细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞凋亡中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于药物祀点技术领域，主要设及调控人中性粒细胞生物学特性的新路径 和新祀点在临床上的应用。
【背景技术】
[0002] 中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞，是构成机体抵御外源病原体入侵的最前沿， 在机体天然免疫中扮演着重要的角色。中性粒细胞是血液循环中含量最丰富的一类白细 胞，与淋己细胞等其它白细胞不同，中性粒细胞具有很多独特的特性。首先，中性粒细胞寿 命短。在血液循环中的中性粒细胞的半衰期只有8-20小时，衰老的中性粒细胞能够组成型 的自发调亡，运种调亡受到细胞内外各种因素的调控，具有可塑性。其次，中性粒细胞具有 趋化性，能沿着趋化剂的浓度梯度由低向高迁移。再者，中性粒细胞具有强大的杀菌功能， 并且，中性粒细胞输注在30年前就已存在，并且被证明对感染的患者有效，但运是一把双 刃剑，即中性粒细胞在杀菌过程中也会因旁观者效应导致局部组织损伤和一些炎症迁延不 愈。因此，基于中性粒细胞上述特性，寻找和建立一种方法可靠、操作方便的技术路径来调 控中性粒细胞的一些特性，趋利避害，是当前天然免疫学的一个重要课题。
[0003] 谷脫甘肤化修饰与憐酸化，甲酯化，泛素化修饰相似，是一种蛋白翻译后修饰方 式。在肌动蛋白中主要发生在球型肌动蛋白374位的半脫氨酸残基上。肌动蛋白的谷脫甘 肤化对调节球型肌动蛋白聚合成纤维状肌动蛋白有重要意义。发生谷脫甘肤化修饰的球型 肌动蛋白将不能正常聚合为纤维状肌动蛋白。而肌动蛋白的聚合程度又进一步影响着细胞 的功能。因此肌动蛋白的谷脫甘肤化对细胞的功能的调节具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是在于公开了细胞外酸性环境对中性粒细胞肌动蛋白的谷 脫甘肤化水平的影响。
[0005] 本发明的另一个目的在于公开了细胞外酸性环境对中性粒细胞自发调亡及各项 功能的影响，为炎性疾病的治疗提供了新的思路和策略。
[0006] 本发明采用的技术方案为：
[0007] 本发明提供了细胞外酸性环境在降低中性粒细胞内肌动蛋白的谷脫甘肤化水平 中的应用。
[000引具体地，该应用中，细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，进而降低了细 胞内肌动蛋白的谷脫甘肤化水平。
[000引优选地，所述的细胞外酸性环境是指：控制细胞外环境的抑值为：6. 0《抑值 <7. 0。更优选地，抑值为6. 0-6. 5。
[0010] 具体地，本发明还提供了一种降低中性粒细胞肌动蛋白的谷脫甘肤化水平的方 法，该方法包括如下步骤：
[0011] 选用RPMI 1640培养基加10% (体积）胎牛血清，调节抑值为：6.0《抑值 <7. 0 (用盐酸或碳酸或乳酸进行调节），0. 22 y m滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行 体外培养4小时。
[0012] 更优选地，所述抑值为6. 0-6. 5。
[0013] 所述的中性粒细胞指的是：人外周血来源的中性粒细胞或小鼠骨髓来源的中性粒 细胞。
[0014] 本发明还提供了细胞外酸性环境在延迟中性粒细胞调亡中的应用。
[0015] 具体地，该应用中，细胞外酸性环境通过抑制细胞内活性氧的产生，降低了细胞内 球状肌动蛋白的谷脫甘肤化水平和促进纤维状肌动蛋白的形成，进而激活Akt信号通路， 引起细胞调亡的延迟。
[0016] 优选地，所述的细胞外酸性环境是指：控制细胞外环境的抑值为：6. 0《抑值 <7. 0。更优选地，抑值为6. 0-6. 5。
[0017] 具体地，本发明还提供了一种中性粒细胞体外保存方法，该方法包括如下步骤：选 用RPMI 1640培养基加10% (体积）胎牛血清，调节抑值为：6. 0《抑值<7. 0 (盐酸或碳 酸或乳酸进行调节），0. 22 y m滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养。
[0018] 更优选地，所述抑值为6. 0-6. 5。
[0019] 所述的中性粒细胞指的是：人外周血来源的中性粒细胞或小鼠骨髓来源的中性粒 细胞。
[0020] 本发明所具有的有益效果：
[0021] 本发明系统检测了细胞外酸性环境对中性粒细胞自发调亡及各项功能的影响，探 究了酸性环境影响中性粒细胞调亡和功能的分子机制，初步阐明了细胞外酸性环境通过抑 制细胞内活性氧的产生，降低了细胞内肌动蛋白的谷脫甘肤化水平，进而激活Akt信号通 路，引起细胞调亡的延迟和功能的改变。本发明掲示了微环境酸碱度在免疫调节中的重要 地位，所掲示的调控人中性粒细胞生物学特性的新路径和新祀点将为今后临床上设计新的 输血医学储存和中性粒细胞的输注方案、炎性相关疾病和肿瘤的治疗方案提供新的思路和 策略。
【附图说明】
[0022] 图 1 中
[0023] a图为细胞外酸性环境对人外周血中性粒细胞调亡情况的测定结果图；
[0024] b图为细胞外酸性环境对小鼠骨髓中性粒细胞调亡情况的测定结果图。
[00巧]图2中：
[0026] a图为巧光探针法检测不同培养条件下中性粒细胞活性氧的产生情况；
[0027] b图为不同培养条件下（P册.0或抑7. 4,添加激动剂或不添加）中性粒细胞活性 氧的产生情况。
[0028]图 3 中：
[002引 a图：不同浓度fMLP刺激下中性粒细胞的形态变化。
[0030] b图：中性粒细胞对fMLP刺激的敏感性。
[0031] 图4中性粒细胞迁移实验结果图。
[0032] 图5不同培养条件下中性粒细胞多伪足出现情况。
[0033] 图6为验证中性粒细胞的吞隧作用时上清液涂板结果。
[0034] 图7不同培养条件下细胞内纤维状肌动蛋白巧光强度。
[0035] 图8.不同培养条件下中性粒细胞谷脫甘肤化修饰情况。
[0036]图9中：
[0037] a图：中性粒细胞自发调亡过程中Akt憐酸化水平的变化趋势。
[0038] b图：不同抑细胞外培养基对中性粒细胞Akt憐酸化水平的影响。
[003引图10.拉库春林对中性粒细胞的影响。
[0040] 图11为酸性环境调节中性粒细胞调亡的信号通路模型图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
[0042] 本发明提供了 一种降低中性粒细胞肌动蛋白的谷脫甘肤化水平的方法，该方法包 括如下步骤：选用RPMI 1640培养基加10% (体积）胎牛血清，再用盐酸或碳酸或乳酸调 节抑值为：6. 0《抑值<7. 0 (如抑6. 0, P册.5)，0. 22 y m滤器滤菌，用该培养基对中性粒 细胞进行体外培养4小时。
[0043] 本发明还提供了一种中性粒细胞体外保存方法，该方法包括如下步骤：选用RPMI 1640培养基加10% (体积）胎牛血清，再用盐酸或碳酸或乳酸调节抑值为：6. 0《抑值 <7. 0 (如P册.0, P册.5)，0. 22 y m滤器滤菌，用该培养基对中性粒细胞进行体外培养。
[0044] 为了验证细胞外酸性环境在降低中性粒细胞内肌动蛋白的谷脫甘肤化水平中的 应用及细胞外酸性环境在延