-P1位点具有较强的相关性，其在这两种 方法之间是相当的，但是CG具有较弱的相关性（表1)，这可能是由于在PS-SCL方法中未 设计检测主要一侧的相关性导致（图2)。MSP-MS的结果与此前已发表的针对NE和CG在 P2'位点以及P1的特异性数据显示出较强的相关性（表1)，该特异性数据使用蛋白酶裂解 位点的蛋白质组鉴定（PICS)方法产生（Schilling2008,Perera2012)。
[0060] 表1来自MSP-MS与PS-SCL和PICS的底物特异性比较
[0061]
[0062] 无阴影的值表示相关性较弱或不相关，而灰色和黑色分别表示相关性较强和非常 强。
[0063]实施例3:具有富集的蛋白酶活件的NET的诱导
[0064] 为了评估在中性粒细胞PMA诱导的NETosis中的蛋白水解活性，发明人筛选了 一组内部淬灭的荧光肽并鉴定了一种易于被四种中性粒细胞丝氨酸蛋白酶中的三种裂 解的底物。这种底物K(mca)-PLGKQVEY-K(dnp)此前用于测定真菌分泌的谷氨酸蛋白酶 (O'Donoghue，2008)。使用这种探针，由来源于经PMA和MNase处理的中性粒细胞的NET释 放的蛋白水解活性比未经PMA处理的对照样品约高5倍，其比未经MNase处理的对照样品 高20至40倍（图3)。发明人还使用MSP-MS对相同样品进行了分析并观察到98个来源 于NET相关蛋白酶的裂解的肽键。与发明人使用荧光底物的研究所显示的结果一致，在仅 经过PMA和仅经过MNase处理的样品中存在活性蛋白酶，但是这些产生较低水平的裂解， 其仅占在经PMA和MNase处理的中性粒细胞中所观察到的裂解总键数的15-19%。总而言 之，这些研究表明能够将中性粒细胞诱导形成具有富集的蛋白水解活性的NET。
[0065]实施例4:NET相关蛋白的鉴宙
[0066] 为了鉴定在NET中包埋的全部蛋白，对来自与上文所述相同的NETosis诱导的中 性粒细胞的蛋白制备物进行蛋白质组分析以评估诱导的对比未诱导的NET的蛋白组分（表 2)。使用质谱，在所检测的三种条件下（+PMA/+MNase、+PMA/-MNase和_PMA/+MNase)鉴定得 到的50种NET相关蛋白。基于其功能和细胞位置可以将NET相关蛋白分成六类：核蛋白、 肌动蛋白相关蛋白、酶、微生物肽和信号传导。其中的21个蛋白此前已在NETosis诱导的中 性粒细胞中被鉴定，占丰度最高的蛋白中的大部分（Urban，Ermert等，2009)。仅有3个蛋 白在使用发明人优化程序进行的此前的研究中未被检测：蛋白酶3、α-肌动蛋白和过氧化 氢酶，但是或许可以将这些遗漏解释为发明人使用MNase处理而非Dnase处理以隐藏NET， 可能使得未发现这3个蛋白。在经PMA和MNase处理的中性粒细胞样品中发现了 29个此 前未被鉴定的蛋白。但是，这些蛋白中仅有11个蛋白在全部三个供体中重复鉴定。在新发 现的蛋白中，发明人发现了SH3结构域-结合谷氨酸-rch-样蛋白3 (SH3BGRL3) (Q5T123)， 其参与了炎症信号转导通路。在全部三个供体中均发现了NE和无活性的丝氨酸蛋白酶家 族成分天青杀素（azurocidin)，但仅在一个供体样品中观察到了CG。令人惊奇的是，尽管 发明人的酶促研究表明与对照样品相比在经PMA和MNase处理的中性粒细胞（NET)中富含 蛋白水解活性。但是当通过基于质谱的蛋白质组对相同样品进行分析时具有较少的或不富 含蛋白酶。在未经MNase处理的任何样品中均未发现NE，表明NE被有效地诱捕至完整的 NET上。
[0067] 表2通过LC-MS/MS对三个健康供体鉴定得到的NET相关蛋白
[0068]
[0069]实施例5:在NETh.蛋白酶的多重底物件质
[0070] 使用MSP-MS测定评估了NET相关蛋白酶的底物特异性。与PS-SCL测定相比使用MSP-MS测定对于确定含一种以上蛋白酶的生物样品的性质具有优势是肽底物能够直接与 特定蛋白酶连接。将各中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的这种底物特异性用于分析可能含有这些 酶的混合物的NET。通过MSP-MS发现，全部三个供体具有相似的底物性质。为了产生具有 代表性的"供体特征"，将在全部三个供体样品中均观察到的40个裂解物聚集成一个基序， 其非常类似于NE的特异性（图4)。该供体特征是三个主要酶特异性的聚集体，其分别来自 于由NE、CG和PR3产生的15、5和1个独特的裂解物（亦参见图4)。无法对其余19个裂 解物进行唯一归属，因为其被一种以上中性粒细胞丝氨酸蛋白酶水解。
[0071] 为了确证NE在NET中的主要蛋白水解活性，发明人选择通过免疫耗竭除去这种 酶，并测定混合物中剩余的蛋白酶。在这种情况下，发明人能够将测定中NE耗竭供体蛋白 的总量增加15倍，其在测定过程中产生的经鉴定的裂解位点的数量仅增加1. 7倍。在三个 供体之间共享的76个裂解位点主要是CG活性的贡献（36个独特的裂解物），并且此处显示 了与7个独特的裂解物成比例的更高的PR3活性。有趣的是，仅有一个裂解物可能是NSP4 活性的产物，并且此处有15个新的裂解物不是由这四个酶中的任何一个产生的。因此，NE 耗竭能够表明较低丰度的蛋白酶具有较高的活性。
