泪脂质运载蛋白的突变蛋白的制作方法

专利名称：泪脂质运载蛋白的突变蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自泪脂质运载蛋白或其同系物的新突变蛋白。本发明尤其涉及人泪脂质运载蛋白的突变蛋白。本发明也涉及编码此类突变蛋白的相应核酸分子及其产生方法。本发明还涉及产生此类突变蛋白的方法。最后，本发明涉及包含此脂质质运载蛋白突变蛋白的药物组合物以及突变蛋白的多种用途。
背景技术：
脂质运载蛋白蛋白质家族成员(Pervaiz，S.和Brew，K.(1987)FASEB J.1，209-214)一般为小的、分泌性蛋白质，其特征在于一系列不同的分子识别特性它们结合多种(主要是)疏水分子(如类视黄醇、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、信息素、促味剂和添味剂)的能力，它们结合特异细胞表面受体并形成大分子复合物。虽然过去将它们主要划分为转运蛋白，但是现在清楚了脂质运载蛋白完成多种生理功能。这些功能包括视黄醇转运、嗅觉、信息素信号传递和前列腺素合成。也表明脂质运载蛋白参与免疫应答的调节和介导细胞内环境稳定(homoeostasis)(例如Flower，D.R.(1996)Biochem.J.318，1-14和Flower，D.R.等人，(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482，9-24综述)。
脂质运载蛋白的全序列保守性具有不同寻常的低水平，经常具有低于20％的序列同一性。形成强烈对比的是，其整体折叠模式高度保守。脂质运载蛋白结构的中心部分由单个八股反平行β折叠组成，所述的β折叠自身闭合形成连续的氢键β桶。桶的一个末端通过穿过其底部的N端肽段以及连接β-链的三个肽环形成的立体封闭端肽片段与其底部相接。β桶的另一个末端暴露于溶剂并包括靶结合位点，其由四个肽环形成。其他刚性脂质运载蛋白支架中正是这种环的多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能容纳不同大小、形状和化学特征的靶(例如Flower，D.R.(1996)，上文；Flower，D.R.等人(2000)，上文或Skelra，A.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482，337-350中的综述)。
人泪前白蛋白(现称为泪脂质运载蛋白(TLPC))最初描述为人泪液的主要蛋白质(大约总蛋白质含量的三分之一)但是最近也在若干其他分泌组织中鉴定出来，这些组织包括前列腺、鼻粘膜和气管粘膜。已经在大鼠、猪、狗和马中发现了同源蛋白质。由于其对相对不溶脂质的高度复杂性和与该蛋白质家族其他成员不同的结合特征，泪脂质运载蛋白为不同寻常的脂质运载蛋白成员(在Redl，B.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482，241-248中综述)。不同化学类别的相当数量的亲脂化合物(如脂肪酸、脂肪醇、磷脂、糖脂和胆固醇)为此蛋白质的内源性配体。有趣的是，与其他脂质运载蛋白不同，配体(靶)的结合强度与烃(烷基酰胺和脂肪酸)尾部的长度相关。因此，泪脂质运载蛋白与最不溶的脂质结合最强(Glasgow，B.J.等人(1995)Curr.Eye.Res.14，363-372；Gasymov，O.K.等人(1999)Biochim.Biophys.Acta 1433，307-320)。
到目前为止还没有完全阐明人泪脂质运载蛋白的精确生物学功能并且它仍处于争论之中。在泪液中，将脂质从眼睛的黏性表面去除到液相中对于泪膜的完整性似乎是极重要的(综述于Gasymov，O.K.等人(1999)，上文)。然而，其在体外显示了其他活性，即半胱氨酸蛋白酶以及非特异性核酸内切酶活性的抑制作用，这在脂质运载蛋白中是不同寻常的(van′t Hof，W.等人(1997)J.Biol.Chem.272，1837-1841；Yusifov，T.N.等人(2000)Biochem.J.347，815-819)。最近表明，泪脂质运载蛋白能在体外结合若干脂质过氧化产物，由此产生了其作为潜在有害亲脂分子的氧化胁迫诱导清除剂的假说(Lechner，M.等人(2001)Biochem.J.356，129-135)。
通过非共价相互作用选择性结合其相应靶的蛋白质作为生物技术、医学、生物分析以及普通生物学和生命科学中的试剂发挥关键作用。抗体(即免疫球蛋白)为此类蛋白质的显著实例。尽管非常在配体/靶的识别、结合和/或分离方面对此类蛋白质有诸多需要，目前使用的几乎只是免疫球蛋白。其他具有确定配体结合特性的蛋白质(例如凝集素)的应用还限于特别案例。
就在最近，脂质运载蛋白家族成员成为涉及具有确定配体结合特性的蛋白质的研究对象。PCT出版物WO99/16873公开了所谓的Anticalins类型；即在四个肽环区域具有突变氨基酸的脂质运载蛋白家族多肽，所述的四个肽环排列在包括结合口袋的圆柱状β桶结构的末端，并且与包含大菜粉蝶(Pieris brassicae)后胆色素结合蛋白氨基酸位置28-45、58-69、86-99和114-129的线性多肽序列中的那些片段对应。PCT出版物WO 00/75308公开了后胆色素结合蛋白的突变蛋白，其特异结合洋地黄毒苷，而国际专利申请WO 03/029463和WO 03/029471分别涉及人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和载脂蛋白D。为进一步提高和优化脂质运载蛋白变体的配体亲和力、特异性以及折叠稳定性，已经提出多种使用脂质运载蛋白家族不同成员的方法(Skerra，A.(2001)Rev.Mol.Biotechnol.74，257-275；Schlehuber，S.和Skerra，A.(2002)Biophys.Chem.96，213-228)，如替换其他氨基酸残基。
然而对多种应用来说，每个分子具有多于一个的可用结合位点(要么是天然结合口袋加上改造的额外(蛋白质)结合位点要么是两个不同的改造结合位点)是有利的。例如，可以考虑使用脂质运载蛋白突变蛋白作为接头或连接子分子，其可通过结合位点I与给定结合配偶体连接，而结合位点II用于筛选/选择目的或者类似目的。实现这个目标的一种可能性是使用包含两种相同或不同结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的融合蛋白，其通过肽连接子互相偶联。此类融合蛋白(也称为“duocalins”)描述于例如WO 99/16873中以及Schlehuber，S.和Skerra，A.(2001)，Biol.Chem，382，1335-1342。
最近在具尾扇头蜱(Rhipicephalits appendiculatus)的唾液中鉴定了高亲和力的组胺结合蛋白(Paesen，G.C.等人(1999)Mol.Cell 3，661-671)。这些蛋白质在伤口位置螯合组胺，竞争掉配体的组胺受体以抑制流血过程中的炎症。这些组胺结合蛋白的晶体结构显示了新的脂质运载蛋白折叠，其含有两个具有不同结合亲和力的组胺结合位点。这些结合位点(其中一个为典型的脂质运载蛋白结合位点)垂直排列并高度刚性，形成不同寻常的专门互补组胺分子性质的极性内表面。称为SHBP的相关蛋白质(由啮齿动物蜱和牛蜱分泌)在两个不同结合位点结合组胺和5-羟色胺(Sangamnatdej，S.等人(2002)Insect Mol.Biol.11，79-86)。高亲和力结合位点与β桶结构的长轴垂直引起与其他脂质运载蛋白相比蛋白质结构的扭曲。因此，似乎不能在任何给定脂质运载蛋白中构造这样的结合位点。另一方面，因为结合位点深埋于β桶结构的核心，就配体大小而言似乎存在空间限制。
因此，还需要产生使用不同结合位点和/或另选的脂质运载蛋白支架的结合蛋白，这只是为了有更多的实际操作选择。

发明内容
因此，本发明的目的是提供与给定靶具有结合亲和力的备选脂质运载蛋白突变蛋白。
此目的通过具有独立的权利要求特征的脂质运载蛋白突变蛋白以及产生它的方法实现。
在一个实施方案中，此脂质运载蛋白突变蛋白为来自泪脂质运载蛋白多肽或其同系物的突变蛋白，其中突变蛋白在N端肽序列和排列在β桶结构末端(与天然脂质运载蛋白结合口袋相对)的三个肽环BC、DE和FG(参见图2)中任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，其中所述的泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的序列同源性，并且其中突变蛋白以可检测的亲和力与给定靶结合。
在更多的说明性术语中，此实施方案基于发明者发现可突变泪脂质运载蛋白内部配体结合位点闭合末端的三个环和/或泪脂质运载蛋白N端肽序列(参见

图1)中的氨基酸以获得以可测定的亲和力结合给定靶的脂质运载蛋白突变蛋白。因此，本发明提供具有抗体样结合特性的新结构类脂质运载蛋白突变蛋白。这是指这些突变蛋白可以相同方式使用以产生具有与上述所谓的Anticalins相同类型的预先确定特异性的新结合蛋白(脂质运载蛋白突变蛋白来自脂质运载蛋白家族蛋白质(如大菜粉蝶后胆色素结合蛋白)，其中位于配体结合位点开放末端的四个肽环中的氨基酸位置被突变)。由于这个原因，也考虑本发明的这些新脂质运载蛋白突变蛋白属于命名为Anticalins的脂质运载蛋白突变蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的突变蛋白也为来自泪脂质运载蛋白或其同系物的多肽的突变蛋白，其中突变蛋白在包括天然脂质运载蛋白结合口袋的四个肽环AB、CD、EF和GH(参见图2)中的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，其中所述泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的同源性，其中突变蛋白以可检测的亲和力结合给定靶。因此，此实施方案提供新类型的支架，其中可突变脂质运载蛋白配体结合位点开放末端四个肽环中的氨基酸以产生针对所需靶的结合分子。
还在另一个实施方案中，本发明涉及来自泪脂质运载蛋白或其同系物的多肽的突变蛋白其中突变蛋白在N端区域和三个肽环BC、DE和FG(排列在位于天然脂质运载蛋白结合口袋对面的β桶结构末端)中的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，其中突变蛋白在包括天然脂质运载蛋白结合口袋的四个肽环AB、CD、EF和GH中的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，其中所述泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的同源性，其中突变蛋白以可检测的亲和力结合至少一种给定靶。
因此，本发明还首次提供了单体脂质运载蛋白突变蛋白(Anticalins)，其由于存在两个结合位点可对两个给定配体具有结合特异性。这样的双特异性分子可认为是与双特异性抗体分子(如双特异抗体)在功能上等价。然而，与双特异性双抗体(或者一般而言的抗体片段)相比，这种新型双特异性脂质运载蛋白突变蛋白(Anticalins)具有这样的优势，其仅由一条多肽链组成，而双特异抗体包括非共价互相连接的两条多肽链。
这种新型结合蛋白的双特异性脂质运载蛋白突变蛋白可用作接头分子。例如当与两种不同受体具有结合亲和力时，此双特异性脂质运载蛋白分子可交联这些受体。此脂质运载蛋白突变蛋白(Anticalins)的实例为这样的突变蛋白，其中第一个结合位点结合调亡受体，如CD95(也就是Fas或Apo 1受体)并且第二个结合位点可结合在同一细胞表面表达的细胞表面受体。这样的双特异性突变蛋白以双细胞方式结合可造成CD95调亡受体和第二细胞表面受体靶抗原的相互交联，其可有效地诱导细胞的调亡(参见Jung，G.等人(2001)Cancer Res.61，1846-1848)。然而，这样的双特异性突变蛋白也可只具有一种给定靶的亲和力。此突变蛋白可用作缓慢释放到血流中的药物的分子贮藏。
