,Helsens 等，2009)。
[0048] 从健康供体中分离中性粒细胞
[0049] 在使用Ficoll(聚蔗糖）密度梯度离心除去单核细胞后，经由两步纯化方案利用 红细胞（RBC)沉降分离人中性粒细胞。简言之，将50ml新鲜的人全血收集在含肝素的收集 管中。将血液与HetaS印(STEMcell，Cat#07906)以（5 :1)的比例混合以沉淀RBC和血小板。 富含白细胞和单核细胞的上清液在Ficoll-PAQUEPLUS(GEHealthcare,Cat#17-1440-03) 上部分层。在Ficoll(聚蔗糖）密度梯度离心后，将中性粒细胞与上清液中的单核细胞分 离并形成细胞球团。通过使用RBC裂解缓冲液（MiltenyiBi〇tec，Cat#130-094-183)反复 进行细胞裂解进一步除去污染的RBC。经使用CD66b抗体（BDPharmamingen，Cat#555724) 的流式细胞术确证，通过这种方法能够分离得到5千万-1亿个中性粒细胞的纯度超过98% 的中性粒细胞。
[0050]NETosis的诱导和NET的制备
[0051] 将纯化的中性粒细胞洗涤五次以除去血浆蛋白，然后以在添加了谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中1. 7xl06个细胞/ml的密度接种于10mm培养板中。在37°C下在含5% 0)2的 培养箱中通过使用50nM佛波酯（PMA，SigmaP8139)刺激中性粒细胞在体外诱导NETosis。 在孵育3小时后，除去培养基并使用温培养基轻柔地洗板3次。根据从经PMA处理的NET 中达到最大蛋白释放所需的最佳时间选择该诱导时间。然后使用微球菌核酸酶（MNase) (20U/ml)(ThermoScientific,P88216)消化NET10-40 分钟以便使NET解离进入培养 基。随后将上清液离心以除去细胞和细胞碎片。将来自未经PMA处理的中性粒细胞和经 PMA处理但未经MNase消化的中性粒细胞的上清液制备成阴性对照。使用蛋白酶抑制剂 的混合物对各样品的一部分进行处理对用于蛋白质组分析的样品进行保护，而用于蛋白 酶活性筛选的剩余样品无需使用蛋白酶抑制剂进行处理。通过使用SytoxOrange(Life Technologies,SI1368)测定无细胞DNA对NETosis的进程进行监测。使用SpectraMaxM2 焚光计（MolecularDevices)在将滤光片设定为544nm(ex)/590nm(em)的条件下通过相对 荧光测定对DNA进行定量，使用已知浓度的DNA标准品的DNA标准曲线进行校正。还通过使 用EnzChek'l?弹性蛋白酶测定试剂盒（Invitrogen,Cat#12056)测定NE活性对NETosis进 行定量。最后，通过共聚焦免疫荧光显微镜对NETosis进行目测检查。将中性粒细胞（5x10s 个细胞/ml)接种在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上并使用或不使用50nMPMA处理。在诱导 NETosis后的不同时间点，使用4%的多聚甲醛固定细胞，然后使用含10%FBS和0.05% TritonX-100的磷酸盐缓冲液（PBS)对其进行穿透和封闭。对于组蛋白染色而言，使用小鼠 抗-人核心组蛋白抗体（Millipore，抗组蛋白克隆HI1-4，MAB3422)，随后使用四甲基罗 丹明异硫氰酸酯（TRITC)缀合的二抗（InvitrogenCat#T2762)孵育盖玻片。使用Hoechst 33342(AnaSpecInc,Cat#83218)对DNA进行复染。采集数据前使用ProlongGold封片剂 (InvitrogenCat#P36930)将盖玻片封于载玻片上。
[0052] 从NET上清液中耗竭弹性蛋白酶
[0053] 在37。下使用DNase(100U/ml)再次消化NET样品的MNase制备物10分钟以便 完全释放NET相关蛋白。然后将NET上清液与弹性蛋白酶抗体（Sigma，Cat#PAI-74132)包 被的PierceG/A磁珠（ThermoScientific,Cat#88802)在 4°C下混合 1 小时。孵育后，在 DYNAL-磁珠分离架（InvitrogenCat#123-2ID)上将上清液与小珠分离。使用EnzChek犮 弹性蛋白酶测定确证蛋白酶的耗竭情况。
[0054] 使用质谱进行NET蛋白鉴定