[0072]实施例6:在NETh蛋白酶的底物
[0073] 图5显示了弹性蛋白酶的裂解位点并且其与组织蛋白酶G和蛋白酶3共享。图6 显示了蛋白酶3的裂解位点并且其与弹性蛋白酶和组织蛋白酶G共享。图7显示了组织蛋 白酶G的裂解位点并且其与弹性蛋白酶和蛋白酶3共享。图8显示了来自NETosis供体的 蛋白酶裂解位点。图9显示了弹性蛋白酶、蛋白酶3、组织蛋白酶G、中性粒细胞分泌的蛋白 4以及来自NETosis供体的蛋白酶裂解物。
[0074] 上述说明书中提及的所有出版物和专利均通过引用并入本申请。在不脱离本公开 的范围和精神的前提下，所述方法的不同修订和变体对本领域技术人员而言将是显而易见 的。尽管发明是结合特定的实施方式描述的，但是应理解其所主张的权利不应不当地限于 此类特定的实施方式。事实上，用于实施特定实施方式的上文所述模式的、对本领域技术人 员是显而易见的不同修订均旨在下述权利要求的范围内。本领域技术人员将意识到，或者 能够使用不超过常规实验确定本申请所述的特定实施方式的多种等效物。此类等效物均旨 在包括在下述权利要求中。
【主权项】
1. 一种用于鉴定具有NETosis相关的炎性状况的受试者的方法，其中NETosis是中性 粒细胞死亡形成的胞外诱捕网，所述方法包括： (a) 从来自受试者的样品获得与NET相关的蛋白酶含量信息； (b) 将与NET相关的蛋白酶含量水平与来自健康受试者的可比较的样品进行比较，和 (c) 当所述样品的与NET相关的蛋白酶含量高于来自健康受试者的可比较的样品时， 则鉴定所述受试者具有NETosis相关的炎性状况。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液样品。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶选自：中性粒细胞胞弹性蛋白酶（NE)、 组织蛋白酶G(CG)、蛋白酶3 (PR3)和中性粒细胞分泌的蛋白4 (NSP4)。4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，进一步包括治疗所述与NETosis相关的 炎性状况。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述炎性状况选自：感染、系统性红斑狼疮、类风 湿性关节炎、囊性纤维化、深部静脉血栓、先兆子痫、牙周炎、阑尾炎、结核病和克罗恩氏病。6. 根据权利要求4所述的方法，其中治疗包括向所述受试者施用蛋白酶抑制剂。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂抑制肽底物的裂解，所述肽底 物包含如图4-9所示的序列。8. 根据权利要求4所述的方法，其中治疗包括向所述受试者施用留体或非留体抗炎 药。9. 根据权利要求4所述的方法，其中治疗包括向所述对象施用抗生素。10. 根据权利要求1所述的方法，其中获得信息包括从所述受试者获得样品。11. 根据权利要求1所述的方法，其中获得信息包括在所述样品上进行蛋白酶含量评 估。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述蛋白酶含量评估通过酶联免疫吸附测定 (ELISA)、质谱法、色谱法、电泳、放射性免疫测定、流式细胞术、荧光活化细胞分选（FACS) 或western印迹石角定。13. 根据权利要求12所述的方法，其中在所述样品和可比较的样品之间蛋白酶含量的 差异为 +10%、+20%、+25%、+30%、+40%、+50%、+75%或 +100%。14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是非人哺乳动物。
【专利摘要】本申请提供了用于NETosis相关疾病的蛋白生物标记物，包括蛋白酶。本申请还提供了此类蛋白酶的底物序列及其用途。中性粒细胞是血浆中最高丰度的白细胞。其是针对病原体侵袭产生的应答首先募集至损伤部位的细胞，并且其是先天性免疫防御的第一道防线。传统上将中性粒细胞认为是炎性应答和急性免疫的效应细胞，其通过胞内吞噬作用发挥功能，并且使用裂解蛋白酶、活性氧(ROS)和杀微生物蛋白用于攻击感染剂。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105339780
【申请号】CN201480015786
【发明人】金夷, J.墨菲, T.赫米斯顿
【申请人】拜耳医药保健有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2906124A1, EP2997352A2, US20160011209, WO2014144572A2, WO2014144572A3