专利名称：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本申请涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒，更具体而言，本申请涉一种用于检测人体液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)浓度的一种检测试剂及其制备方法，该试剂包括试剂R1、试剂R2以及工作校准品，试剂Rl为适合抗原抗体反应的缓冲溶液，R2为同时含有大小两种粒径的结合有抗人NGAL抗体的纳米微球的溶液，该试剂通过抗原抗体的特异性反应，使纳米微球发生凝聚，产生浊度的变化，对比校准曲线可以定量测定NGAL。
背景技术：
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin, NGAL)，也称为脂质运载蛋白_2 (Lipocalin-2)，是脂质运载蛋白家族的一个新成员，它是肾功能损伤早期的生物标志物。NGAL不仅仅存在于嗜中性粒细胞中，也会出现在特定的上皮细胞内，例如发生缺血性和毒性肾损伤的过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。临床手术后，50%以上的病人都会出现一定程度的急性肾功能衰竭，通常发病后期出现使得死亡率大大增加。急性肾衰竭的预后一直没有得到改善，在今后的四十年里将引起显著关注。通用的诊断方法如测定血清肌酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CystatinC)的方法都只能在肾功能退化后检测出，即只能在损伤后一天甚者几天内检测。而用NGAL检测试剂盒，医生可在损伤几小时内对急性肾功能障碍作出诊断并做适当的处理。研究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布在0. 7-9. 6ng/ml间，平均值为5. 3ng/ml，而血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml，平均值为63ng/ml。当肾损伤后，NGAL水平将迅速陡增。随机检测重病患者，尿液NGAL的浓度为llOng/ml到40000ng/ml不等，而他们的EDTA抗凝血浆检测结果为25ng/ml到3491ng/ml。当尿液中的NGAL含量超过350ng/ml，或者血浆中的NGAL含量达到400ng/ml以上时发生肾功能衰竭的阳性预测值为90%。目前NGAL的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting以及化学发光法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题；Western-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小。胶乳增强免疫透射比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，该方法对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。与其他测定方法比较，该方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围，较大的实用价值。NGAL浓度在正常人尿液中低于lOng/ml，在重度肾病患者尿液中浓度可高达7000ng/ml以上。如此宽广的浓度范围，对检测试剂盒灵敏度和线性范围均提出了较高的要
4求。目前市场上已有胶乳增强免疫透射比浊法测定人血浆或尿液中NGAL浓度的试剂盒，但这些试剂盒无法同时满足宽线性范围和高灵敏度的要求，因此需要稀释样本才能测定高浓度NGAL，这在使用上带来了不便。因此，有必要开发一种同时具有高灵敏度和宽线性范围的NGAL胶乳增强免疫透射比浊检测试剂盒。
发明内容
因此，本发明的技术目的在于开发一种同时具有高灵敏度和宽线性范围的NGAL胶乳增强免疫投射比浊检测试剂盒。因此，本发明的第一方面涉及一种NGAL检测试剂盒，包含试剂R1、试剂R2以及工作校准品，其中试剂Rl为NGAL与抗人NGAL抗体反应缓冲液；试剂R2为结合有抗人NGAL抗体的纳米微球溶液；工作校准品由缓冲液、稳定剂、防腐剂以及NGAL参考标准品组成，其特征在于，所述试剂R2中包含大小两种粒径的结合有抗人NGAL抗体的纳米微球，大粒径为150-500nm，小粒径为50_100nm，优选地，大粒径为200-300nm，小粒径为70_90nm。优选地，试剂Rl缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种，其浓度为10-500mM ；试剂R2所用的缓冲液为磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种，其浓度为10-500mM。优选地，所述的抗人NGAL抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，更优选地，所述的多克隆抗体为兔抗人NGAL抗体、羊抗人NGAL抗体或鸡抗人NGAL抗体的一种；单克隆抗体为鼠抗人NGAL抗体。优选地，试剂R2中的纳米微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类的一种或几种聚合而成的胶乳，更优选地，试剂R2中包含大小两种粒径的胶乳颗粒，大粒径直径为150-500nm ；胶乳小粒径直径为50_100nm。优选地，试剂R2中纳米微球质量百分数为0. 1_1%，其中大粒径质量百分数为0. 01-0. 1% ；小粒径质量百分数为0. 1-0. 8%。优选地，试剂R2中抗人NGAL抗体与纳米微球的结合方式为化学交联或物理吸附。优选地，所述的NGAL参考标准品包含五个不同浓度的NGAL，分别为150ng/ml，600ng/ml，1500ng/ml，3000ng/ml，5000ng/ml，或类似比例的五个不同浓度；其中缓冲液为HEPES缓冲液pH 7. 4，稳定剂为BSA、蔗糖、氯化钠、吐温20的一种或几种混合。最优选地，所述的NGAL蛋白检测试剂盒选自如下组合试剂盒1 试剂Rl的组成为pH 7. 3，主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%,兔IgGl%;R2的组成为