本文所用的术语“诱变”指选择实验条件以使天然存在于所用脂质运载蛋白给定序列位置的氨基酸可由至少一个各自天然多肽序列中此特异位置不存在的氨基酸替换。术语“诱变”也包括通过插入或删除一个或多个氨基酸而(额外)修饰序列片段的长度。因此，例如所选序列位置的一个氨基酸由三随机突变的序列替换导致与野生型蛋白质(各自片段)长度相比插入两个氨基酸残基也在本发明的范围之内。可在本发明可进行诱变的肽片段的任何一个中互相独立的引入此种删除或插入。在本发明一个代表性的实施方案中，在所选脂质运载蛋白支架的环AB中引入若干突变的插入(分别参见实施例2和28)。术语“随机诱变”指在特定序列位置不存在预定单个氨基酸(突变)，但是在诱变过程中可以一定概率在所选序列位置掺入至少两个氨基酸。
这样的实验条件可例如通过将具有简并碱基的密码子掺入编码各个所用脂质运载蛋白的核苷酸中实现。例如，使用密码子NNK或NNS(其中N＝腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶；S＝腺嘌呤或胞嘧啶)能够在诱变过程中掺入全部20个氨基酸加上琥珀终止密码子，而密码子WS将可能掺入的氨基酸数量限制到12个，因为其排除了氨基酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val掺入多肽序列的所选位置；例如使用密码子NMS(其中M＝腺嘌呤或胞嘧啶)将所选序列位置的可能氨基酸的数量限制到11个，因为其排除了氨基酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val掺入多肽序列的所选位置。在这方面应注意20个天然存在的氨基酸之外的氨基酸(如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸)的密码子也可掺入突变蛋白的核酸。也可能如Wang，L.等人(2001)Science 292，498-500，或Wang，L.和Schultz，P.G.(2002)Chem.Comn.1.，1-11所述使用“人工”密码子(如通常作为终止密码子识别的UAG)以插入其他不常见氨基酸，例如邻甲基L酪氨酸或对氨基苯丙氨酸。
本文所用的术语“泪脂质运载蛋白”不限于人泪脂质运载蛋白(SWISS-PROT Data Bank Accession Number M90424)，但是旨在包括具有结构上相反的脂质运载蛋白折叠以及与人泪脂质运载蛋白氨基酸序列至少60％序列同源性或序列同一性的所有多肽。术语脂质运载蛋白折叠以常规意义使用(如Flower，D.R.(1996)，上文)，以描述典型三维脂质运载蛋白结构，其具有八股反平行链的圆柱状闭合的β片层构成的构象保守的β桶作为中心基序，其中在桶的开放末端，β链通过四个环以配对方式连接形成结合口袋(也见于图2)。
本发明所用的肽环的定义也与术语脂质运载蛋白折叠的常规意义一致并如下且也在图2中描述肽环(片段)AB连接圆柱状闭合β片层的β链A和B，肽环CD连接β链C和D，肽环EF连接β链E和F，肽环GH连接β链G和H，肽环BC连接β链B和C，环DE连接β链D和E，环FG连接β链F和G。如图2所见，环AB、CD、EF和GH形成已知的脂质运载蛋白结合位点(其由此称为开放末端)，而如本发明所示的，环BC、DE和FG可与N端肽序列一起使用以形成位于β桶闭合末端的另一个结合位点。
与上面的一致，术语“泪脂质运载蛋白”包括已鉴定的和还待分离的结构同系物，其来自具有氨基酸序列同源性或序列同一性高于大约60％的其他物种。本文所用的术语“同源性”为其通常意义并包括相同氨基酸以及认为是在两个互相比较的蛋白质线性氨基酸序列等价位置的保守替换氨基酸(例如天冬氨酸残基交换谷氨酸残基)。本发明所用的术语“序列同一性”或“同一性”指本发明多肽序列与有关序列同源性比对之后相对于这两个序列中较长一个的残基数量的配对相同残基的百分比。
序列同源性或序列同一性百分比在此使用软件BLASTP，blastp 2.2.5版(2002年11月16日；参见Altschul，S.F.等人(1997)Nucl.Acids Res.25，3389-3402)测定。同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比对(matrixBLOSUM 62；gap costs11.1；cutoff value set to 10-3)，在配对比较中使用人泪脂质运载蛋白作为参考。BLASTP程序输出的结果表示为以“阳性氨基酸”(同源氨基酸)除以程序所选用于比对的氨基酸总数而计算的百分比。在这方面应注意这个所选氨基酸的总数可如下所见与泪脂质运载蛋白的长度(包括前肽的176个氨基酸)不同。
同源蛋白的实例为用如上所解释的BLASTP程序测定具有大约70％序列同源性的褐家鼠(Rattus norvegicus)味腺蛋白质1(VEGP蛋白质；SWISS-PROT Data Bank Accession Numbers P20289)(125个阳性氨基酸/178个位置，包括前肽；当不把含13个“阳性氨基酸”的18个残基长的前肽计算在内时112个阳性氨基酸/160，也得到大约70％的同源性)、具有大约71％序列同源性的褐家鼠味腺蛋白质2(VEG蛋白质2；SWISS-PROT Data Bank Accession Numbers P41244)(127个阳性氨基酸/178，包括前肽；当不把18个残基长的前肽计算在内时114个阳性氨基酸/160，确定同源性也为大约71％)、具有大约74％序列同源性的Susscrofra(猪)味腺蛋白质2(LCN1；SWISS-PROT Data Bank AccessionNumbers P53715)(131个阳性氨基酸/176个位置，包括前肽；当不把含16个“阳性氨基酸”的18个残基长的前肽计算在内时115个阳性氨基酸/158，得到大约73％的同源性)或者具有大约70％序列同源性的狗主要变应原Can f1前体(ALL1，SWISS-PROT Data Bank Accession Numbers018873)(122个阳性氨基酸/174个位置，或者当排除带有12个阳性的前肽时110个阳性氨基酸/156＝大约70％的同源性)。泪脂质运载蛋白的此类结构同系物可来自任何物种，即来自原核生物以及来自真核生物。在真核生物的情况中，结构同系物可来自无脊椎动物以及脊椎动物，如哺乳动物(例如人、猴、狗、大鼠和小鼠)或者鸟类或爬行动物。
在本发明使用非泪脂质运载蛋白蛋白质的情况中，泪脂质运载蛋白突变序列位置的限定可在技术人员可以获得的公开序列比对或比对方法的帮助下指定给其他脂质运载蛋白。序列比对可例如如WO 99/16873(参见其中的图3)所释用公开的比对(如Redl，B.(2000)Biochim.Biophys.Acta1482，241-248中的图1)进行。如果可以获得脂质运载蛋白的三维结构也可用结构叠加确定在本发明中用于诱变的那些序列位置。其他结构分析方法(如多维核磁共振波谱学)也可用于此目的。
泪脂质运载蛋白的同系物也可为泪脂质运载蛋白自身的突变蛋白质，其中在本发明所选序列位置之外的位置引入氨基酸替换。例如，此突变蛋白可为这样的蛋白质，其中与泪脂质运载蛋白野生型序列相比突变β桶暴露于溶剂表面的位置以增加蛋白质的可溶性或稳定性。
通常，术语“泪脂质运载蛋白”包括与人泪脂质运载蛋白(SWISS-PROTData Bank Accession Number M90424)具有高于60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同源性或序列同一性的所有蛋白质。
在本发明一个优选的实施方案中，本文公开的突变蛋白来自人泪脂质运载蛋白。在其他优选的实施方案中，突变蛋白来自VEGP蛋白质、VEG蛋白质2、LCN 1或ALL 1蛋白质。
如果使用β桶闭合末端的结合位点，根据本发明的突变蛋白一般在人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置7-14、41-49、69-77和87-98对应的肽片段中的两个或多个序列位置包含突变。位置7-14为N端肽序列的一部分，位置41-49包含在BC环中，位置60-77包含在DE环中，位置87-98包含在FG环中。
在那些突变蛋白的更具体的实施方案中，在这样的序列位置引入突变，所述位置与人泪脂质运载蛋白的位置8、9、10、11、12、13、43、45、47、70、72、74、75、90、92、94和97对应。通常，此突变蛋白在5-10或12-16或全部17个序列位置中包含突变。
在诱变β桶开放末端的结合位点的情况下，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白在人泪脂质运载蛋白线性多肽的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110对应的肽片段中两个或两个以上序列位置包含突变。位置24-36包含在AB环中，位置53-66包含在CD环中，位置69-77包含在EF环中并且位置103-110包含在GH环中。在本发明的一个实施方案中，在与人泪脂质运载蛋白的序列位置24-36对应的序列位置形成的肽片段中插入1-6个氨基酸残基，优选插入2-4个氨基酸残基。此插入可包括在这个片段中任一位置。在一个典型的实施方案中，可在人泪脂质运载蛋白的序列位置24和25之间引入插入。然而应再次注意在肽片段(为在此使用的结合位点一部分)中引入至少两个氨基酸的序列不限于包含残基24-26的片段，但是可包括在参与形成一个或两个本文所选结合位点的任一片段中。
因此，具有两个结合位点的突变蛋白在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置7-14、41-49、69-77和87-97对应的肽片段中两个或两个以上序列位置包含突变并且在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110对应的肽片段中两个或两个以上序列位置包含其他突变。
在这方面应注意上面定义用于诱变的片段(环)的数量可以变化(N端肽序列包括在术语片段或环的意义中)。例如在协同诱变中，没有必要对两个结合位点中每一个的全部4个这样的片段进行突变。但是也可能只在每一结合位点的一个、两个或三个片段中引入突变以产生与给定靶具有可检测亲和力的突变蛋白。因此，如果想要结合分子只具有一个改造结合位点，那么可能例如只将β桶闭合末端的两个或三个片段进行诱变。如果然后想要这个分子对另一靶具有亲和力，可突变第二结合位点四个环的任何一个中的序列位置。然而，即使给定靶只由结合位点之一结合，也可以突变两个结合位点的肽环。
本发明的脂质运载蛋白可包含突变片段外的野生型(天然)氨基酸序列。另一方面，只要突变不干扰结合活性和突变蛋白的折叠，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白也可在进行诱变的序列位置外含有氨基酸突变。可使用已建立的标准方法(Sambrook，J.等人(1989)《Molecular CloningALaboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)在DNA水平上非常容易地完成此类突变。可能的氨基酸序列改变为氨基酸插入或删除以及替换。此类替换可为保守的，即氨基酸残基由化学相似的氨基酸残基替代。保守替换的实例为以下组成员的替代1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可能在氨基酸序列中引入非保守改变。
此类氨基酸序列修饰包括单氨基酸位置的定向诱变，以便通过掺入特定限制性内切酶的切割位点而简化突变脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，可掺入这些突变以进一步提高脂质运载蛋白突变蛋白与给定靶的亲和力(参见实施例17-19和24)。在一个实施方案中，在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置21、50、51和83对应的(脂质运载蛋白构架的)序列位置的至少一个中引入突变。此外，如果必要的话，可引入突变以调节突变蛋白的特定性质，从而提高折叠稳定性或水溶性或者降低聚集趋势。
