。提取的重组表达质粒用PCR方法鉴定知在1.5kb左右处有目的条带扩增出来，与预期结果相符。
(2)酶切鉴定 用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切鉴定，酶切体系同实施例3.3，37℃酶切3h后电泳检测酶切情况。结果同图3，分别得到1.5kb左右和9.0kb的两个片断。
(3)测序及分析 将经PCR和酶切正确的重组子送北京生工生物公司测序。应用DNAMAN(Version 5.0)软件分析测序结果。测序结果同克隆结果一致，碱基序列未发生变化。
实施例4重组质粒pPIC3.5K/PAE转化毕赤酵母菌株KM71(美国Invitrogen公司) 1.制备KM71感受态细胞 (1)取100μL于-70℃冻存的KM71菌株(美国Invitrogen公司)接入2mL新鲜YEPD培养基中，28～30℃摇床180rpm过夜培养后，于新鲜YEPD平板上划线，28～30℃培养2天至单菌落出现。
(2)挑取一个单菌落接种于5mL YEPD培养基中，28～30℃摇床180rpm过夜培养，取出1mL接种于100mL YEPD培养基中扩大培养至OD600＝1.3-1.5，其余可用20％的甘油进行菌种保藏。
(3)于4℃、1500×g离心5min收集菌体细胞，并用100mL冰预冷无菌水重悬菌体细胞。
(4)于4℃、1500×g离心5min收集菌体细胞，再用50mL冰预冷无菌水重悬菌体细胞。
(5)于4℃、1500×g离心5min收集菌体细胞，再用4mL冰预冷的无菌的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞。
(6)于4℃、1500×g离心5min收集菌体细胞，再用0.2mL冰预冷的无菌的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞。置于冰上备用。
2.电转化DNA样品的制备 将pPIC3.5K/PAE用Sac I进行线性化酶切反应，即在0.5mL的Eppendorf管中依次加入2μL 10×酶切缓冲液、0.5μL BSA溶液、3μL重组表达质粒、1μL限制性内切酶Sac I，最后加入无菌水至20μL。可同时多做几管。将以上溶液经瞬时离心混匀后，于37℃酶切过夜。用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，若酶切反应完全，则将各管合并，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，10000g离心5min，取上清液，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇进行线性质粒的浓缩，于-20℃沉淀1h，10000g离心5min，用70％的乙醇溶液洗涤沉淀，-20℃储存备用。
3.毕赤酵母感受态细胞的电转化 在Bio-Rad Gene Pulse电转仪上进行电转化反应。电转化条件为电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，转化时间随DNA样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在3.5-4.0s范围内。
(1)将巴斯德毕赤酵母感受态细胞、重组表达质粒pPIC3.5K/弹性蛋白酶基因的线性化DNA样品及0.2cm电转化杯置于冰上，预冷10min。
(2)在0.2cm电转化杯内将80μL感受态细胞和10μg线性DNA立即混合均匀，冰浴5min后，擦干电转化杯，并迅速置于电转仪上电击1次，然后立即加入1mL冰预冷1mol/L的无菌山梨醇溶液，混匀后，转入1.5mL微离心管中，重新置于冰上。
(3)取0.4mL电转化物均匀涂布于MD平板上。
(4)同法以空质粒pPIC3.5K转化菌株KM71，作为表达的阴性对照。
实施例5高表达基因工程菌的筛选 1.高拷贝毕赤酵母His+转化子的快速筛选 质粒pPIC3.5K拥有细菌的卡那霉素抗性基因可传递抗性给酵母细胞从而使其对抗生素G418产生抗性。将转化的毕赤酵母菌株分别在含有不同浓度G418的培养基中进行培养，其筛选结果如图4所示。随着抗生素G418浓度的不断增加，能够存活的毕赤酵母菌株逐渐减少，最后获得48株抗高浓度G418的菌株，这些菌株很可能含有高拷贝转化子。
(1)将His+转化子点接在新鲜MD平板上，于30℃进行培养直至转化子出现。将转化子置于4℃备用。
(2)利用无菌操作技术，在细胞培养板的各孔中分别加入200μLYPD培养基。
(3)用无菌牙签将MD平板上的His+转化子分别接入各孔中，并搅拌均匀。注意在操作中既要防止杂菌污染同时也应避免转化子之间的交叉污染。
(4)盖好细胞培养板的上盖，将第一批His+转化于30℃静置培养2d。
(5)取另一块新的细胞培养板，并在每孔内分别加入190μL YPD培养基。
(6)依照次序分别向各孔内加入10μL第一批His+转化子，并用移液器将其充分混匀。