pH 7.0，主要成分为HEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0· 5%，工作校准品为缓冲基质，其由HEPES 50mM, NaCl 0. 15M, NaN3 0.1%, EDTAIOmM, BSA 0. 5%，蔗糖5%，其余为去离子水组成，溶于所述基质的5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品；试剂盒2 试剂Rl的组成为pH 7. 4，主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 25M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%,R2 的组成为pH 7. OHEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0· 5%，工作校准品为缓冲基质，其由HEPES 50mM, NaCl 0. 15M，NaN 30. 1 %, EDTAIOmM, BSA 0. 5%，吐温200. 1 %，其余为去离子水组成，溶于所述基质的5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品；试剂盒3 试剂Rl的组成为pH 7. 4，主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%,鼠 IgGl%，R2 的组成为ρΗ7·0HEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2 %，大粒径胶乳含量为0· 5%，工作校准品为缓冲基质，其由HEI5ES 50mM, NaCl 0. 15M, NaN3 0.1%, EDTAIOmM, BSA 0. 5%，蔗糖5%，其余为去离子水组成，溶于所述基质的5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品；本发明的第二方面涉及如上所述的NGAL检测试剂盒的制备方法，包含步骤将大粒径纳米微球和抗人NGAL抗体溶液混合在pH7. O缓冲液中，室温搅拌3小时，抗体与纳米微球结合充分后，离心去上清，加入缓冲液后超声分散均勻；将小粒径纳米微球和抗人NGAL抗体溶液混合在pH 7. 0缓冲液中，室温搅拌3小时，抗体与纳米微球结合充分后离心去上清，加入缓冲液后超声分散均勻；将大小颗粒溶液按一定的比例混合。换言之，本申请所要解决的问题是克服上述现有试剂盒存在的缺陷，提供一种大小颗粒复合的胶乳增强免疫比浊试剂盒，来检测血浆或尿液中NGAL的含量，以同时达到高灵敏度和宽线性范围的目的。为达到一种试剂盒同时具备高灵敏度和宽的线性范围的目的，本申请主要从免疫反应速率上入手，即在低NGAL浓度下，要有较高的免疫凝集速率，保证高灵敏度；同时在高NGAL浓度下，要有较低的免疫凝集速率，保证宽的线性范围。具体而言，本申请的发明构思是(1)大粒径胶乳表面包被抗体后，其与抗原亲和性较高，极大地提高了低浓度NGAL时抗原抗体反应速率，从而提高了试剂的灵敏度；(2)小粒径表面包被抗体后，其亲和性相对较低，在高抗原浓度下仍可形成抗原抗体复合物，从而提高了试剂的线性范围；(3)大小粒径混合在同一缓冲液体系后，同时达到了高灵敏度和宽线性范围目的。本申请的技术方案是一种NGAL检测试剂盒，其特征在于，包含试剂R1、试剂R2，所述的试剂Rl为适合NGAL与抗人NGAL抗体反应的缓冲液；所述的试剂R2为结合有抗人NGAL抗体的纳米微球，置于适当的缓冲液中。所述的Rl缓冲液为磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种。其浓度为10-500mM;试剂R2缓冲液为磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种。其浓度为10-500mM。所述的抗人NGAL抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。所述的多克隆抗体为兔抗人NGAL抗体、羊抗人NGAL抗体或鸡抗人NGAL抗体。所述的单克隆抗体为鼠抗人NGAL抗体。所述的试剂R2中的纳米微球是由聚苯乙烯胶乳、丙烯酸、丙烯酸相关酯类的一种或几种聚合而成的胶乳。所述的试剂R2中的胶乳包含大小两种粒径的胶乳。大颗粒直径为150-500nm ；胶乳小颗粒直径为50-100nm。所述的试剂R2中胶乳质量百分数为0. 1_1%，其中大颗粒质量百分数为0. 01-0. 1% ；胶乳小颗粒质量百分数为0. 1-0. 8%。所述的试剂R2中抗人NGAL抗体与胶乳颗粒结合方式为物理吸附或化学交联。本申请的主要优点是(1)大颗粒胶乳表面疏水性较高，包被抗体后，其与抗原亲和性较高，极大地提高了低浓度NGAL时抗原抗体反应速率，从而提高了试剂的灵敏度。(2)小颗粒表面包被抗体后，其亲和性相对较低，在高抗原浓度下仍可形成抗原抗体复合物，从而提高了试剂的线性范围；(3)大小颗粒混合在同一缓冲液体系后，由于大颗粒与NGAL与抗原结合力强，因此首先与抗原结合，这样在低NGAL浓度下，试剂也具有较高的灵敏度，当NGAL浓度较高时，抗原可与小颗粒结合形成免疫复合物，这样试剂具有宽的线性范围。现有技术虽然也有同时利用大小两种粒径的纳米微球来实现提高检测限和扩大检测的线性范围的报道，不过现有技术大小颗粒采用传统包被方式，对于抗体性能要求较高，有的需要两种抗体，有的需要一种高亲和性抗体，而本申请由于大小颗粒采用不同的包被抗体方式，对抗体没有特别要求，只需一种抗体就行。