本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能以可检测的亲和力(即以优选至少105M-1的结合常数)结合所需靶。较低亲和力通常不再能用常规方法(如ELISA)测量并因此次要。尤其优选以至少106M-1的亲和力(相应于1μM的复合物解离常数)结合所需靶的脂质运载蛋白突变蛋白。可通过许多方法(如荧光滴定、竞争性ELISA或表面等离振子共振)测量突变蛋白与所需靶的结合亲和力。
技术人员明白复合物形成依赖于许多因素，如结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、缓冲系统的离子强度等等。通常在允许分离与靶具有至少105M-1的亲和常数的脂质运载蛋白突变蛋白的条件下进行选择和富集。然而可在不同严谨性下进行洗涤和洗脱步骤。也可以针对动力学特征进行选择。例如，可在支持靶与突变蛋白形成复合物的条件下进行选择，所述突变蛋白表现出与靶缓慢的解离，或者换言之低koff速率。
本发明的泪脂质运载蛋白突变蛋白可用于与给定靶形成复合物。靶可为非天然靶/配体。靶(配体)可为游离或缀合形式的任何化合物，其表现免疫半抗原(如类固醇之类的激素或任何生物聚合体或其片段，例如蛋白质、蛋白质结构域、肽、寡脱氧核苷酸、核酸、寡糖或多糖或它们的缀合物)的特征。在本发明优选的实施方案中，靶为蛋白质。蛋白质可为任何球状可溶蛋白质或受体蛋白，例如参与细胞信号转导的跨膜蛋白质、免疫系统组分(如MHC分子)或指示特定疾病的细胞表面受体。突变蛋白也能只结合蛋白质片段。例如，如果此结构域也可作为可溶蛋白产生，那么当其为锚定在细胞膜的受体以及溶液中的相同结构域的一部分时，突变蛋白可结合细胞表面受体的结构域。然而，本发明绝不限于只结合此类大分子靶的突变蛋白。但是也可能通过诱变方法获得对低(较低)分子量配体(如生物素、萤光素或洋地黄毒苷)表现特异结合亲和力的泪脂质运载蛋白突变蛋白。
本发明的泪脂质运载蛋白突变蛋白一般作为单体蛋白质存在。然而，也可能发明的脂质运载蛋白突变蛋白能自发地二聚化或寡聚化。虽然由于例如简化的蛋白质操作，通常优选使用形成稳定单体的脂质运载蛋白突变蛋白，但是使用形成稳定同型二聚体或多聚体的脂质运载蛋白突变蛋白在此甚至更优选，因为此类多聚体可提供与给定靶的(进一步)增加的亲和力。此外，寡聚体形式的脂质运载蛋白突变蛋白可具有延长的血清半衰期。
对一些应用来说，使用本发明标记形式的突变蛋白是有用的。因此，本发明还指向与选自酶标记、放射性标记、有色标记、荧光素标记、生色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属复合物、金属和胶体金的缀合的脂质运载蛋白突变蛋白。突变蛋白也可与有机分子缀合。本文所用的术语“有机分子”优选地表示这样的有机分子，其包含至少两个碳原子，但是优选地不多于7个可旋转碳键，具有100-2000道尔顿的分子量，优选1000道尔顿，并任选地包括一个或两个金属原子。
一般而言，可以用任何适当的化学物质或酶标记脂质运载蛋白突变蛋白，其在化学、物理或酶促反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。物理反应的实例是经照射发射荧光或者当使用放射性标记时发射X射线。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β半乳糖苷酶催化形成显色反应产物的酶标记实例，其催化显色反应产物的形成。一般而言，所有通常用于抗体的标记(除了那些仅与免疫球蛋白Fc部分中的糖部分一起使用的)也可用于与本发明的突变蛋白缀合。本发明的突变蛋白也可与任何适当治疗活性剂缀合，以将此类活性剂靶向递送到给定细胞、组织或器官或者选择性作用于细胞(例如作用于肿瘤细胞而不影响周围正常细胞)。此类治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、小的有机分子和治疗肽(如充当细胞表面受体激动剂/拮抗剂的肽或竞争给定细胞靶上蛋白质结合位点的肽)。然而本发明的脂质运载蛋白突变蛋白也可于治疗活性核苷酸(如反义核酸分子、小干扰RNA、微小RNA或核酶)缀合。此类缀合可以通过本领域熟知的方法产生。
为了本文公开的突变蛋白的若干应用，可以有利地使用它们的融合蛋白形式。在优选的实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白在其N端或其C端与蛋白质、蛋白质结构域或肽(如信号序列和/或亲和标签)融合。
融合配偶体可赋予本发明脂质运载蛋白突变蛋白新的特性，如酶促活性或对其他分子的结合亲和力。适当融合蛋白的实例为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽S转移酶、G蛋白的白蛋白结合结构域、A蛋白、抗体片段、寡聚化结构域、相同或不同结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(其造成“duocalins”的形成，参见Schlehuber，S.和Skerra，A.(2001)，Biol.Chem.382，1335-1342)或者毒素。特别地，可以使本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与单独的酶活性位点融合以使得到的融合蛋白的两个“组分”一起作用于给定治疗靶。脂质运载蛋白突变蛋白的结合结构域与致病靶结合，使酶结构域能消除靶的生物学功能。如果本发明的两种双特异性脂质运载蛋白突变蛋白(即它们各自具有两个结合位点)组合成“duocalin”，就形成了四价分子。如果例如duocalin只从一种具有两个特异结合生物素结合位点的突变蛋白产生，就可获得与链霉抗生物素(为同型四聚体，其中每一个单体结合一个生物素分子)相当的四价分子(同型二聚体)。由于预期的亲和作用，此类突变蛋白可为利用生物素基团检测的方法中有用的分析工具。自发形成同型二聚体或多聚体的脂质运载蛋白突变蛋白当然也可用于这样的目的。
亲和标签(如Strep-tag或Strep-tagII(Schmidt，T.G.M.等人(1996)J.Mol.Biol.255，753-766)、myc标签、FLAG标签、His6标签或HA标签)或者也允许容易地检测和/或纯化重组蛋白质的蛋白质(如谷胱甘肽S转移酶)为优选的融合配偶体的其他实例。最后，具有生色或荧光特性的蛋白质(如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP))同样为本发明脂质运载蛋白突变蛋白的适当融合配偶体。
本文所用的术语“融合蛋白”也包括根据本发明的含有信号序列的脂质运载蛋白突变蛋白。多肽的N端信号序列指导此多肽到特定细胞区室，例如大肠杆菌(E.coli)的周质或真核细胞的内质网。本领域已知大量的信号序列。将多肽分泌到大肠杆菌周质中的优选信号序列为OmpA信号序列。
本发明也涉及核酸分子(DNA和RNA)，其包括编码本文所述突变蛋白的核苷酸序列。既然遗传密码的简并性允许用指定相同氨基酸的其他密码子替换特定密码子，本发明不限于编码本发明融合蛋白的特定核酸分子，但是包括包含编码功能融合蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。
在本发明核酸分子一个优选的实施方案中，其序列来自人泪脂质运载蛋白的编码序列。在其他优选的实施方案中，核酸来自VEGP蛋白质、VEG蛋白质2、LCN 1或ALL 1蛋白质。
在另一优选的实施方案中，编码根据本发明的突变蛋白的核酸序列在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置7-14、43-49、70-77和87-97对应的肽片段中两个或更多个序列位置包含突变，其中优选与人泪脂质运载蛋白的位置8、9、10、11、12、13、43、45、47、70、72、74、75、90、92、94和97对应的序列位置。
在另一优选的实施方案中，编码根据本发明突变蛋白的核酸序列在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110对应的肽片段中两个或更多个序列位置包含突变。
同样优选的是这样的核酸分子，其在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置7-14、43-49、70-77和87-97对应的肽片段中两个或更多个序列位置包含突变并且在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110对应的肽片段中两个或更多个序列位置包含额外突变。
如本文所公开的本发明也包括编码TLPC突变蛋白的核酸分子，其在实验诱变的片段外包含其他突变。此类突变经常是可容忍的并甚至可证明是有利的，例如如果其有助于突变蛋白提高的折叠效率、蛋白质稳定性或配体亲和力。
此应用公开的核酸分子可与调节序列“有效地连接”以允许此核酸分子的表达。
核酸分子(如DNA)指如果其包含含有转录和/或翻译调节相关信息的序列元件，并且这样的序列与编码多肽的核苷酸序列“有效连接”，其“能表达核酸分子”或能“允许核苷酸序列表达”。有效连接是这样的连接，其中调节序列元件和待表达的序列以使基因能够表达的方式连接。基因表达必需的调节区域的精确本质可在物种中变化，但是这些区域通常包含启动子，其中在原核生物中含有的启动子本身(即指导转录起始的DNA元件)以及当转录成RNA后发出翻译起始信号的DNA元件。这样的启动子区域一般包含参与转录和翻译起始的5，非编码区序列，如原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列盒5’加帽元件。这些区域也可包含增强子或阻抑元件以及翻译信号和将自身多肽靶向宿主细胞特定区室的前导序列。
此外，3’非编码序列可含有参与转录终止、多腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定宿主细胞中不具有满意的功能，那么它们可用在该细胞中有功能的信号替换。
因此，本发明的核酸分子可包括调节序列，优选地包括启动子序列。在另一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子包含启动子序列和转录终止序列。适当的原核启动子为例如tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。用于在真核细胞中表达的启动子的实例为SV40启动子或CMV启动子。
本发明的核酸分子也可包含在载体中或任何其他克隆工具中，如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体。在优选的实施方案中，核酸分子包含在质粒中。质粒载体表示编码temperent噬菌体(如M13或fl)基因间区域或其与目的cDNA融合的其功能部分的载体。用这样的噬菌粒载体和适当辅助噬菌体(例如M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞之后产生完整的噬菌体颗粒，从而使异源编码cDNA与展示于噬菌体表面的其相应多肽能物理偶联(例如在Kay，B.K.等人(1996)《Phage Display of Peptides and Proteins-A Laboratory Manual》，第1版Academic Press，New York NY；Lowman，H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26，401-424或Rodi，D.J.和Makowski，L.(1999)Curr.Opin.Biotechol.10，87-93)。
此类克隆工具可包含(除上述调节序列和编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的核酸外)来自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列以及赋予转化或转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知大量适当的克隆载体并可商业购买。
