蛋白酶在中性粒细胞胞外诱捕网中的底物性质的制作方法
【专利说明】蛋白酶在中性粒细胞胞外诱捕网中的底物性质
[0001] 优先权声明
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请序列号No. 61/799, 658的优先 权，其全部内容通过引用并入本申请。 发明领域
[0003] 本申请涉及中性粒细胞胞外诱捕网，也称为NET。
[0004] 背景
[0005]中性粒细胞是血浆中丰度最高的白细胞。其是针对病原体侵袭产生的应答首先募 集至损伤部位的细胞，并且其是先天性免疫防御的第一道防线。传统上将中性粒细胞认为 是炎性应答和急性免疫的效应细胞，其通过胞内吞噬作用发挥功能，并且使用裂解蛋白酶、 活性氧（R0S)和杀微生物蛋白用于攻击感染剂。最近的研究表明，中性粒细胞还能够通过 表达用于与其他免疫细胞，如树突状细胞、B细胞和T细胞传递信号的细胞因子、趋化因子、 Fc受体和补体成分具有免疫调节能力（Mantovani,Cassatella等，2011)。
[0006] 蛋白酶是中性粒细胞重要的效应器。其不仅具有直接的杀微生物活性，还在趋化 因子、细胞因子和受体的蛋白水解过程中发挥作用（Pham2006 ;Meyer_Hoffert和Wiedow2010)。这种调节活性由IL-1β和IL-18经由NE、PR3和CG不依赖于半胱天冬酶的活化 (Robertson,Young等，2006 ;Guma，Ronacher等，2009 ;Joosten，Netea等，2009)或抗炎性 颗粒蛋白前体经由NE和PR3转化为促炎性颗粒体蛋白（Kenssenbrock，2008)所示例。而 且，已发现NE在中性粒细胞胞外诱捕网（NET)中通过裂解组织因子通路抑制剂将中性粒细 胞介导的炎症与凝血通路偶联。
[0007]NET由在称为NETosis的特定形式的细胞死亡中受到刺激的中性粒细释放。据推 测NETosis代表了针对病原体侵袭产生的应答由中性粒细胞介导的先天性免疫的一种新 机制。（Brinkmann，Reichard等，2004 ;Remijsen，Kuijpers等，2011)。其特征为形成NET， 一种由解聚的染色质、抗微生物蛋白和肽形成的网络。NETosis的作用是先天性免疫防御的 第一道防线，其代表了在多个方面与凋亡和坏死截然不同的一种新的细胞死亡模式。未观 察到核碎裂或膜出泡，并且其活化不依赖于半胱天冬酶的活化，但是其需要NADPH氧化酶 和MAPK激酶通路。NETosis还参与NE、髓过氧化物酶和肽基精氨酸脱亚胺基酶4 ( 一种负责 组蛋白瓜氨酸化和染色质解聚的酶）的活性（胃3即，1^等，2009;?3口3}^1111(^〇111〇8，]^七216『 等，2010)。据推测NET的主要功能是诱捕和杀灭病原体。此外，其还提供了用于随后进行 的先天性和适应性免疫应答的具有较高的局部效应器和介质浓度的基质。此前进行的NET 成分的蛋白质组学研究鉴定出了三种主要的蛋白酶，分别将其称为中性粒细胞NE、CG和 PR3 (Urban,Ermert等，2009)。
[0008] 为了以无偏见的方式表征与NET相关的蛋白水解活性，使NET中诱捕的蛋白释 放并通过利用质谱测定其多重底物性质（MSP-MS)的方法对其进行测定（0'Donoghue等， 2012)。这种方法在使用串联的液相色谱-质谱的多重检测中利用具有124个高多样性肽 的文库对裂解位点进行检测。使用MSP-MS测定，通过将底物特异性性质与纯化的人中性粒 细胞蛋白酶进行比较阐明在复杂NETosis样品中各种酶的作用。此外，使用四肽荧光底物 文库研究NE、CG、PR3和NSP4非优势方的底物特异性。据申请人所知，本申请报道了在相同 条件下平行地比较NE、PR3、CG和NSP4的扩展的底物特异性的首次完整的研究。通过对来 自三个独立的健康供体的NET相关蛋白酶的分析显示，可以将其主要活性归功于NE。NE活 性的免疫耗竭显示了PR3和较低程度的CG贡献的活性，以及微弱的NSP4活性。对底物特 异性以及各种NET相关蛋白酶对总的NET相关活性贡献的鉴定能够导致在急性和慢性免疫 疾病中针对病理性NETosis的改进的治疗性干预的发展。
[0009] 附图简述
[0010] 下述附图构成了本申请说明书的一部分并且包括其以便进一步显示本发明的某 些方面。通过参考这些附图中的一个或多个以及结合本申请特定实施方式的详细描述可以 更好地理解本发明。
[0011] 图1描述了显示对中性粒细胞丝氨酸蛋白酶非优势方的特异性进行比较的图 (上面一行：组织蛋白酶G(100nM)、中间一行：蛋白酶3(50nM)、下面一行：弹性蛋白酶 (50nM))〇
[0012] 图2显示了对中性粒细胞丝氨酸蛋白酶扩展的底物特异性的比较。
[0013]图3显示了对同时监测弹性蛋白酶（ELA)、蛋白酶3(PR3)和组织蛋白酶G(CG)裂 解的荧光底物的鉴定并使用该底物确定供体中性粒细胞中的总蛋白酶。
