专利名称：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析医学技术领域，具体地涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒及制备方法。
背景技术：
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associatedlipocalin, NGAL),又称人脂质运载蛋白 2 (lipocalin2, Ln2)或卩遼铁蛋白(siderocalin),是人脂质运载蛋白家族中的成员。在生理状态下，中性粒细胞、 肾小管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮黏液细胞等分泌少量NGAL，而脑和周围神经、结肠、子宫和卵巢、胎盘、甲状腺等组织细胞中NGAL的表达呈阴性。健康志愿者NGAL的浓度范围大约为，尿液0. 7 9. 6ng/mL ;血浆34 106ng/mL。根据急性肾损伤(AKI)患者90%阳性预测值判断，尿液中NGAL的阳性判断值为350ng/ml,血衆检测的阳性判断值为400ng/ml。当发生急性肾损伤时，血、尿NGAL浓度通常会迅速升高，2h最为明显，尿液中NGAL浓度可以达到110ng/ml到40000ng/ml，血液中NGAL浓度可以达到25ng/ml到3500ng/ml，这使之成为早期且敏感的肾损伤生物标志物。急性肾损伤是比较严重的病症，可由多种因素引起，如心脏手术或肾移植手术，糖尿病以及败血病等。临床上，由于肾脏对缺血性损伤和肾毒性等方面的响应，以及AKI早期生物标记的缺乏而延误开始治疗的时机，导致发病后的死亡率大大增加。传统的诊断方法包括测定血清肌酸酐、血液尿素氮、肌酸酐清除率等。但这些方法只能在损伤后一天甚至几天内检测出。而此时，肾功能已退化。其中，血清肌酸酐的变化被广泛用来检测AKI，但现已明确，当血清肌酸酐变化时，50%的肾功能已经丧失。因此，对肾损伤的可靠的早期生物标记的鉴定，对于早期的疾病治疗是非常必要的。NGAL检测试剂盒的应用，可以使医生在损伤几小时内做出诊断结果并进行及时治疗。因此，对NGAL的检测对于肾损伤的临床诊断具有十分重要的意义。NGAL的检测最初采用western blotting法。2005年丹麦BioPorto公司首先推出ELISA商品试剂盒，可用于血清(浆)、尿液的NGAL检测。另夕卜，美国R&D Systems公司也研发出ELSIA试剂盒。美国博适公司研发的试剂盒采用双抗体夹心免疫荧光层析法，但其检测限要逊于ELISA方法，而ELISA方法受影响因素也较多，准确性较差。我国的武汉生之源生物科技有限公司提供的检测方法是使用免疫比浊法，其检测结果受血脂浓度影响较大。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种灵敏度高，检测时间短，特异性好，稳定可靠的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒。本发明的技术方案概述如下一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒，包括以下组份
①中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白简称NGAL ；②辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体； ③包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒；④白色不透明微孔板；⑤洗涤液；⑥化学发光底物A和B ;其中，所述包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备 ①取5. Oml磁颗粒质量含量为2. 5%的磁颗粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒；所述磁颗粒悬浮液中的液体是浓度为O. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液；②用O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒；③将O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液与步骤②获得的磁颗粒混合使总体积为 5. O 10. Oml ；④加入5. OmgNGAL单抗，于摇床上匀化5 10分钟；⑤加入5. O 10. Omg碳二亚胺，于摇床上勻化5 10小时；⑥用O. ImoI/LpH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；⑦加入Tris-EDTA缓冲液，调整总体积至5. 0ml，调pH为7. 5，2 4°C保存；所述辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体是用下述方法制备①取I. Omg NGAL单克隆抗体，加入O. 5 I. Oml浓度为O. 05mol/L, pH值为7. 5的磷酸盐缓冲液溶解，2 4°C保存；②取5. Omg的辣根过氧化物酶，加入0.5ml去离子水，溶解后取出O. 06 O. 12ml，加入O. Iml浓度为O. lmol/L的NaIO4溶液，室温下避光反应O. 5 I. 5小时;③将步骤①与②获得的液体混合，室温下避光反应4 6小时；④向步骤③获得的溶液中加入O. Iml浓度为5mg/ml的NaBH4溶液，室温下避光反应I 2小时；⑤用O. 02mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液透析12 24小时，再用HPLC进行二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积的甘油后于_20°C下冷冻保存。所述洗涤液是用下述方法制备取6. 05g三轻甲基氨基甲烧、8. 55g NaCl、0. 5ml Tween-20,加去离子水至1L,溶解后用HCl调pH至7. 5。所述化学发光底物A工作液是用下述方法制备①配制O. 05mol/L pH 值为 8. O 的 Tris-Hcl 缓冲液；②将3 4mmol鲁米诺加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C避光保存。所述化学发光底物B工作液是用下述方法制备①配制O. 05mol/L pH值为8. O的Tris Hcl缓冲液；②将O. 5 O. 7mmo1四苯砸纳、I. 42mmo1铁氛化钟、O. 38mmol肉桂酸、7. 56mmol过氧化氢加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C保存。