可将编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的DNA分子并且尤其是可将含有这样的脂质运载蛋白突变蛋白编码序列的克隆载体转化到能表达此基因的宿主细胞中。可用标准技术进行转化(Sambrook，J.等人(1989)，上文)。因此，本发明也涉及含有本文公开的核酸分子的宿主细胞。
在适于表达编码本发明融合蛋白的核苷酸序列的条件下培养转化的宿主细胞。适当的宿主细胞可为原核的(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))或真核的(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞、永生的哺乳动物细胞系(例如HeLa细胞或CHO细胞)或者初级哺乳动物细胞)。
本发明也涉及产生根据本发明的突变蛋白或其融合蛋白的方法，其包括(a)在两个或更多个不同密码子处诱变编码泪脂质运载蛋白或其同系物的核酸分子以得到一个或多个突变蛋白的核酸分子，其中所述的泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的序列同源性；(b)在适当表达系统中表达一个或多个(a)中获得的突变蛋白核酸分子，并且(c)通过选择和/或分离富集至少一种与给定靶具有可检测的亲和力的突变蛋白。
在此方法的其他实施方案中，可在一个或多个不同密码子(即通常的三联体密码子)处将核酸分子单独进行诱变，所述密码子位于任何一个、两个、三个或全部四个上面提到的排列在β桶结构任一端的肽片段中。因此，如果这个交换造成编码氨基酸的改变，那么只交换密码子中的一个碱基就足够了。
在突变蛋白或其融合蛋白的产生方法中，突变蛋白或其融合蛋白的获得开始于编码泪脂质运载蛋白或其同系物的核酸，所述核酸经诱变并通过重组DNA技术(如已在上文描述的)引入适当的细菌或真核缩主生物。
编码序列(例如人泪脂质运载蛋白的编码序列)(Redl，B.等人(1992)J.Biol.Chem.267，20282-20287)可作为本发明所选肽片段的诱变起点。为诱变N端肽序列和β桶结构(位于天然脂质运载蛋白结合口袋的对面)末端的三个肽环BC、DE和FG中以及包括所述结合口袋的四个肽环AB、CD、EF和GH中的氨基酸，本领域的技术人员可自主选择多种已建立的标准方法进行定点诱变(Sambrook，J.等人(1989)，上文)。通常使用的技术是用合成的寡核苷酸混合物通过PCR(聚合酶链式反应)引入突变，所述寡核苷酸在所需序列位置带有简并碱基组成。使用带有降低的碱基对特异性的核苷酸构件(building block)(例如次黄嘌呤核苷)是在所选序列片段中引入突变的另一种选择。另一种可能性是所谓的三联体诱变。此方法使用不同核苷酸三联体的混合物，其每一个编码一个掺入编码序列中的氨基酸。
在各个多肽的所选区域中引入突变的一种可能策略基于使用四种寡核苷酸，其每一个部分地来自待突变的相应序列片段之一(参见图3)。当合成这些寡核苷酸时，本领域的技术人员可使用核酸构件的混合物合成与待突变氨基酸位置对应的核苷酸三联体，以使编码所有天然氨基酸的密码子随机出现，其至少造成脂质运载蛋白肽文库的产生。例如，第一个寡核苷酸在其序列中(除突变位置外)与脂质运载蛋白多肽最N端位置的待突变肽片段编码链对应。因此，第二个寡核苷酸与多肽序列后面第二个序列片段的非编码链对应。第三个寡核苷酸依次与相应第三序列片段的编码链对应。最后，第四个寡核苷酸与第四个序列片段的非编码链对应。可用各自的第一个和第二个寡核苷酸且如果必需的话单独用各自的第三个和第四个寡核苷酸进行聚合酶链式反应。
这两个反应的扩增产物可通过多种已知方法组合到包含第一个到第四个序列片段的序列的单个核酸中，其中已在所选位置引入突变。为止，两个产物都可例如用侧翼寡核苷酸以及提供第二个和第三个序列片段之间序列的一个或多个媒介核酸分子进行新的聚合酶链式反应。这个过程以图示再现于图3中，在用于诱变的寡核苷酸序列中的数量和排列的选择中，本领域技术人员可自主进行很多选择。
可通过连接反应将上面定义的核酸分子与编码脂质运载蛋白多肽的核酸的缺失5’和3’序列和/或载体连接，并可克隆到已知宿主生物中。许多已建立的方法可用于连接反应和克隆(Sambrook，J.等人(1989)，上文)。例如，同样存在于克隆载体序列中的限制性内切酶识别序列可设计进入合成的寡核苷酸序列。因此，扩增各个PCR产物并酶切割之后，使用相应的识别序列可容易地克隆得到的片段。
编码选择来进行诱变的蛋白质的基因中更长的序列片段也可通过已知方法进行随机诱变，例如在增加错误率条件下通过使用聚合酶链式反应诱变、化学诱变或通过使用细菌增变株诱变。此类方法也可用于脂质运载蛋白突变蛋白的靶亲和力或特异性的进一步优化。可能在实验诱变的片段外出现的突变经常是可以容忍的并甚至可证明是有利的，例如如果它们有助于提高的脂质运载蛋白突变蛋白的折叠效率或折叠稳定性。
表达在适当宿主中进行诱变的核酸序列之后，可从得到的文库中选择携带各脂质运载蛋白突变蛋白多数的遗传信息的克隆，所述突变蛋白结合给定靶。可使用熟知的技术选择这些克隆，如噬菌体展示(在Kay，B.K.等人(1996)上文；Lowman，H.B.(1997)上文或Rodi，D.J.和Makowski，L.(1999)上文中综述)、菌落筛选(在Pini，A.等人(2002)Comb.Chem.HighThroughput Screen.5，503-510中综述)、核蛋白体展示(在Amstutz，P.等人(2001)Curr.Opini.Biotechnol.12，400-405)或如在Wilson，D.S.等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，3750-3755中报道的mRNA展示。
使用temperent M13噬菌体的噬菌体展示技术(在Kay，B.K.等人(1996)，上文；Lowman，H.B.(1997)上文或Rodi，D.J.和Makowski，L.(1999)，上文中综述)的实施方案作为根据本发明的选择方法的实施例给出。然而应注意也可使用其他temperent噬菌体(如fl)或裂解性噬菌体(如T7)。为进行典型的选择方法，制备M13噬菌粒(也参见上文)，其允许突变的脂质运载蛋白核酸序列作为带有N端信号序列(优选地为OmpA信号序列)并带有噬菌体M13衣壳蛋白pIII的融合蛋白或者其能在C端整合入噬菌体衣壳的片段表达。优选使用噬菌体衣壳蛋白的C端片段ΔpIII(包含野生型氨基酸序列的氨基酸217-406)产生此融合蛋白。尤其优选的是pIII的C端片段，其中位置201处的半胱氨酸残基缺失或者由另一个氨基酸替代。
融合蛋白可包含其他元件(如亲和标签)，其允许固定和/或纯化融合蛋白或其部分。此外，终止密码子可位于编码脂质运载蛋白或其突变蛋白的序列区域和噬菌体衣壳基因或其片段之间，其中终止密码子(优选为琥珀终止密码子)在适当的抑制菌株的翻译中至少部分地翻译成氨基酸。
例如，噬菌粒载体pTLPC7(图4)可用于构建编码人泪脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌体文库。用BstXI限制酶切位点在载体中插入编码突变肽片段的本发明核酸分子。然后将重组载体转化到适当宿主菌株中(如大肠杆菌XL1-Blue)。随后用适当的M13辅助噬菌体在液体培养物中超感染得到的文库，以产生功能噬菌体。重组噬菌粒在其表面以与外壳蛋白pIII或其片段的融合物展示脂质运载蛋白突变蛋白，而一般切除融合蛋白的N端信号序列。在另一方面，也产生一个或更多个拷贝的辅助噬菌体提供的衣壳蛋白pIII并从而能感染受体(通常为携带F或F’质粒的细菌菌株)。感染过程中或感染之后可诱导融合蛋白(由脂质运载蛋白突变蛋白和衣壳蛋白组成)的基因表达，例如通过加入无水四环素诱导。选择诱导条件以使得到的噬菌体的大部分在其表面展示至少一种脂质运载蛋白突变蛋白。已知多种分离噬菌体的方法，如用聚乙二醇沉淀。分离一般在孵育6-8小时之后进行。
然后通过将分离的噬菌体与给定靶孵育进行选择，其中靶以至少允许暂时固定展示具有所需结合活性的突变蛋白的噬菌体的形式存在。本领域已知若干固定方法。例如，靶可与载体蛋白(如血清白蛋白)缀合并通过此载体结合于蛋白质结合表面(如聚苯乙烯)。优选的是适于ELISA技术的微量滴定板或所谓的“immunosticks”。备选地，靶的缀合物也可使用其他结合基团(如生物素)。然后可将靶固定在选择性地结合此基团的表面上，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素包被的微量滴定板或顺磁颗粒。
例如，通过与固定在表面上的各自的靶结合捕获噬菌体颗粒。随后通过反复洗涤去除未结合的噬菌体颗粒。可在样品中加入作为竞争剂的游离靶(配体)分子洗脱结合的噬菌体。备选地，也可通过加入蛋白酶或者在适度变性条件下(例如在酸、碱、去污剂或离液盐的存在下)完成洗脱。优选的方法是用pH 2.2的缓冲液洗脱，然后中和此溶液。洗脱的噬菌体然后可进行另一个选择循环。优选地，选择持续到至少0.1％的克隆包含与各自靶具有可检测的亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白。取决于所用文库的复杂性，为此需要2-8个循环。
为进行所选脂质运载蛋白突变蛋白的功能分析，用得到的噬菌粒感染大肠杆菌宿主菌株并用标准技术分离噬菌粒DNA(Sambrook，J.等人(1989)，上文)。可将突变的序列片段或完整的脂质运载蛋白突变蛋白核酸序列亚克隆到任何适当的表达载体中。可通过多种本领域已知的方法(如凝胶过滤或亲和层析)从其宿主生物或细胞裂解物中纯化得到的重组脂质运载蛋白突变蛋白。
然而，也可用本领域熟知的其他方法进行脂质运载蛋白突变蛋白的选择。此外，可以组合不同的方法。例如，通过噬菌体展示选择或至少富集的克隆可随后接受菌落筛选测定，以直接分离与给定靶具有可检测亲和力的特定脂质运载蛋白突变蛋白。此外，可应用相当的方法代替产生单个噬菌体文库，以通过反复的、任选的限制其编码核酸序列的诱变而优化突变蛋白与所需靶的亲和力或特异性。
一旦选择了与给定靶具有亲和力的突变蛋白，就还可能将这样的突变蛋白进行进一步的诱变以从由此得到的新文库中选择甚至具有更高亲和力的变体。可通过基于合理设计的位点特异性突变或随机突变完成亲和力成熟。亲和力成熟的一个可能途径是使用易错PCR，其在脂质运载蛋白突变蛋白序列位置的所选范围造成点突变(参见实施例17)。可根据任何已知的方案进行易错PCR，如Zaccolo等人(1996)J.Mol.Biol.255，589-603所述的方案。其他适于亲和力成熟的随机诱变方法包括随机插入/缺失(RED)诱变(如Murakami，H等人(2002)Nat.Biotechnol.20，76-81所述)或非同源随机重组(NRR)(如Bittker，J.A等人(2002)Nat.Biotechnol.20，1024-1029所述)。也可根据WO 00/75308或Schlehuber，S.等人(2000)J.Mol.Biol.297，1105-1120所述的方法进行亲和力成熟，所述方法中得到与洋地黄毒苷具有高亲和力的后胆色素结合蛋白的突变蛋白。
本发明也涉及产生本发明的突变蛋白的方法，其中通过基因工程方法从编码突变蛋白的核酸开始产生突变蛋白、突变蛋白的片段或突变蛋白和另一个多肽的融合蛋白。此方法可在体内进行，突变蛋白可例如在细菌或真核宿主生物中产生，然后从此宿主生物或其培养物中分离。也可能在体外产生蛋白质，例如通过使用体外翻译系统产生蛋白质。