(7)盖好细胞培养板的上盖，将第二批His+转化于30℃静置培养1d。
(8)重复操作(4)和(5)，盖好细胞培养板的上盖，将第三批His+转化子于30℃静置培养1d。
(9)用100μL移液器上下反复吹吸毕赤酵母细胞培养物，从而使第三批His+转化子获得充分悬浮。
(10)在不同的YPD/G418平板上(G418的终浓度分别为0、0.50、1.00、2.00、4.00mg/mL)，分别点接2μL相同的His+转化子培养物。
(11)静置30min，待菌悬液被吸干后，将YPD/G418平板于30℃倒置培养，并在第2、3、4或5天观察G418抗性转化子。
2.具有弹性蛋白酶活性的高表达毕赤酵母转化子的快速筛选 利用转化酵母表达的弹性蛋白酶具有广泛的蛋白酶活性，能够在含有酪蛋白的平板上形成透明圈的特性，采用酪蛋白-MM平板(含有1.34％YNB、0.5％甲醇、4×10-5％生物素、1.5％脱脂奶粉、1.5％琼脂)的方法来筛选产酶活高的转化子。结果如图5所示，转有空载体pPIC3.5K的酵母菌株虽然能够在酪蛋白-MM平板上生长，但是不会形成透明圈。根据透明圈大小，可以初步判断产酶量高的高低。
(1)用无菌牙签将MD平板上的His+转化子分别点接在新鲜酪蛋白MM平板上，于30℃倒置培养。注意在操作中既要防止杂菌污染同时也应避免转化子之间的交叉污染。
(2)每隔24h补加甲醇，补加甲醇的量为培养基体积为的2％，补加的方法为，将纯甲醇加入到培养基的盖子上，倒置培养。
(3)第2、3、4或5天观察酪蛋白的降解情况。
实施例6重组弹性蛋白酶的诱导表达 1.重组毕赤酵母菌株的诱导表达 将毕赤酵母菌株在新鲜YPD平板上划线，于30℃，倒置培养2天。
分别挑取菌株的单菌落，接种于25mL BMGY(培养基中，用500mL三角瓶进行培养直至细胞浓度达到OD600＝2～6。培养条件为28℃、摇床转速为225rpm。于室温4000rpm条件下离心5min，收集菌细胞，弃去上清液，用20mL BMMY。
培养基重悬细胞，开始诱导表达。总共表达6天，诱导表达的培养条件为30℃、摇床转速为250rpm。
每天取样0.5mL，并补加100％甲醇至终浓度为1％，如下表所示。在补加甲醇过程中应注意到取样体积及蒸发带来的发酵液体积变化，以便加入适量的甲醇。
将0.5mL发酵液液置于1.5mL微离心管中，4℃10000rpm离心5min。再将上清液转移到另一新离心管中，-20℃保存，备检。
2.发酵上清的SDS-PAGE检测 SDS-PAGE上的蛋白感量约在几十微克范围，只要该蛋白有一定量的基础表达，且不论其是有活性的还是无活性的蛋白，均可以通过此方法加以验证。
准备样品及低分子量蛋白质Marker ①将各菌株培养液上清液置于冰上化冻。
②在1.5mL微离心管中，将100上清液和25μL 5×SDS样品缓冲液充分混合，在沸水浴中煮5min。
③用10μL枪小心上样，尽量使样品在孔的底部成一薄层。样品上样量为20μL，低分子量蛋白质Marker上样量为5μL。空置的加样孔，需加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。
④以80V恒压进行电泳，当样品进入浓缩胶后将电压升至120V。
⑤待溴酚兰跑至胶的底部，取出凝胶，放在合适大小的容器中，用染色液覆盖凝胶，缓慢摇动1-2h。
⑥倾去染色液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动约2h，其间更换脱色液3-4次，直至获得清晰的蓝色条带及干净背景。
SDS-PAGE电泳结果如图6所示。从图中可以看出，在分子量为34KDa左右有一条清晰的蛋白带，与已知的弹性蛋白酶分子量一致。并且从图中发现在发酵上清液中目的蛋白占总蛋白的绝大多数，杂蛋白很少，这将非常有利于蛋白的纯化。用band leader 3.0软件对蛋白条带进行扫描分析，得出表达蛋白占上清总蛋白的90％以上。
3.发酵上清蛋白含量的测定 采用Brandford法测定培养基中总蛋白含量。
(1)标准曲线绘制 a)标准蛋白质溶液100μg/mL牛血清白蛋白(BSA) b)考马斯亮兰G-250溶液称100mg考马斯亮兰G-250溶于50mL90％乙醇，加入100mL 85％(w/v)的磷酸，用蒸馏水定容至1L于棕色瓶，常温可保存一个月。
c)标准曲线绘制 取6支具塞试管，按下表加入试剂 上述各管混合均匀后，向管中加入5mL考马斯亮兰G-250溶液，摇匀，放置3min，用1cm光径比色皿在595nm下测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(2)样品测定 吸取适量样品，加蒸馏水补至1mL，再加入5mL考马斯亮兰G-250溶液，反应3min后再595nm下测吸光度。根据样品吸光度和标准曲线求出样品溶液中蛋白含量，得出培养基中的总蛋白的含量为448μg./mL。可以估算出弹性蛋白酶的含量约为400μg./mL。