本发明的优点本发明试剂盒可以检测病人血清中NGAL的含量，对于早发肾脏疾病和损伤的检测具有重要的指导意义，与传统的ELISA方法相比，本发明灵敏度高，特异性好，又克服了免疫比浊法受血脂浓度影响较大的特点，具有稳定性，可靠性和准确度高，安全环保，操作简便等优点。
图INGAL试剂盒(实施例I)标准曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例I一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒，包括以下组份①中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白简称NGAL ；②辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体；③包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒；④白色不透明微孔板⑤洗涤液；⑥化学发光底物A和B ;其中，所述包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备①取5. Oml磁颗粒质量含量为2. 5%的磁颗粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒I次；所述磁颗粒悬浮液中的液体是浓度为O. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液；②用O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒I次；③将O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液与步骤②获得的磁颗粒混合使总体积为5. O ；④加入5. OmgNGAL单抗，于摇床上匀化5分钟；⑤加入5. Omg碳二亚胺,于摇床上勻化5小时；⑥用O. lmol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；⑦加入Tris-EDTA缓冲液，调整总体积至5. 0ml，调pH为7. 5，2 4°C保存；Tris-EDTA 缓冲液(Tris 的含量为 O. 05mol/L, EDTA 的含量为 O. 004mol/L, BSA 浓度 O. 2%, Proclin3001. OmL/L)所述辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体是用下述方法制备①取I. Omg NGAL单克隆抗体，加入O. 5ml浓度为O. 05mol/L, pH值为 · 5的磷酸盐缓冲液溶解，2 4°C保存；②取5. Omg的辣根过氧化物酶，加入O. 5ml去离子水，溶解后取出O. 06ml，加入O. Iml浓度为O. lmol/L的NaIO4溶液，室温下避光反应O. 5小时;③将步骤①与②获得的液体混合，室温下避光反应4小时；
④向步骤③获得的溶液中加入O. Iml浓度为5mg/ml的NaBH4溶液，室温下避光反应I小时；⑤用O. 02mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液透析18小时，再用HPLC进行二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积的甘油后于_20°C下冷冻保存。所述洗涤液是用下述方法制备取6. 05g三轻甲基氨基甲烧、8. 55g NaCl、0. 5ml Tween-20,加去离子水至1L,溶解后用HCl调pH至7. 5。所述化学发光底物A工作液是用下述方法制备
①配制O. 05mol/L pH 值为 8. O 的 Tris-Hcl 缓冲液；②将3mmol鲁米诺加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C避光保存。所述化学发光底物B工作液是用下述方法制备①配制O. 05mol/L pH值为8. O的Tris Hcl缓冲液；②将O. 5mmol四苯硼钠、I. 42mmol铁氰化钾、O. 38mmol肉桂酸、7. 56mmol过氧化氢加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C保存。实施例2—种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒，包括以下组份①中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白简称NGAL ；②辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体；③包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒；④白色不透明微孔板；⑤洗涤液；⑥化学发光底物A和B ;其中，所述包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备①取5. Oml磁颗粒质量含量为2. 5%的磁颗粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒I次；所述磁颗粒悬浮液中的液体是浓度为O. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液；②用O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒I次；③将O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液与步骤②获得的磁颗粒混合使总体积为8. O ；④加入5. OmgNGAL单抗，于摇床上匀化8分钟；⑤加入8. Omg碳二亚胺,于摇床上勻化8小时；⑥用O. lmol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；⑦加入Tris-EDTA缓冲液，调整总体积至5. 0ml，调pH为7. 5，2 4°C保存；所述辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体是用下述方法制备①取I. Omg NGAL单克隆抗体，加入O. 8ml浓度为O. 05mol/L, pH值为 · 5的磷酸盐缓冲液溶解，2 4°C保存；②取5. Omg的辣根过氧化物酶，加入O. 5ml去离子水，溶解后取出O. 09ml，加入O.Iml浓度为O. lmol/L的NaIO4溶液，室温下避光反应I小时；③将步骤①与②获得的液体混合，室温下避光反应5小时；④向步骤③获得的溶液中加入O. Iml浓度为5mg/ml的NaBH4溶液，室温下避光反应I. 5小时；⑤用O. 02mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液透析24小时，再用HPLC进行二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积的甘油后于_20°C下冷冻保存。所述洗涤液是用下述方法制备