当在体内产生突变蛋白时，通过重组DNA技术(如上面已经概括的)在适当细菌或真核宿主生物中引入编码本发明突变蛋白的核酸。为此目的，首先使用建立的标准方法用包含编码本发明突变蛋白的核酸分子的克隆载体转化宿主细胞(Sambrook，J.等人(1989)，上文)。然后在允许异源DNA表达并从而合成相应多肽的条件下培养宿主细胞。随后，从细胞或者从培养基中回收多肽。既然许多脂质运载蛋白包含分子内二硫键，用适当信号序列指导多肽到具有氧化还原环境的细胞区室是优选的。这样的氧化环境在革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)的周质中或真核细胞内质网的内腔中提供并通常帮助二硫键的正确形成。然而，也可能在宿主细胞(优选地为大肠杆菌)的胞质中产生本发明的突变蛋白。在这种情况下，多肽可例如以包涵体形式产生，然后在体外复性。其他选择为使用具有氧化胞内环境而因此允许在胞质中产生天然蛋白质的特异性宿主菌株。
然而，没有必要仅通过基因工程产生本发明的突变蛋白。相反，也可通过化学合成(如Merrifield固相多肽合成)获得脂质运载蛋白突变蛋白。例如可以用分子建模鉴定有希望的突变然后在体外合成想要的(设计的)多肽并研究与给定靶的亲和力。蛋白质固相和/或溶液相合成的方法为本领域所熟知(综述于Lloyd-Williams，P.等人(1997)《Chemical Approaches tothe Synthesis of peptides and protens.》CRC Press，Boca Raton，Fields，G.B.和Colowick，S.P.(1997)《Solid-Phase Peptide Synthesis》Academic Press，San Diego，或Bruckdorfer，T.等人(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5，29-43)。
本发明也涉及包含至少一种发明的突变蛋白或其融合蛋白以及可药用赋形剂的药物组合物。
根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可通过对蛋白质药物治疗有效的任何肠胃外或非肠胃外(肠内)途径施用。肠胃外应用方法包括例如皮内、皮下、肌内或静脉内注射或输注技术(例如注射液、输液或酊剂形式)以及气雾剂装置和吸入剂(例如气雾剂混合物、喷雾剂或粉末形式)。非肠胃外递送方式为例如经口腔(例如丸剂、片剂、胶囊、溶液或悬浮液形式)或经直肠(例如栓剂形式)。本发明的突变蛋白可以含所需常规非毒性可药用赋形剂或载体、添加剂和熔媒的制剂全身或局部施用。
在本发明优选的实施方案中，利用突变蛋白的低分子量用气雾剂装置(最优选的应用方法之一)经肠胃外给哺乳动物(特别是人)施用药物。
因此，本发明的突变蛋白可用可药用成分以及建立的制备方法配制成组合物(Gennaro，A.L.和Gennaro，A.R.(2000)Remington《The Scienceand Practice of Pharmacy》，第20版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)。为制备药物组合物，可使用制药学上惰性的无机或有机赋形剂。为了制备例如丸剂、粉末剂、胶囊或栓剂，(可使用)例如乳糖、滑石粉、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然和硬化油产生溶液、悬浮液、乳剂、气雾剂混合物或粉末(使用前重建成溶液或气雾剂混合物)的适当赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇和它们适当的混合物以及植物油。
药物组合物也可含有添加剂(如填充剂、黏合剂、润湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂)和其他溶剂或增溶剂或者实现贮藏作用的试剂。后者是融合蛋白可掺入缓慢或持续释放或定向递送系统中，如脂质体和微囊体。
制剂可通过许多方法灭菌，这包括通过细菌阻留滤器过滤或者通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可在使用前溶于或分散于无菌水或其他无菌介质中。
从以上公开显而易见，本发明的突变蛋白或融合蛋白或其缀合物可用于多种应用。通常，这样的突变蛋白可用于使用抗体的所有应用，除了那些特别依赖于Fc部分糖基化的。
本发明的突变蛋白也可用于引导化合物到预选位点。为这样的目的，将突变蛋白与目的化合物接触以允许复合物形成。然后将包含突变蛋白和目的化合物的复合物递送到预选位点。此用途尤其适于但不限于(选择性地)递送药物到假定用此药物治疗的感染的身体部分或器官。
本发明突变蛋白的另一用途是结合/检测给定靶或给定分子，这包括使突变蛋白与假定含有该靶的试样接触，通过适当的信号检测突变蛋白/靶复合物。突变蛋白也可用于分离给定靶，这包括使突变蛋白与假定含有该靶的试样接触以允许复合物形成并从样品中分离突变蛋白/靶复合物。在此类用途中包含突变蛋白和靶的复合物可固定于任何适当的固相上。
可检测的信号可由标记(如上面所释)或通过结合(即自身复合物形成)造成的物理性质的改变引起。一个实例为表面等离振子共振，其数值在配偶体结合过程中变化，通过配偶体固定于表面上(如金箔)。
本文公开的突变蛋白和其衍生物可如此用于许多与抗体或其片段类似的领域。它们除了用于与支持物结合，允许给定突变蛋白的靶或缀合物或此靶的融合蛋白固定或分离，还可用带有酶、抗体、放射性物质或任何其他具有生物化学活性或确定的结合特征的基团标记。通过这样做，可检测它们各自靶或缀合物或其融合蛋白或使它们与其接触。例如，本发明的突变蛋白可通过建立的分析方法(例如ELISA或蛋白质印迹)或通过显微镜或免疫传感器(immunosensorics)用于检测化学结构。在此，可通过使用适当的突变蛋白缀合物或融合蛋白直接产生检测信号或经由抗体免疫化学检测突变蛋白间接产生检测信号。
本发明的突变蛋白在医学中存在许多可能的应用。它们除了用于诊断和药物递送外，可产生例如结合组织或肿瘤特异性细胞表面分子的本发明突变多肽。这样的突变蛋白可例如以缀合形式或者作为用于“肿瘤造影”的融合蛋白使用或者直接用于癌症治疗。
本文所述突变蛋白的另一个相关并优选的用途是靶确认，即分析假定参与疾病或紊乱发生或进程的多肽是否在某种程度上确实是那种疾病或紊乱的成因。确认蛋白质为药理学药物靶的用途利用本发明的突变蛋白特异识别天然构象的蛋白质表面区域的能力，即与天然表位结合。在这方面，应注意到只报道了有限数量重组抗体的这种能力。然而，用本发明的突变蛋白用于确认药物靶不限于检测蛋白质为靶，还包括检测蛋白质结构域、肽、核酸分子、有机分子或金属复合物。
本发明还通过下列附图和实施例描述，其中图1显示了成熟人泪脂质运载蛋白的多肽序列(SWISS-PROT DataBank Accession Number M90424)。
图2图示描述了脂质运载蛋白折叠的结构。
图3图示说明了泪脂质运载蛋白突变蛋白文库的产生，该突变蛋白于核酸水平在β桶结构闭合末端随机化。
图4图示描述了噬菌粒载体pTLPC7。
图5图示描述了质粒载体pTLPC6。
图6图示说明了泪脂质运载蛋白突变蛋白文库的产生，该突变蛋白于核酸水平在β桶结构开放末端随机化。
图7图示描述了噬菌粒载体pTLPC12。
图8显示了表达载体pTLPC8的示意图。
图9描述了ELISA中TLPC突变蛋白S69.4 O13与rhu VEGF165的结合。
图10描述了ELISA中TLPC突变蛋白S76.1 H10单体与hCD22的结合。
图11描述了ELISA中TLPC突变蛋白S76.1 H10二聚体与hCD22的结合。
图12描述了ELISA中TLPC突变蛋白S67.7 C6与人CD25的结合。
图13图示描述了哺乳动物转染载体CD25-pcDNA3.lZeo(+)。
图14显示了表达人CD25(带有荧光素标记的TLPC突变蛋白S67.7C6)的CHO细胞的染色。
图15图示描述了表达载体pTLPC9。
图16描述了ELISA中TLPC突变蛋白F92.8 M1.2 E15单体级分与人CD25的结合。
图17描述了ELISA中TLPC突变蛋白F92.8 M1.2 E15二聚体级分与人CD25的结合。
图18图示描述了哺乳动物转染载体CD154-pcDNA3.1Zeo(+)。
图19显示了表达人CD25(带有荧光素标记的TLPC突变蛋白F92.8M1.2 E15)的CHO细胞的染色。
图20描述了ELISA中TLPC突变蛋白S99.3 H24、S99.3 C13和S99.4F15分别与人CD25的结合。
图21图示描述了表达载体pTLPC14。
图22描述了ELISA中TLPC突变蛋白S100.1 I08单体和二聚体与hCD33-Fc的结合。
图23描述了ELISA中TLPC突变蛋白S101.2 A20与hCD33-Fc的结合。
图24描述了ELISA中TLPC突变蛋白S101.2 O08单体和二聚体与hCD33-Fc的结合。
图25描述了BIAcore实验中TLPC突变蛋白S100.1 I08二聚体与hCD33-Fc的结合。
图26描述了BIAcore实验中TLPC突变蛋白S101.2 A20与hCD33-Fc的结合。
图27描述了BIAcore实验中TLPC突变蛋白S101.2 O08与hCD33-Fc的结合。
图1显示了成熟人泪脂质运载蛋白的多肽序列(SWISS-PROT DataBank Accession Number M90424，158个氨基酸，也参见Redl B.(2000)Biochim.Biophys.Acta，上文)。在这方面，注意到如下修饰的人蛋白质用于下列产生脂质运载蛋白突变蛋白的实施例中。首先，删除了人泪脂质运载蛋白(HHLL)储存序列的前四个N端氨基酸残基。第二，也删除了最后两个C端氨基酸残基(SD)。第三，序列位置5-7的野生型序列(ASD)变成GGD。这些变化反应在附带的序列表中，其中氨基酸GGD指示为所用泪脂质运载蛋白的前三个残基。β桶结构开放末端的四个片段(AB、CD、EF和GH)(其中交换了氨基酸)通过双下划线在TLPC的序列下标出。片段BC、DE和FG以及N端肽序列(其中引入突变以在β桶结构的闭合末端建立结合位点)以粗体和单下划线标出。在实施例中突变的TLPC序列位置额外地用星号标记。
图2图示说明了脂质运载蛋白折叠的特有特征(根据Flower，D.R.(1996)，上文)。反平行β片层(形成β桶)的八条β链以箭头显示并标记为A-H(称为I的第九条β链也以图示展示，其还存在于一些脂质运载蛋白中)。两条链的氢键连接通过它们之间的两条虚线指出。连接环以实心曲线显示。β桶的两个末端在拓扑学上是不同的。一个末端具有四个β发夹结构(环AB、CD、EF和GH)，已知的脂质运载蛋白配体结合位点开放于此并称为开放末端。β桶的另一个末端具有三个环(BC、DE和FG)，其于N端多肽区域一起构成闭合末端并用于本发明以引入备选的结合位点。形成折叠的三个主要结构保守区域(SCR1、SCR2和SCR3)的部分以方框标出。
图3图示显示了通过反复的聚合酶链式反应(PCR)在修饰的TLPC中17个所选氨基酸位置协同诱变的策略。为N端附近的序列和三个肽环BC、DE和FG各自(其中氨基酸得到突变)分别合成了寡脱氧核苷酸(SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)，其携带序列表中指出的随机核苷酸。由于所选组合物的原因，总共三个可能的终止密码子中只允许琥珀终止密码子TAG为突变密码子，其在大肠杆菌supE菌株XL1-blue(Bullock等人(1987)Bio Techniques 5，376-378)或TGI(Sambrook等人，上文)中翻译成谷氨酰胺。对于特定应用，例如在其他细菌菌株或生物体中基因表达，这样的无义密码子可由谷氨酰胺编码密码子替换，例如通过定点诱变。使用pTLPC6质粒DNA(SEQ ID NO2)作为模板分别用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4扩增具有159个碱基对的核酸片段(PCR No.1，A)。在另一个PCR中，同样使用pTLPC6作为模板分别用引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6扩增具有123个碱基对的核酸片段(PCRno.1，B)。两个PCR产物的混合物用作另一个扩增中的模板(PCR No.2)，其用两个5’生物素化侧翼PCR引物(即SEQ ID NO7和SEQ ID NO8)，以及中间引物SEQ ID NO9扩增得341个碱基对的DNA片段。随后用两个BstXI限制酶切位点将包含所有17个突变密码子的这个片段克隆到载体pTPLC7中，其特殊排列导致能特别有效连接的两个不相容的重叠DNA末端。可通过用顺磁链霉抗生物素包被的小珠纯化消化的PCR片段提高连接效率。在构建pTLPC6过程中预先完成Glu104Gin氨基酸替换以及ompA信号序列的Ala-3密码子、Ala21和His106密码子中的沉默突变，以在TLPC编码序列中引入两个BstXl限制酶切位点。