图1 :NGAL试剂盒标准曲线。图2 本发明与酶联免疫分析法血浆测值相关性。图3 本发明与酶联免疫分析法尿液测值相关性。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。例如，本领域技术人员公知，可以使用不同物种来源的NGAL抗体，所述两种粒径的纳米微球的粒径范围也可以更宽，这样的变化也都落入本发明的保护范围之内。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如抗体和纳米微球如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例1 :NGAL检测试剂盒的制备本申请示例性地配制了三种NGAL检测试剂盒，其配制原料、配制步骤、性能如下(1)试剂盒 1 Rl :pH 7. 3,主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%,兔IgGl%，R2制备过程如下小粒径胶乳试剂制备1、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释兔抗人NGAL多克隆抗体(IOmg/ml)，至抗体终浓度为2mg/ml ；2、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释74nm胶乳溶液(10% wt)，使胶乳浓度为4% ；3、将稀释好的抗体和胶乳两者混勻，室温震荡30分钟后加入用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)配制5mg/ml的EDAC溶液10ml，室温反应3h，再加入5ml封闭液(1% BSA，吐温20溶液)，封闭浊；4、离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释胶乳至2. 5%，并加入0. 防
腐剂，超声分散后待用。
大粒径胶乳试剂制备1、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释兔抗人NGAL多克隆抗体(IOmg/ml)，至抗体终浓度为2mg/ml ；2、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释Iml 220nm胶乳溶液(10% wt)，使胶乳浓度为4% ；3、将稀释好的抗体和胶乳两者混勻，室温震荡30分钟后加入用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)配制5mg/ml的EDAC溶液10ml，室温反应3h，再加入5ml封闭液(含1 % BSA, 1 %吐温20溶液)，封闭2h ；4、离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释胶乳至2. 5%，并加入0. 防
腐剂，超声分散胶乳颗粒后待用。5、大、小颗粒试剂混合制备最终R2试剂将大小颗粒混合后，搅拌均勻，R2制备完毕R2 :pH 7. O,主要成分为HEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0. 5%。参考标准品缓冲液基质成分如下HEPES 50mM,NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0. 5%,蔗糖5%，其余为去离子水，按参考标准品所需要浓度将重组NGAL纯品加入上述缓冲液基质中，制得5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品，其余浓度的参考标准品(150ng/ml、600ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml)可由5000ng/ml标准品用缓冲液基质稀释得到。(2)试剂盒2
Rl :pH 7. 4，
主要成份为
甘氨酸50mM
NaCl 0. 25M
NaN3 0. 1 %
EDTA IOmM
BSA 0. 1 %
R2制备过程如下
小粒径胶乳试剂制备
1、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释5ml鸡抗人NGAL多克隆抗体CBmg/ml)，至抗体终浓度为2mg/ml ；2、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释74nm胶乳溶液(10% wt)，使胶乳浓度为4% ；3、将稀释好的抗体和胶乳两者混勻，室温震荡30分钟后加入用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)配制5mg/ml的EDAC溶液10ml，室温反应3h，再加入5ml封闭液(1% BSA，吐温20溶液)，封闭浊；4、离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)稀释胶乳至2. 5%，并加入0. 防腐剂，超声分散后待用。大粒径胶乳试剂制备1、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释細1鸡抗人NGAL多克隆抗体(5mg/ml)，至抗体终浓度为2mg/ml ；2、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释Iml 220nm胶乳溶液(10% wt)，使胶乳浓度为4% ；3、将稀释好的抗体和胶乳两者混勻，室温震荡30分钟后加入用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)配制5mg/ml的EDAC溶液10ml，室温反应3h，再加入5ml封闭液(含1 % BSA, 1 %吐温20溶液)，封闭2h ；4、离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释胶乳至2. 5%，并加入0. 防