取6. 05g三轻甲基氨基甲烧、8. 55g NaCl、0. 5ml Tween-20,加去离子水至1L,溶解后用HCl调pH至7. 5。
所述化学发光底物A工作液是用下述方法制备①配制O. 05mol/L pH 值为 8. O 的 Tris-Hcl 缓冲液；②将3. 5mmol鲁米诺加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C避光保存。所述化学发光底物B工作液是用下述方法制备①配制O. 05mol/L pH值为8. O的Tris Hcl缓冲液；②将O. 6mmol四苯硼钠、I. 42mmol铁氰化钾、O. 38mmol肉桂酸、7. 56mmol过氧化氢加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C保存。实施例3一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒，包括以下组份①中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白简称NGAL ；②辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体；③包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒；④白色不透明微孔板；⑤洗涤液；⑥化学发光底物A和B ;其中，所述包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备①取5. Oml磁颗粒质量含量为2. 5%的磁颗粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒I次；所述磁颗粒悬浮液中的液体是浓度为O. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液；②用O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒I次；③将O. 05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液与步骤②获得的磁颗粒混合使总体积为 10. Oml ；④加入5. Omg NGAL单克隆抗体，于摇床上匀化10分钟；⑤加入10. Omg碳二亚胺，于摇床上勻化10小时；⑥用O. lmol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；⑦加入Tris-EDTA缓冲液，调整总体积至5. 0ml，调pH为7. 5，2 4°C保存；所述辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体是用下述方法制备①取I. OmgNGAL单克隆抗体，加入I. Oml浓度为O. 05mol/L，pH值为I. 5的磷酸盐缓冲液溶解，2 4°C保存；②取5. Omg的辣根过氧化物酶，加入O. 5ml去离子水，溶解后取出O. 12ml，加入
O.Iml浓度为O. lmol/L的NaIO4溶液，室温下避光反应I. 5小时;③将步骤①与②获得的液体混合，室温下避光反应6小时；④向步骤③获得的溶液中加入O. Iml浓度为5mg/ml的NaBH4溶液，室温下避光反应2小时； ⑤用O. 02mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液透析12小时，再用HPLC进行二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积的甘油后于_20°C下冷冻保存。所述洗涤液是用下述方法制备取6. 05g三轻甲基氨基甲烧、8. 55g NaCl、0. 5ml Tween-20,加去离子水至1L,溶解后用HCl调pH至7. 5。所述化学发光底物A工作液是用下述方法制备①配制O. 05mol/L pH 值为 8. O 的 Tris-Hcl 缓冲液；②将4mmol鲁米诺加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C避光保存。所述化学发光底物B工作液是用下述方法制备①配制O. 05mol/L pH值为8. O的Tris Hcl缓冲液；②将O. 7mmol四苯硼钠、I. 42mmol铁氰化钾、O. 38mmol肉桂酸、7. 56mmol过氧化氢加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C保存。各实施例中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品的配制将O. 01mol/L的磷酸盐缓冲液与牛血清按体积比3:1的比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将NGAL抗原稀释成浓度为0、128g/ml、320g/ml、800g/ml、2000g/ml、5000ng/ml的标准品。实施例4一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒实验操作程序(以实施例I试剂盒为例)如下①将实验所需试剂及人血清样品放置室温，平衡30分钟以上才可进行实验操作；②取一块96孔微孔板进行编号，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品及人血清样品均做双孔重复；③取各个浓度的标准品和样品50 μ I分别加入相应编号的孔中；④将辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体用标记物缓冲液(磷酸盐缓冲液浓度为 O. 05mol/L、pH 值为 7. 4，BSA 浓度 O. 5%, NaCl 8. 5g/L, Proclin3001. OmL/L,Tween-200. 5mL/L)按1:4000稀释，再将其取50 μ I分别加入到各孔；⑤将包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒用磷酸盐缓冲液-BSA缓冲液(磷酸盐缓冲液浓度为 O. lmol/L、pH 值为 7.4，BSA 浓度为 0. 2%, Proclin3001. 0mL/L)按 1:200 稀释得磁颗粒悬浮液，每孔均各加入50 μ I磁颗粒悬浮液，充分混匀，室温振荡30分钟；⑥将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；⑦去除磁板，每孔均各加入250 μ I洗涤液；⑧振荡5秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