图4显示了编码融合蛋白的载体pTLPC7的示意图，所述融合蛋白由OmpA信号序列(OmpA)、修饰的TLPC(带有Ala5Asp、Ser6Gly、Asp7Gly、Cys101Ser和Glu104Gln氨基酸替换)(TLPC cDNA见Redl等人，上文)和截短形式的M13外被蛋白pIII(其包含氨基酸217-406(pIII))组成。基因表达受四环素启动子/操纵子(tetP/O)系统控制。转录在脂蛋白转录终止子(tlpp)处终止。载体还包含复制起点(ori)、丝状噬菌体fl的基因间区域(f1-IG)、编码β内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因(bla)和四环素阻抑基因(tetR)。琥珀终止密码子(在SupE琥珀抑制基因宿主菌株中部分地翻译成Gln)位于TLPC编码区和截短的噬菌体外被蛋白pIII的编码区之间。用于克隆突变的基因盒的BstXI限制酶切位点和结构基因侧翼的限制酶切位点都做了标记。pTLPC7的XbaI-HindIII片段的核酸序列与编码的氨基酸序列一起在序列表中以SEQ ID NO1显示。此区域外的载体序列与pASK75的相同，其完整核苷酸序列在德国专利出版物DE 44 17 598 Al中给出。
图5显示了载体pTLPC6的示意图。pTLPC6编码由OmpA信号序列、根据图1的修饰的TLPC和Strep-tagII亲和标签组成的融合蛋白。另外，载体与pTLPC7相同。pTLPC6的XbaI-HindIII片段的核酸序列在序列表中与编码的氨基酸序列一起以SEQ ID NO2显示。此区域外的载体序列与pASK75的相同，其完整核苷酸序列在德国专利出版物DE 44 17598 Al中给出。
图6图示显示了通过反复聚合酶链式反应(PCR)在修饰的TLPC中协同诱变17或19个所选氨基酸位置的策略。合成三个正向寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO26，SEQ ID NO27和SEQ ID NO28)以随机化环AB，其在长度上不同，分别编码随机化的环AB以及两个和四个氨基酸的延伸，并为环CD(SEQ ID NO29)合成了一个反向寡脱氧苷酸。此外，分别为环EF和GH合成了两个寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO30和SEQ ID NO31)。这些寡核苷酸带有如序列表所示的随机核苷酸，其中氨基酸得到突变。使用pTLPC12质粒DNA(图7，SEQ ID NO23)作为模板用各自的引物SEQID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28和SEQ ID NO29扩增(PCRNo.1，A)具有142、148和154个碱基对的3个核酸片段。在另一个PCR中，也使用pTLPC12作为模板分别用引物SEQ ID NO30和SEQ IDNO31扩增(PCR No.1，B)119个碱基对的核酸片段。从PCR No.1 B中得到的PCR片段B与从PCR No.1 A中获得的三个PCR片段A每一个(不同的AB环长度)的混合物在另一个扩增(PCR No.2)中用作模板，其使用以SEQ ID NO33和SEQ ID NO34给出两个的5’生物素化侧翼PCR引物和中间引物SEQ ID NO32。这个PCR造成由336、342和348个碱基对大小组成的DNA片段的扩增，其几乎包含具有17个(环AB和延伸4个氨基酸的环AB)或19个(延伸2个氨基酸的环AB)突变密码子的泪脂质运载蛋白的完整结构基因。随后用两个BstXI限制酶切位点将片段克隆到载体pTPLC12中，其特殊排列导致能特别有效连接的两个不相容的重叠DNA末端。可通过用顺磁链霉抗生物素包被的小珠纯化消化的PCR片段以提高连接效率。在构建pTLPC12过程中预先完成Ser14Pro和Lys114Gln氨基酸替换以及Met21、Val110密码子和Val116密码子中的沉默突变以在TLPC编码序列中引入两个BstXl限制酶切位点。
图7显示了编码融合蛋白的载体pTLPC12的示意图，所述融合蛋白由OmpA信号序列(OmpA)、T7检测标签、修饰的TLPC(带有Ser14Pro、Lys114Gln、Cys101Ser和Glu104GIn氨基酸替换(TLPC cDNA见Redl等人，上文))和截短形式的M13外被蛋白pIII(包含氨基酸217-406(pIII))组成。基因表达受四环素启动子/操纵子(tetP/O)系统控制。转录在脂蛋白转录终止子(tlpp)处终止。载体还包含复制起点(ori)、丝状噬菌体fl的基因间区域(fl-IG)、编码β内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因(bla)和四环素阻抑基因(tetR)。琥珀终止密码子(在SupE琥珀抑制基因宿主菌株中部分地翻译成Gln)位于TLPC编码区和截短的噬菌体外被蛋白pIII的编码区之间。用于克隆突变的基因盒的BstXI限制酶切位点和结构基因侧翼的限制酶切位点都做了标记。pTLPC12的XbaI-HindIII片段的核酸序列在序列表中与编码的氨基酸序列一起以SEQ ID NO23显示。此区域外的载体序列与pASK75的相同，其完整核苷酸序列在德国专利出版物DE 44 17 598 Al中给出。
图8显示了表达载体pTLPC8的示意图。pTLPC8编码融合蛋白，此蛋白由OmpA信号序列、根据图4的修饰的泪脂质运载蛋白、之后的T7检测标签(T7)和C端Strep-tagII组成。pTLPC8核酸序列的相关片段与序列表SEQ ID NO24中的编码氨基酸序列一起再现。片段从XbaI限制酶切位点开始到HindIII限制酶切位点结束。此区域外的载体元件与载体pASK75相同，其完整核苷酸序列在德国专利出版物DE44 17 598 Al中显示。
图9显示了实施例6数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白和指定靶rhuVEGF165以及无关靶BSA的结合测量。将TLPC突变蛋白S69.4 O13(实心圆)和固定于ELISA板上的rhuVEGF165的结合与突变蛋白和作为对照的BSA(也固定于ELISA板上，空心圆)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白以浓度依赖的方式结合rhuVEGF165，而没有检测到与无关靶(空心圆)的显著结合信号。
图10显示了实施例10数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白S76.1 H10单体和指定靶hCD22以及无关靶IgG1、HSA和hCD33-Fc的结合测量。将TLPC突变蛋白S76.1 H10单体和hCD22(实心方形)的结合与突变蛋白和IgG1(空心三角形)、HSA(空心圆)和hCD33-Fc(空心菱形)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白以浓度依赖的方式结合hCD22，而没有检测到与无关靶的显著结合信号。
图11显示了实施例10数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白S76.1 H10二聚体和指定靶hCD22以及无关靶IgG1、HSA和hCD33-Fc的结合测量。将固定的TLPC突变蛋白S76.1 H10二聚体和hCD22(实心圆)的结合与突变蛋白和IgG1(空心三角形)、HSA(空心方形)和hCD33-Fc(空心菱形)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白以浓度依赖的方式结合hCD22，而没有检测到与无关靶的显著结合信号。
图12显示了实施例14数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白S67.7 C6和指定靶CD25以及无关靶捕获mAb、HSA、FCS和捕获的人IgG Fc片段的结合测量。将TLPC突变蛋白S67.7C(实心圆)和CD25-Fc(通过捕获mAb固定于ELISA板上)的结合与突变蛋白和作为对照的捕获mAb(空心圆)(也固定于ELISA板上)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白67.7 C6以浓度依赖的方式结合CD25，而没有检测到与无关靶捕获mAb(空心符号)的显著结合信号。只显示无关靶的对照结合曲线，但是其他所测试的对照靶获得了相似结果。
图13显示了哺乳动物转染载体CD25-pcDNA3.1Zeo(+)的示意图。该载体编码根据NCBI ACCESSION NM_00417[gi4557666]的人CD25完整cDNA序列。人CD25核酸序列的相关片段与编码氨基酸序列在序列表中以SEQ ID NO10一起再现。片段从HindIII限制酶切位点开始并到XhoI限制酶切位点结束。此区域外的载体元件与载体pcDNA3.1Zeo(+)(Invitrogen)的相同。
图14显示了表达人CD25(带有荧光素标记的TLPC突变蛋白S67.7C6)的CHO细胞的染色。表达载体CD25-pcDNA3.1Zeo(+)(CHO-CD25；上面部分)或亲本载体pcDNA3.1Zeo(+)(CHO；下面部分)转染的CHO细胞与等摩尔比的荧光素标记的CD25特异性突变蛋白S67.7 C6(左部分；实线直方图)或FITC标记的CD25特异性mAb(右部分；实线直方图)孵育。与之平行，这些细胞系与等摩尔比的重组野生型TLPC(pTLPC8编码，荧光素标记)(左部分；虚线直方图)或FITC标记的IgG1(右部分；虚线直方图)孵育，二者都作为对照。CD25特异性突变蛋白S67.7 C6和CD25特异性mAb都显示表达人CD25的CHO细胞系的显著染色，而没有出现假转染CHO细胞系的显著染色。对照野生型TLPC和IgG1没有显示与所测试的两个细胞系的显著结合。
图15显示了pTLPC9的示意图。该载体编码融合蛋白，此融合蛋白包括OmpA信号序列、根据图1的修饰的泪脂质运载蛋白、Strep-tagII和链球菌(Streptococcus)G蛋白的白蛋白结合结构域(abd)(Kraulis等人(1996)REBS Lett.378，190-194)。在Strep-tagII和C端白蛋白结合结构域之间引入琥珀终止密码子，以在使用非抑制大肠杆菌菌株时允许无ABD的TLPC突变蛋白的可溶性表达。pTLPC9核酸序列的相关片段与编码的氨基酸序列在序列表中以SEQ ID NO22一起再现。片段从XbaI限制酶切位点开始到HindIII限制酶切位点结束。此区域外的载体元件与载体pASK75的相同，其完整核苷酸序列在德国专利出版物DE 44 17 598 Al中显示。
图16显示了实施例21数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白F92.8 M1.2 E15单体级分和指定靶CD25以及无关靶捕获mAb、HSA、FCS和捕获的人IgG Fc片段的结合测量。将TLPC突变蛋白F92.8M1.2 E15单体级分(实心圆)和CD25-Fc(通过捕获mAb固定于ELISA板上)的结合与突变蛋白和作为对照的捕获mAb(也固定于ELISA板上，空心圆)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白F92.8 M1.2 E15单体级分以浓度依赖的方式结合CD25，而没有检测到与无关靶捕获mAb(空心符号)的显著结合信号。只显示无关靶的对照结合曲线，但是其他所测试的对照靶获得了相似结果。