[0014] 图4是对NET蛋白水解性质的比较和主要活性的免疫耗竭。
[0015] 图5显示了弹性蛋白酶的裂解位点以及组织蛋白酶G和蛋白酶3共享这些位点。
[0016] 图6显示了蛋白酶3的裂解位点以及弹性蛋白酶和组织蛋白酶G共享这些位点。
[0017] 图7显示了组织蛋白酶G的裂解位点以及弹性蛋白酶和蛋白酶3共享这些位点。
[0018] 图8显示了来自NETosis供体的蛋白酶裂解位点。
[0019] 图9显示了弹性蛋白酶、蛋白酶3、组织蛋白酶G、中性粒细胞分泌的蛋白4以及来 自NETosis供体的蛋白酶裂解物。
[0020] 发明概述
[0021] 本申请提供了用于NETosis相关疾病的蛋白生物标记物。在一些实施方式中，此 类生物标记物是蛋白酶，包括例如中性粒细胞弹性蛋白酶（NE)、组织蛋白酶G(CG)、蛋白酶 3(PR3)和中性粒细胞分泌的蛋白4(NSP4)。
[0022] 本申请还提供了用于中性粒细胞弹性蛋白酶（NE)、组织蛋白酶G(CG)、蛋白酶 3 (PR3)和中性粒细胞分泌的蛋白4 (NSP4)的识别和/或裂解的底物序列。
[0023] 在一些实施方式中，所述底物序列能够用于开发此类蛋白酶的探针或抑制剂。而 且，此类底物能够用于研发在多肽中的裂解位点，其中裂解在NETosis相关疾病中是所需 的。
[0024] 因此，本申请提供了一种用于鉴定具有NETosis相关的炎性状况的受试者的方 法，其中NETosis是中性粒细胞死亡形成的胞外诱捕网，所述方法包括：（a)从来自受试者 的样品获得与NET相关的蛋白酶含量信息；(b)将与NET相关的蛋白酶含量水平与来自健 康受试者的可比较的样品进行比较，和（c)当所述样品的NET相关蛋白酶含量高于来自健 康受试者的可比较的样品时，则鉴定所述受试者具有NETosis相关的炎性状况。
[0025] 所述样品可以是血液样品。所述蛋白酶可以选自：中性粒细胞弹性蛋白酶（NE)、 组织蛋白酶G(CG)、蛋白酶3(PR3)和中性粒细胞分泌的蛋白4(NSP4)。所述方法还可以包 括治疗NETosis相关的炎性状况，如感染、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、囊性纤维化、 深部静脉血栓、先兆子痫、牙周炎、阑尾炎、结核病和克罗恩氏病。治疗可以包括向所述受试 者施用蛋白酶抑制剂。所述蛋白酶抑制剂可以抑制包含如图4-9所示序列的肽底物的裂 解。治疗还可以包括向所述受试者施用留体或非留体抗炎药物，或抗生素。所述对象可以 是人或非人哺乳动物。
[0026] 所述方法还可以包括获得信息，其包括从所述受试者获得样品，如通过在所述样 品上进行蛋白酶含量评估。所述评估可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA)、质谱法、色谱法、 电泳、放射性免疫测定、流式细胞术、荧光活化细胞分选（FACS)或western印迹进行。所述 样品与可比较的样品之间蛋白酶含量的差异为+10 %、+20 %、+25 %、+30 %、+40 %、+50 %、 +75%或 +100%。
[0027] 相对于本申请所述的任意其他方法或组合物可以实施本申请所述的任意方法或 组合物是能够预期的。当结合下述说明书和附图考虑时将可以更好地体会和理解本发明的 这些和其他实施方式。然而，应理解下述说明书尽管显示了本发明的不同实施方式及其多 个特定的细节，但是给出其仅用于说明而非限制。在不脱离本发明精神的范围内可以进行 多种替代、修订、增加和/或重排，并且本发明包括所有的这些替代、修订、增加和/或重排。
[0028] 发明详述
[0029] 应理解本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、动物种属、构建体和试剂 并且其是可以改变的。还应理解本申请使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且 其并非旨在限制本发明的范围，其范围将仅由所附的权利要求限定。
[0030] 必须注意的是，如在本申请和所附的权利要求中所使用的，单数形式的"一个"、 "一种"和"所述"包括其复数形式，除非上下文另有明示。因此，例如提及"蛋白酶"时，指 一种或多种蛋白酶并且包括本领域技术人员公知的其等效形式等等。
[0031] 在本申请中使用的术语"约"指所提供的单位值的+/-10%。在本申请中使用的术 语"基本上"指显示出所关注特征或性质的总体或大致程度的定性条件。生物领域的普通 技术人员将理解生物和化学现象很少（如果有的话）达到或避免绝对结果，因为多种变量 影响生物和化学组分和材料的检测、生产和贮存，并且因为在检测、生产和贮存生物和化 学组分和材料中使用的仪器和设备存在固有误差。因此在本申请中使用术语基本上以捕捉 在