腐剂，超声分散胶乳颗粒后待用。5、大、小颗粒试剂混合制备最终R2试剂将大小颗粒混合后，搅拌均勻，R2制备完毕。R2 :pH 7. 0,主要成分为HEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0. 5%。参考标准品缓冲液基质成分如下HEPES 50mM,NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0. 5%,吐温20 0.1%，其余为去离子水，按参考标准品所需要浓度将重组NGAL纯品加入上述缓冲液基质中，制得5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品，其余浓度的参考标准品(150ng/ml、600ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml)可由5000ng/ml标准品用缓冲液基质稀释得到。(3)试剂盒 3:
Rl :pH 7. 4,主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%, IgG 1%,R2制备过程如下小粒径胶乳试剂制备1、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释5ml鼠抗人NGAL多克隆抗体(5mg/ml)，至抗体终浓度为2mg/ml ；2、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释74nm胶乳溶液(10% wt)，使胶乳浓度为4% ；3、将稀释好的抗体和胶乳两者混勻，室温震荡30分钟后加入用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)配制5mg/ml的EDAC溶液10ml，室温反应3h，再加入5ml封闭液(1% BSA，吐温20溶液)，封闭浊；4、离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)稀释胶乳至2. 5%，并加入0. 防腐剂，超声分散后待用。大粒径胶乳试剂制备1、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释細1鼠抗人NGAL多克隆抗体(5mg/ml)，至抗体终浓度为2mg/ml ；2、用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)在室温下稀释Iml 220nm胶乳溶液(10% wt)，使胶乳浓度为4% ；3、将稀释好的抗体和胶乳两者混勻，室温震荡30分钟后加入用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)配制5mg/ml的EDAC溶液10ml，室温反应3h，再加入5ml封闭液(含1 % BSA, 1 %吐温20溶液)，封闭2h ；4、离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7. 0)稀释胶乳至2. 5%，并加入0. 防
腐剂，超声分散胶乳颗粒后待用。5、大、小粒径试剂混合制备最终R2试剂将大小颗粒混合后，搅拌均勻，R2制备完毕。R2 :pH 7. O,主要成分为HEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0. 5%。参考标准品缓冲液基质成分如下HEPES 50mM
11
NaCl 0. 15MNaN3 0. 1 %EDTA IOmMBSA 0.5%吐温20 0.1%蔗糖5%其余为去离子水按参考标准品所需要浓度将重组NGAL纯品加入上述缓冲液基质中，制得5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品，其余浓度的参考标准品(Ong/ml、150ng/ml、600ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml)可由5000ng/ml标准品用缓冲液基质稀释得到。实施例2 :NGAL检测试剂盒测定步骤，定标曲线的绘制，与市场上某知名品牌的产品进行对比研究，该厂家试剂检测原理也为胶乳增强免疫比浊法，主要组成Rl ,IOmmolTris,0. 1%NAN3,0. 5% BSA ；R2,0. 15%包被有抗人NGAL单克隆抗体的胶乳悬浊液，对比情况如下本申请的测定步骤如表1所示。表1 本申请试剂盒的测定步骤
权利要求
1.一种NGAL检测试剂盒，包含试剂R1、试剂R2以及工作校准品，其中试剂Rl为NGAL与抗人NGAL抗体反应缓冲液；试剂R2为结合有抗人NGAL抗体的纳米微球溶液；工作校准品由缓冲液、稳定剂、防腐剂以及NGAL参考标准品组成，其特征在于，所述试剂R2中包含大小两种粒径的结合有抗人NGAL抗体的纳米微球，大粒径为150-500nm，小粒径为50-100nm，优选地,大粒径为200-300nm，小粒径为70_90nm。
2.根据权利要求1所述的NGAL检测试剂盒，其特征在于，试剂Rl缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种，其浓度为10-500mM ；试剂R2所用的缓冲液为磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种，其浓度为10-500mM。