图17显示了实施例21数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白F92.8 M1.2 E15二聚体级分和指定靶CD25以及无关靶捕获mAb、HSA、FCS和捕获的人IgG Fc片段的结合测量。将TLPC突变蛋白F92.8M1.2 E15二聚体级分(实心圆)和CD25-Fc(通过捕获mAb固定于ELISA板上)的结合与突变蛋白和作为对照的捕获mAb(也固定于ELISA板上，空心圆)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白F92.8 M1.2 E15二聚体级分以浓度依赖的方式结合CD25，而没有检测到与无关靶捕获mAb(空心符号)的显著结合信号。只显示无关靶的对照结合曲线，但是其他所测试的对照靶获得了相似结果。
图18显示了哺乳动物转染载体CD154-pcDNA3.1Zeo(+)的示意图。该载体编码根据NCBI ACCESSION BC_074950[gi49902361]的人CD154完整cDNA序列。人CD154核酸序列的相关片段与编码氨基酸序列在序列表中以SEQ ID NO11一起再现。片段从XhoI限制酶切位点开始并到ApaI限制酶切位点结束。此区域外的载体元件与载体pcDNA3.1Zeo(+)(Invitrogen)的相同图19显示了表达人CD25(带有荧光素标记的TLPC突变蛋白F92.8M1.2 E15)的CHO细胞的染色。表达载体CD25-pcDNA3.1Zeo(+)(CHO-CD25；上面部分)或表达载体CD154-pcDNA3.1Zeo(+)(CHOCD-154；下面部分)转染的CHO细胞与两倍摩尔比的荧光素标记的提高亲和力的CD25特异性突变蛋白F92.8 M1.2 E15(左部分；实线直方图)或FITC标记的CD25特异性mAb(右部分；实线直方图)孵育。与之平行，这些细胞系与两倍摩尔比的重组野生型TLPC(pTLPC8编码，荧光素标记)(左部分；虚线直方图)或FITC标记的IgG1(右部分；虚线直方图)孵育，两者都作为对照。亲和力提高的CD25特异性突变蛋白F92.8 M1.2 E15和CD25特异性mAb都显示表达人CD25的CHO细胞系的显著染色，而没有出现表达人CD154的CHO细胞系的显著染色。对照野生型TLPC和IgG1没有显示与所测试的两个细胞系的显著结合。
图20显示了实施例26数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白S99.3 H24、S99.3 C13和S99.4 F15分别与指定靶CD25以及无关靶捕获mAb、HSA、FCS和捕获的人IgG Fc片段的结合测量。将TLPC突变蛋白S99.3 H24(实心圆)、S99.3 C13(实心方形)、S99.4 F15(实心三角形)分别和CD25-Fc(通过捕获mAb固定于ELISA板上)的结合与各个突变蛋白和作为对照的捕获mAb(分别为空心圆、空心方形和空心三角形，也固定于ELISA板上)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白S99.3H24、S99.3 C13和S99.4 F15以浓度依赖的方式结合CD25，而没有检测到与无关靶捕获mAb(空心符号)的显著结合信号。只显示无关靶的对照结合曲线，但是其他所测试的对照靶获得了相似结果。
图21显示了pTLPC14的示意图。该载体编码融合蛋白，此融合蛋白包括OmpA信号序列、T7检测标签(T7)、根据图7的修饰的泪脂质运载蛋白、C端Strep-tagII。PTLPC14核酸序列的相关片段与编码的氨基酸序列在序列表中以SEQ ID NO25一起再现。片段从XbaI限制酶切位点开始到HindIII限制酶切位点结束。此区域外的载体元件与载体pASK75的相同，其完整核苷酸序列在德国专利出版物DE 44 17 598 Al中显示。
图22显示了实施例30数据的图示，其中通过ELISA进行突变蛋白S100.1 I08的TLPC单体级分以及二聚体级分和指定靶hCD33-Fc以及无关靶hCD22的结合测量。将TLPC突变蛋白S100.1 I08和hCD33-Fc(实心圆；实心三角形)的结合与和hCD22(空心圆；空心三角形)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白以浓度依赖的方式结合hCD33-Fc，而没有检测到与无关靶的显著结合信号。
图23显示了实施例30数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白S101.2 A20和指定靶hCD33-Fc以及无关靶hCD22和hIgG1的结合测量。将TLPC突变蛋白S101.2 A20和hCD33-Fc(实心圆)的结合与突变蛋白和IgG1(空心圆)、hCD22(空心三角形)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白以浓度依赖的方式结合hCD33-Fc，而没有检测到与无关靶的显著结合信号。
图24显示了实施例30数据的图示，其中通过ELISA进行TLPC突变蛋白S101.2 O08的单体以及二聚体级分和指定靶hCD33-Fc以及无关靶hCD22和hIgG1的结合测量。将TLPC突变蛋白S101.2 O08和hCD33-Fc(实心圆；实心方形)的结合与突变蛋白和hIgG1(空心圆；空心菱形)、hCD22(空心圆；空心方形)的相互作用进行比较。TLPC突变蛋白以浓度依赖的方式结合hCD33-Fc，而没有检测到与无关靶的显著结合信号。
图25显示了来自实施例31的结合测量的传感图，其中以RU(＝反应单位)测量的结合信号对时间作图。TLPC突变蛋白S100.1 I08在注入过程中结合指定靶hCD33-Fc。注入之后用工作缓冲液洗涤表面，突变蛋白从其靶解离。用BIAevaluation软件3.1测定结合速率和解离速率常数(kon和koff)。
图26显示了来自实施例31的结合测量的传感图，其中将以RU(＝反应单位)测量的结合信号对时间作图。TLPC突变蛋白S101.2 A20在注入过程中结合指定靶hCD33-Fc。注入之后用工作缓冲液洗涤表面，突变蛋白从其靶解离。用BIAevaluation软件3.1测定结合速率和解离速率常数(kon和koff)。
图27显示了来自实施例31的结合测量的传感图，其中以RU(＝反应单位)测量的结合信号对时间作图。TLPC突变蛋白S101.2 O08在注入过程中结合指定靶hCD33-Fc。注入之后用工作缓冲液洗涤表面，突变蛋白从其靶解离。用BIAevaluation软件3.1测定结合速率和解离速率常数(kon和koff)。
实施例实施例1产生具有100亿个独立TLPC突变蛋白的文库除非另外指出，使用建立的重组遗传方法，例如Sambrook等人(上文)中所述的方法。
根据图3在多步骤中使用PCR通过N端附近和肽环BC、DE和FG中的全部17个所选氨基酸位置的协同诱变制备高度复杂性的TLPC随机文库。在第一扩增步骤的两个PCR(PCR No.1，A和B)中都进行100μl体积的PCR反应，其中使用10ng pTLPC6质粒DNA(图5，SEQ ID NO2)作为模板，并使用50pmol的各对引物(分别是SEQ ID NO3和SEQID NO4或SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)，所述引物用常规的亚磷酰胺法合成。另外，反应混合物含有10μl 10x Taq缓冲液(100mM Tris/HClpH9.0，500mM KCl，15mM MgCl2，1％v/v Triton X-100)，2μl dNTP混合物(10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。加水补足体积后，加入5U Taq DNA聚合酶(5U/μl，Promega)，在有加热盖的热循环仪(Eppendorf)中进行94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1.5分钟的20个循环，之后在60℃温育5分钟终止延伸。用Jetsorb DNA抽提试剂盒(Genomed)通过制备型琼脂糖凝胶电泳从GQT琼脂糖(Roth)中分离出所需的扩增产物。
为随后扩增步骤，在存在1000pmol各装配引物SEQ ID NO7、SEQID NO8和20pmol中间引物SEQ ID NO9下制备2000μl的混合物，其中1000fmol这些各个片段都用作模板。两个装配引物在其5’末端都具有生物素基团，其允许BstXI切割之后通过链霉抗生物素包被的顺磁小珠纯化PCR产物。另外，加入200μl 10x Taq缓冲液、40μl dNTP混合物(10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、100u Taq DNA聚合酶(5U/μl，Promega)和水使混合物的终体积达2000μl。将混合物分成100μl的等分试样并以94℃1分钟、60℃1分钟、72℃1.5分钟的20个循环进行PCR，随后60℃孵育5分钟。用E.Z.N.A.Cycle-Pure试剂盒(PeqLab)纯化PCR产物。
为克隆目的，首先根据生产商的说明书用限制性内切酶BstXI(Promega)切割代表核酸形式的TLPC突变蛋白文库的此片段，然后如上所述通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化，得到303个核苷酸大小的双链DNA片段。通过其5’生物素标签，用链霉抗生物素包被的顺磁小珠(Merck)去除未消化或未完全消化的DNA片段。
因此，用100μl TE缓冲液洗涤商业购买的顺磁颗粒悬浮液(浓度10mg/ml)三次。然后干燥颗粒并与100pmol DNA片段(溶于100μl TE缓冲液)室温混合15分钟。在磁体的辅助下将顺磁颗粒收集在Eppendorf管的壁上，回收含DNA片段的上清液以进一步用于下面的连接反应。
如上所述用BstXI切割载体pTLPC7(图4)的DNA并通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化得到的两个片段中较大的一个(3907bp)。为进行连接反应，在833 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)存在下，在8330μl总体积(50mM Tris/HCl pH7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、50μg/ml BSA)中，16℃孵育5.99μg(30pmol)PCR片段和77.3μg(30pmol)载体片段24h。随后加入208μl酵母tRNA(10mg/ml水溶液(Roche))、8330μl 5M乙酸铵及33.3ml乙醇来沉淀连接混合物中的DNA。室温孵育1h之后离心(30分钟，16000g，4℃)。用5ml乙醇(70％v/v，-20℃)洗涤沉淀，离心(10分钟，16000g，4℃)，并空气干燥直到DNA沉淀变成有光泽且无色。最后将DNA在总体积416.5μl水中溶解成终浓度200μg/ml。
根据Tung和Chow(Trends Genet.11(1995)，128-129)及Hengen(Trends Biochem.Sci.21(1996)，75-76)描述的方法进行电感受态大肠杆菌XL1 Blue(Bullock等人，上文)的制备。通过加入稳定期的XL1-blue过夜培养物将1L LB培养基调整为600nm光密度为OD600＝0.08，于26℃以200rpm在2L三角瓶中孵育。达到OD600＝0.6后，培养物在冰上冷却30分钟，随后于4℃4000g离心15分钟。用500ml冰冷的10％w/v甘油洗涤细胞两次，最后重悬于2ml冰冷的GYT培养基中(10％w/v甘油，0.125％w/v酵母抽提物、0.25％w/v胰蛋白胨)。然后将细胞分成等分试样(200μl)，液氮速冻并存于-80℃。