[0055] 根据此前的报道（0'Donoghue等，2012)使用通过质谱进行的肽测序在NET诱 导的样品中进行蛋白鉴定。使用下述组合根据上文的描述从三个供体中制备NET样品： +PMA/+MNase、+PMA/_MNase和 _PMA/+MNase处理。针对各供体对经 +PMA/+MNase处理的样 品单独进行测定，而将+PMA/_MNase和_PMA/+MNase对照样品制成来自三个供体的混合的 等量样品。在PBS中NET的蛋白浓度范围为25-40μg/ml，因此使用如下所示的略有改进的 在溶液中的胰酶消化方案。使用l〇〇mM的碳酸氢铵缓冲液将样品制成30μg/ml的标准浓 度（在总体积700μ1中含~20μg)，在其中加入固体尿素使其最终为4M。使用10mMDTT 在56°C下孵育10min将样品还原，然后使用12mM碘乙酰胺对其进行烷基化（45min，避光， 21°C)，然后再加入5mMDTT进行中和。通过再加入100mM碳酸氢铵将终体积调整至1. 4ml， 尿素浓度为2M。以胰酶：总蛋白为1:50的比例加入胰酶（测序级，Promega)在37°C下消 化过夜。然后使用甲酸将样品酸化至pH2-3,使用C180MIX柱（Varian)脱盐。在与上文所 述的LTQ-FT系统相同的分离和分析条件下进行操作，使用LTQ-Orbitrap(Thermo)质谱仪 进行两次技术重复的LC-MS/MS分析对各样品进行测定。
[0056] 针对含有62, 611条记录的智人UniProt数据库（下载日期2012年3月21日） 进行数据库检索。对于错误发现率评估而言，该数据库连接了完全随机的序列记录集合 (EliasandGygi2007)。针对母核和片段离子分别使用20ppm和0.8Da的质量容差检索数 据。将肽序列作为无未酶切位点的胰酶肽进行匹配，将脲基甲基化的半胱氨酸作为固定修 饰。可变修饰包括Met氧化、Gin的N-末端pyroGlu、Met丢失和N-末端乙酰化。Protein Prospector评分参数为：最低蛋白评分为22、最低肽评分为15,以及蛋白和肽匹配的最大 期望值分别为〇. 01和〇. 001、所得到的蛋白错误发现率为1. 1%。以独特的肽计数报告蛋 白鉴定结果，肽计数为蛋白丰度的近似值、序列覆盖百分率和针对蛋白鉴定概率的期望值 (Choi,Fermin等，2008) (Liu,Sadygov等，2004)。要求报告已鉴定的在三种检测条件之一 中（+PMA/+MNase、+PMA/_MNase和_PMA/+MNase)具有至少两个独特的肽的蛋白。
[0057]实施例2:通讨PS-SCL和MSP-MS测宙的中件粒细朐丝氨酸蛋白酶的底物件质
[0058] 到目前为止，已使用PS-SCL测定确定了超过80种内切蛋白酶的底物特异性（PMID 10869434)，而新开发的MSP-MS测定到目前为止已确定了 >30种蛋白酶，包括内切和外切作 用的蛋白酶（〇'Donoghue等，2012)。为了获得NE、CG、PR3和NSP4客观的和综合的底物性 质，发明人使用PS-SCL和MSP-MS在相同的缓冲条件下对各酶进行测定。PS-SCL文库使用 与四肽序列的羧基末端连接的7-氨基-4-氨甲酰基甲基香豆素（ACC)基团。该文库可以 用于确定非主要一侧（易断裂键的N-末端）的底物特异性并且其对于区分具有较高同源 性的蛋白酶是特别有益的（Ch〇e，Le〇netti等，2006)。在发明人使用PS-SCL方法的研究 中，NE和PR3在P1位点偏好缬氨酸和丙氨酸以及较低程度的偏好苏氨酸（图1)。NE在该 位点也能够容纳异亮氨酸，而PR3则不能。而相反的是，CG对于这些氨基酸具有较低的耐 受性并且在其PEN1位点偏好酪氨酸和苯丙氨酸，而NSP4强烈地偏好精氨酸。通过P2特异 性能够容易地区分NE和PR3,因为NE偏好脯氨酸和丙氨酸，而PR3对于天冬氨酸、谷氨酸和 天冬酰胺显示出偏向性。有趣的是，CG和NSP4在P2偏好苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和其他较 小的疏水性氨基酸，但是对于NSP4而言，该活性与P1位点对精氨酸的特异性具有较小的相 关性。在P3,NE和CG具有相似的特异性性质，而PR3对于较大的残基特别是色氨酸和酪氨 酸具有独特的偏好。最后在P4,NE、CG和NSP4具有宽泛的特异性，而PR3在该位点不耐受 苯丙氨酸或任意带电荷的氨基酸。
[0059]MSP-MS测定使用124个十四肽的混合物作为底物文库确定蛋白酶的特异性性质。 通过使用质谱进行的肽测序能够容易地对易裂解键氨基和羧基侧的裂解的肽进行鉴定。该 测定可以在不同的时间间隔淬灭以活的对蛋白酶裂解事件的定性评估。全部四种蛋白酶在 P1位置均具有显著富含的氨基酸（图2)，其氨基酸偏好与在PS-SCL方法中观察到的那些 具有较强的相关性，通过Pearson分析在-1. 0至1. 0的范围内评分>0. 4 (表1)。在此处， NE对异亮氨酸的偏好超过缬氨酸和苏氨酸，而PR3对丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和异亮氨酸具 有大致相等的偏好性。在P1CG偏好苯丙氨酸超过酪氨酸和赖氨酸但不偏好丙氨酸，而NSP4 严格地偏好精氨酸。在P1亚位点以外，各酶的特异性来源于不同的亚位点：NE在P3显著 偏好谷氨酰胺和亮氨酸和在P2'偏好色氨酸，PR3在P2偏好谷氨酸和天冬酰胺，以及CG在 P2偏好正亮氨酸。有趣的是，尽管PR3和NE在P4