3.根据权利要求1或2所述的NGAL蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的抗人NGAL抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述的多克隆抗体为兔抗人NGAL抗体、羊抗人NGAL抗体或鸡抗人NGAL抗体的一种；单克隆抗体为鼠抗人NGAL抗体。
5.根据权利要求1至4任一项所述的NGAL检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中的纳米微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类的一种或几种聚合而成的胶乳。
6.根据权利要求5所述的NGAL检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中包含大小两种粒径的胶乳颗粒，大粒径直径为150-500nm ；胶乳小粒径直径为50-100nm。
7.根据权利要求1至6任一项所述的NGAL检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中纳米微球质量百分数为0.1-1%，其中大粒径质量百分数为0. 01-0. 1% ；小粒径质量百分数为0. 1-0. 8%。
8.根据权利要求1至7任一项所述的NGAL检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中抗人NGAL抗体与纳米微球的结合方式为化学交联或物理吸附。
9.根据权利要求1至8任一项所述的NGAL蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的NGAL参考标准品包含五个不同浓度的NGAL，分别为150ng/ml，600ng/ml，1500ng/ml，3000ng/ml，5000ng/ml，或类似比例的五个不同浓度；其中缓冲液为HEPES缓冲液pH 7. 4，稳定剂为BSA、蔗糖、氯化钠和吐温20的一种或几种混合。
10.根据权利要求1至9任一项所述的NGAL蛋白检测试剂盒，其特征在于其组成选自如下组合试剂盒1 试剂Rl的组成为pH 7. 3，主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%,兔 IgG 1% ；R2的组成为PH 7.0，主要成分为HEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0. 5%，工作校准品为缓冲基质，其由 HEPES 50mM, NaCl 0. 15M, NaN3 0.1%, EDTA IOmM, BSA·0. 5 %，蔗糖5%，其余为去离子水组成，溶于所述基质的5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品 ；试剂盒2 试剂Rl的组成为pH 7. 4，主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 25M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%,R2的组成为pH 7. OHEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0. 5%，工作校准品为缓冲基质，其由 HEPES 50mM, NaCl 0. 15M, NaN3 0. 1 %, EDTA IOmM, BSA·0. 5%，吐温200. 1%，其余为去离子水组成，溶于所述基质的5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品；试剂盒3 试剂Rl的组成为pH 7. 4，主要成份为甘氨酸50mM，NaCl 0. 15M,NaN3 0.1%,EDTA IOmM,BSA 0.1%,鼠 IgG 1%,R2的组成为pH 7. OHEPES 20mM,NaN3 0.1%,小粒径胶乳含量为2%，大粒径胶乳含量为0. 5%，工作校准品为缓冲基质，其由 HEPES 50mM, NaCl 0. 15M, NaN3 0.1%, EDTA IOmM, BSA·0. 5 %，蔗糖5%，其余为去离子水组成，溶于所述基质的5000ng/ml浓度的NGAL参考标准品。
11.根据权利要求1至9任一项所述的NGAL检测试剂盒的制备方法，包含步骤将大粒径纳米微球和抗人NGAL抗体溶液混合在pH7. O缓冲液中，室温搅拌3小时，抗体与纳米微球结合充分后，离心去上清，加入缓冲液后超声分散均勻；将小粒径纳米微球和抗人NGAL抗体溶液混合在PH 7. O缓冲液中，室温搅拌3小时，抗体与纳米微球结合充分后离心去上清，加入缓冲液后超声分散均勻；将大小颗粒溶液按一定的比例混合。
全文摘要
本申请涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，更具体而言，本申请涉及一种用于检测人体液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)浓度的检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2以及工作校准品，试剂R1为适合抗原抗体反应的缓冲溶液，试剂R2为同时含有大小两种粒径的结合有抗人NGAL抗体的纳米微球的溶液，该试剂通过抗原抗体的特异性反应，使纳米微球发生凝聚，产生浊度的变化，对比校准曲线可以定量测定NGAL。该试剂盒在测定低NGAL浓度时具有较高的灵敏度，同时在测定高NGAL浓度时具有较宽的线性范围，不会出现前带现象。本试剂盒理化性质稳定，使用便捷，在临床检验学上有着广泛的应用前景。
文档编号G01N33/68GK102590524SQ20111045499
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘希, 张小锐, 蔡华雅 申请人:北京九强生物技术股份有限公司