实施例7重组弹性蛋白酶的活性检测 (1)弹性蛋白平板法 用弹性蛋白的特异性底物弹性蛋白来检测弹性蛋白酶的活性。在含有弹性蛋白琼脂板上放置灭过菌的牛津杯，用枪加入200μL的发酵上清液，在37℃温箱放置48h，观察弹性蛋白琼脂板上是否有透明的降解圈形成。重组弹性蛋白酶的对弹性蛋白板的降解如图8所示。
(2)吸光度法 准确称取10mg刚果红-弹性蛋白，加入pH7.4，0.2mol/L的硼酸缓冲液2mL，再加1mL经过适当稀释的上清酶液，28℃振荡反应3h后，立即用pH6.0，浓度为0.7mol/L的磷酸缓冲液2mL终止反应，10000r/min离心5min后，取上清液于495nm处的测定光密度值，以不加底物的上清酶液作为空白对照。在此反应条件下，每5mL反应混合液495nm处增加0.01个吸光度所需的酶量定义为1个弹性蛋白活性单位(u)。
弹性蛋白酶活性(U/mL)＝(样品的OD495-空白的OD495)×100×稀释倍数 实施例5获得48株抗高浓度G418的菌株在发酵液中粗酶的酶活为最高为1060u/ml，最低为360u/ml，分别比铜绿假单胞菌发酵产物的酶活高26倍和9倍。
实施例8重组弹性蛋白酶的纯化 1、装柱 参照Amersham的说明书，取10mL DEAE-Sepharose FF加5mL平衡缓冲液，混匀后沿层析柱内壁缓缓倒入层析柱，待有1cm胶沉淀后，打开柱子下端的出口，稳定后在胶的上源留2cm的缓冲液，用十倍体积平衡缓冲液平衡柱子，直至流出液的pH值与平衡缓冲液一致。
2、样品的准备 (1)透析袋的活化 将透析袋置于碱性EDTA溶液(NaHCO320g/L，EDTA 1mmol/L，pH 8.0)中煮沸30min，然后用蒸馏水洗涤干净。
(2)发酵液上清的透析 收集发酵液上清，装于透析袋内，用蒸馏水透析24h，期间更换蒸馏水3-4次。
(3)收集透析后的发酵液上清，根据透析后体积调整Tris浓度至0.02M，pH至7.2(与平衡缓冲液相同)，准备上样。
3、上样 将准备好的蛋白样品以1.3ml/min的流速用蠕动泵流过液，检测流出液中是否有弹性蛋白酶活性从而判断弹性蛋白酶蛋白是否结合到柱上。
4、淋洗 用平衡缓冲液淋洗层析柱，在280nm处检测流出液的吸光度，直至A280达到0.1以下。
5、梯度洗脱 依次用含0.2M NaCl，0.3M NaCl，0.4M NaCl，0.5M NaCl，0.8M NaCl的洗脱缓冲液进行阶段梯度洗脱，每个浓度洗脱2-3个柱体积，控制流速为1.3mL/min，用干净的试管分步收集(每管2-3ml)。检测每管A280及弹性蛋白酶活性。
洗脱纯化图见图7，通过SDS-PAGE电泳验证蛋白的纯度达到99％以上。
6、柱子再生 洗脱完毕后，用再生液清洗层析柱5-6个柱床体积，然后用水清洗直至流出液呈中性，若长期不使用层析柱，用20％乙醇保存。
序列表
权利要求
1.高产分泌重组弹性蛋白酶的基因工程菌构建方法，其特征在于
1)构建含有弹性蛋白酶基因的表达载体；
2)将所述表达载体转入毕赤酵母，并筛选阳性克隆。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体衍生于pPIC3.5K。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤2)筛选阳性克隆的方法是用MD培养基初步筛选阳性克隆，再用G418抗性进行二次筛选，得到具有弹性蛋白基因高拷贝数的克隆，最后采用酪蛋白-MM平板诱导法，筛选得到高分泌表达的重组菌株。
4.如权利要求1～3所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌株KM71。
5.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述弹性蛋白酶基因具有编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述弹性蛋白酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
7.按照权利要求1～6任一项所述方法获得的高产分泌重组弹性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌。
8.权利要求7所述基因工程菌在生产重组弹性蛋白酶中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种高效表达重组弹性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌。通过由铜绿假单胞菌克隆得到弹性蛋白酶全长，构建表达载体，转入到毕赤酵母中，从中筛选出高效分泌表达的菌株。用该基因工程菌株发酵的重组弹性蛋白酶的表达量约为400mg/L，发酵粗酶酶活可达1060U/mL，是出发菌株的26倍。
文档编号C12N1/19GK101182475SQ200710179550
公开日2008年5月21日 申请日期2007年12月14日 优先权日2007年12月14日
发明者许文涛, 黄昆仑, 罗云波, 林希谨, 元延芳 申请人:中国农业大学