⑨重复一遍步骤⑦、⑧；⑩将化学发光底物A与B工作液等体积混合后，每孔各加入100 μ I混合液； 用化学发光仪测定每孔的相对发光值(RLU)，检测时间I秒/孔； 利用双对数数学模型，根据标准品浓度以及其对应的RLU建立标准曲线(见附图1)，根据标准曲线计算样品的浓度； 打印检测结果报告。实施例5本发明试剂盒的方法学鉴定 根据本领域中常规的制造及鉴定规程对实施例1-3中的三种试剂盒进行鉴定，经过大量的实验证明，本发明的试剂盒在NGAL浓度的测定中，检测的方法学指标如下①检测范围0 5000ng/ml ；②灵敏度最小检出限为O. 4ng/ml ；③精密度批内变异系数小于10%，批间变异系数小于15% ；④准确性回收率测定在90 110%之间；⑤特异性与血清肌酸酐的交叉反应率小于O. 4% ；⑥稳定性各试剂组分于37°C放置6天后，各组分仍稳定。实施例6使用本发明的试剂盒对人血清样本进行检测的实验数据按照实施例4的操作步骤，使用实施例I的试剂盒，对100例人血样进行测定，血样由21例手术后急性肾损伤样本,27例轻度肾损伤样本以及52例健康人样本组成，测定结果如下表所示表对100例血液样本的检测结果
权利要求
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒，其特征包括以下组份 ①中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白简称NGAL ； ②辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体； ③包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒； ④白色不透明微孔板； ⑤洗涤液； ⑥化学发光底物A和B; 其中，所述包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备 ①取5.Oml磁颗粒质量含量为2. 5%的磁颗粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒；所述磁颗粒悬浮液中的液体是浓度为O. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液； ②用O.05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒；③将O.05mol/L pH值为6. 5的磷酸盐缓冲液与步骤②获得的磁颗粒混合使总体积为5.O 10. Oml ； ④加入5.OmgNGAL单抗，于摇床上匀化5 10分钟； ⑤加入5.O 10. Omg碳二亚胺，于摇床上勻化5 10小时； ⑥用O.lmol/L pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次； ⑦加入Tris-EDTA缓冲液，调整总体积至5.0ml，调pH为7. 5，2 4°C保存。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征是所述辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体是用下述方法制备 ①取I.Omg NGAL单克隆抗体，加入O. 5 I. Oml浓度为O. 05mol/L, pH值为7. 5的磷酸盐缓冲液溶解，2 4°C保存；②取5.Omg的辣根过氧化物酶，加入O. 5ml去离子水，溶解后取出O. 06 O. 12ml，加入O.Iml浓度为O. lmol/L的NaIO4溶液，室温下避光反应O. 5 I. 5小时; ③将步骤①与②获得的液体混合，室温下避光反应4 6小时； ④向步骤③获得的溶液中加入O.Iml浓度为5mg/ml的NaBH4溶液，室温下避光反应I 2小时； ⑤用O.02mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液透析12 24小时，再用HPLC进行二次纯化，收集蛋白峰，加入等体积的甘油后于_20°C下冷冻保存。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征是所述洗涤液是用下述方法制备 取6.05g三羟甲基氨基甲烷、8. 55g NaCl、0. 5ml Tween-20，加去离子水至1L，溶解后用HCl 调 pH 至 7. 5。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征是所述化学发光底物A工作液是用下述方法制备 ①配制O.05mol/L pH值为8. O的Tris-Hcl缓冲液； ②将3 4mmol鲁米诺加入到IOOOml步骤①所述的缓冲液中，混匀，2 4°C避光保存。
5.如权利要求I所述的的试剂盒，其特征是所述化学发光底物B工作液是用下述方法制备①配制O.05mol/L pH值为8. O的Tris Hcl缓冲液； ②将O.5 O. 7mmo1四苯砸纳、I. 42mmo1铁氛化钟、O. 38mmol肉桂酸、7. 56mmol过氧化氢加入到IOOOml步骤①所述的缓冲 液中，混匀，2 4°C保存。
全文摘要
本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒，该试剂盒包括以下组份中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白简称NGAL；辣根过氧化物酶标记的NGAL单克隆抗体；包被有NGAL单克隆抗体的磁颗粒；白色不透明微孔板；洗涤液；化学发光底物A和B；本发明试剂盒可以检测病人血清中NGAL的含量，对于早发肾脏疾病和损伤的检测具有重要的指导意义，与传统的ELISA方法相比，本发明灵敏度高，特异性好，又克服了免疫比浊法受血脂浓度影响较大的特点，具有稳定性，可靠性和准确度高，安全环保，操作简便等优点。
文档编号G01N33/68GK102967714SQ20121053378
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者曹青, 潘学继, 王立凯, 单存海, 洪宇霞 申请人:天津市协和医药科技集团有限公司