使用Micro Pulser系统(BioRad)与来自同一供应商的小杯(电极间距2mm)进行电穿孔。所有步骤使用-20℃预冷的小杯在室温进行。每10μlDNA溶液(2μg)与100μl细胞悬液混合，冰上孵育1分钟，转到预冷的小杯中。进行电穿孔(5ms，12.5kV/cm)并立即在2ml SOC培养基中稀释悬液，37℃140转/分孵育60分钟。之后在4L含100μg/ml氨苄青霉素(2YT/Amp)的2x YT培养基中稀释培养物至OD550为0.26。使用总计78.61μg的连接DNA通过42次电穿孔获得大约1.0×1010个转化体。如PCT申请WO 03/029471的实施例7或者PCT申请WO 99/16873的实施例1中所述进一步使用转化体制备以融合蛋白编码TLPC突变蛋白文库的噬菌粒。
实施例2产生具有100亿个独立TLPC突变蛋白的文库根据图6在多个步骤中使用PCR，通过AB、CD、EF以及GH四个肽环(包括脂质运载蛋白开放末端的天然脂质运载蛋白结合口袋)中所选氨基酸位置的协同诱变制备高度复杂性的另一个TLPC随机文库。使用如实施例1所述的相同PCR策略，通过插入两个或四个氨基酸，在环AB中引入长度变化，但是其中使用两个不同的寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO27和SEQ ID NO28)制备来自PCR A的片段，所述寡脱氧核苷酸包含6个或12个额外的随机核苷酸以插入两个或四个氨基酸。为了稳定带有四个氨基酸插入的环AB，通过寡核苷酸SEQ ID NO28编码的氨基酸替换V24W、D25S和M31N、N32S来固定N端和C端的锚定位置。以如实施例1所述相同的方式进行PCR反应，而在第一个扩增步骤中(PCR No.1)使用pTLPC12质粒DNA(图7，SEQ ID NO23)作为模板和引物SEQ IDNO26和SEQ ID NO29扩增未延长的环AB，使用引物SEQ ID NO27和SEQ ID NO29延伸2个氨基酸，或使用引物SEQ ID NO28和SEQ IDNO29延伸4个氨基酸。该PCR引起由336、342和348个碱基对组成的DNA片段的扩增，所述DNA片段几乎包含泪脂质运载蛋白的完整结构基因，其具有17个(环AB未延长和环AB延长4个氨基酸)或19个(环AB延长2个氨基酸)突变密码子。在PCR No.1 B中使用寡核苷酸SEQ IDNO30和SEQ ID NO31以扩增PCR片段B。用Wizard SV Gel和PCRClean-Up System(Promega)，通过制备型琼脂糖凝胶电泳从GTQ琼脂糖中(Roth)分离所需扩增产物。
为在随后的扩增步骤中(PCR No.2)组装PCR片段A和B，各PCR片段A与PCR片段B在单独的1000μl混合物中混合，其中在500pmol每一种组装引物SEQ ID NO33、SEQ ID NO34和10pmol中间引物SEQID NO32的存在下，使用约500fmol这些各片段作为模板。用Wizard SVGel和PCR Clean-Up System(Promega)纯化PCR产物。
为克隆目的，首先根据生产商的说明书用限制性内切酶BstXI(Promega)切割这个代表核酸形式TLPC突变文库的片段，然后如上所述纯化，得到大小为299、305和311个核苷酸的双链DNA片段。如实施例1所述，通过其5’生物素标签，用链霉抗生物素包被的顺磁小珠(Merck)去除未消化或未完全消化的DNA片段。
如实施例1所述从载体pTLPC12(图7)的DNA制备和纯化3944片段，以随后连接上文的TLPC突变蛋白。为进行连接反应，在存在840 Weiss单位的T4 DNA连接酶(Promega)的条件下，在总体积8400μl(50mMTris/HCl pH 7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、50μg/ml BSA)中于16℃孵育1.97μg(10pmol)各PCR片段和84μg(30pmol)载体片段38h。然后加入210μl酵母tRNA(10mg/ml水溶液(Roche))、8400μl 5M乙酸铵和33.6ml乙醇沉淀连接混合物中的DNA。其他流程根据实施例1进行并且最后将DNA在总体积420μl的水中溶解成终浓度200μg/ml。
根据实施例1进行电感受态大肠杆菌XL1-Blue(Bullock等人，上文)的制备和转化。使用总计85.97μg连接DNA在42次电穿孔中得到大约0.6×1010个转化体。根据PCT申请WO 03/029471的实施例7或PCT申请WO 99/16873的实施例1的描述进一步使用转化体制备噬菌粒。
实施例3噬菌粒呈递及用高结合力的聚苯乙烯多孔板筛选针对VEGF的TLPC突变蛋白为筛选TLPC突变蛋白，使用实施例1得到的文库中的2×1012-1×1013个噬菌粒。简言之，离心噬菌粒(21460xg，4℃，20min)并重悬于1ml含50mM苯甲脒的PBS中(4mM KH2PO4、16mM Na2BPO4、115mMNaCl，pH 7.4)。用含6％w/v牛血清白蛋白(BSA；Roth)和0.3％Tween 20的PBS作为封闭缓冲液。在与靶蛋白孵育之前，在牛血清白蛋白封闭的聚苯乙烯孔中孵育来自文库的噬菌粒两次(每次15分钟)，以消除呈递多反应性或错误折叠的脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒。以2.5μg/ml的浓度将昆虫细胞(R&D Sytems)产生的重组人血管内皮生长因子(165个氨基酸，rhuVEGF165)包被在聚苯乙烯板上。在包被并封闭的孔中孵育封闭的噬菌粒之后化学洗脱吸附的噬菌粒。吸附的噬菌粒用每孔300μl 0.1M的甘氨酸/HCl(pH 2.2)处理10分钟，然后通过将其与适量0.5M Tris混合立即中和每一洗脱级分的pH。从第二个富集循环开始，只使用一半的组合噬菌粒溶液进行噬菌粒扩增。每一轮筛选之后，通过点滴定测定噬菌粒输入量、第八个洗脱级分和洗脱的噬菌粒的滴度。简言之，连续稀释的噬菌粒溶液与大肠杆菌XL1-Blue细胞混合并在37℃孵育30min。将感染细胞的等分试样“点”于LB/Amp琼脂板上并于37℃孵育过夜。次日计数每一点的菌落并测定噬菌粒溶液的滴度(cfu/ml)。噬菌粒扩增在22℃进行。
以这种方式进行针对rhuVEGF165的四个另外的选择循环，其使用来自各个前面富集循环的扩增噬菌粒制品，而从第二个富集循环开始只使用大约1×1011个噬菌粒。
实施例4用高通量ELISA筛选法鉴定结合VEGF的TLPC突变蛋白构建了载体pTLPC8(图8，SEQ ID NO24)以分析型生产带有C端T7检测标签(Novagen)和之后的Strep-tagII亲和标签的TLPC突变蛋白并通过高通量ELISA筛选表征其特征。将在两个BstXI切割位点间含有TLPC支架的基因盒从载体pTLPC7(图4，SEQ ID NO1)亚克隆到pTLPC8中。
为此目的，用Plasmid Miniprep Spin试剂盒(Genomed)从大肠杆菌克隆的混合物中分离质粒DNA，所述大肠杆菌克隆通过用来自实施例3的噬菌粒感染获得，所述噬菌粒作为最后选择循环的结果洗脱。用限制性内切酶BstXI切割DNA并通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化两个片段中较小的一个。载体pTLPC8的DNA同样用BstXI切割并以相同方式分离两个片段中较大的一个(3397bp)。
为进行连接反应，在20μl(30mM Tris/HCl pH 7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP)的总体积中混合各50fmol的两个DNA片段与3Weiss单位的T4 DNA连接酶(Promega)，然后于22℃孵育2h。根据CaCl2方法用5μl此连接混合物转化大肠杆菌TGI-F-(丢失其附加体的大肠杆菌K12 TG1)并涂布于LB/Amp琼脂板上(直径14cm)。
通过自动菌落采集器(Genetix)将转化后得到的单个大肠杆菌菌落(带有编码TLPC突变蛋白的各个TLPC质粒)从这些琼脂板上采到平底384孔板中(Greiner)的2x YT/Amp中(每孔70μl)，并在60％相对湿度(rH)的湿润孵育箱中(MMM Medcenter)在700转/分的benchtop摇床(Buhler)上于37℃生长过夜。通过96 pin replicating head(Genetix)将培养物1∶100稀释到圆底96孔板(Nunc)中的100μl 2x YT/Amp中并于37℃和60％rH生长大约1h，然后在22℃和60％rH条件下孵育3h(两者均为700转/分)直到OD550达大约0.6。384孔板在每个孔加入25μl 60％v/v甘油之后作为“主(master)”板保存在-80℃。
通过在细菌培养物中加入每孔20μl 1.2μg/ml的无水四环素(溶于2xYT；通过在2x YT中1∶1667稀释2mg/ml的母液获得；终浓度0.2μg/ml)并在22℃、700转/分和60％rH条件下孵育过夜，在96孔板中产生重组TLPC突变蛋白。之后，在每个孔转加入40μl裂解缓冲液(400mM硼酸钠，pH 8.0、320mM NaCl、4mM EDTA、0.3％w/v溶菌酶)并且平板在22℃、700转/分和60％rH条件下孵1h。为使随后ELISA实验中非特异性结合作用降到最低，得到的粗细胞提取物在22℃、700转/分和60％rH条件下补充每孔40μl含10％w/v BSA和0.05％v/v Tween 20(终浓度2％w/v BSA)的PBS 1h。
为检测结合，在ELISA实验中分别测试含TLPC突变蛋白的粗细胞提取物与指定靶蛋白rhuVEGF165和无关对照蛋白质人血清白蛋白(HSA，Sigma)的反应性。因此black Fluotrac 600 ELISA平板(Greiner；384孔)的孔用20μl rhuVEGF165溶液(浓度2.5μg/ml，溶于PBS)或对照蛋白质溶液(4℃，浓度100μg/ml，溶于PBS)包被过夜。用每孔100μl含0.05％v/v Tween 20(PBST/0.05)的PBS通过自动ELISA平板洗涤器(Molecular Devices)洗涤平板5次，最后洗涤步骤之后每孔中剩余10μl残余洗涤缓冲液。通过与100μl含2％w/v BSA的PBST/0.05室温孵育2h封闭剩余结合位点。之后，再如上所述洗涤平板5次。
为在TLPC突变蛋白和固定蛋白质之间形成复合物，孔用10μl上文的细胞提取物室温孵育1小时。随后再洗涤平板5次并在每个孔中加入10μl抗T7单克隆抗体-HRP缀合物(Amersham)(1∶5000稀释于含0.5％w/v脱脂奶粉(Vitalia)的PBST/0.05中)并室温孵育1小时。再次洗涤平板5次并加入10μl荧光HRP底物QuantaBluTM(Pierce)，以通过结合的抗T7单克隆抗体-HRP缀合物检测结合的TPLC突变蛋白。室温45分钟之后于GENiosPlus平板读取器(Tecan)中在320nm(12.5nm)波长激发荧光并在430nm(17.5nm)处测量。
选择的183个TLPC突变蛋白与无关对照蛋白质(HSA)相比对指定靶蛋白(rhuVEGF165)表现明显更高的结合信号并随后进行二级高通量ELISA筛选实验。因此，将这些克隆从上述384孔标准平板中转移到LB/Amp琼脂上，并于37℃生长过夜。用来自这些琼脂板的单菌落接种圆底96孔板(Nunc)中的100μl 2x YT/Amp并在37℃、700转/分和60％rH条件下生长过夜。培养物1∶100稀释到圆底96孔板(Nunc)中的100μl 2xYT/Amp中并如上所述进行重组TLPC突变蛋白的生产和细菌裂解物的制备。
为检测TLPC突变蛋白的靶特异性，black Fluotrac 600 ELISA板(Greiner；384孔)的孔用20μl rhuVEGF165溶液(昆虫细胞，1μg/ml)在4℃包被过夜，或作为对照用大肠杆菌产生的rhuVEGF165(ReliaTechGmbH，1μg/ml)、昆虫细胞产生的重组小鼠VEGF(rmVEGF164)(ReliaTech GmbH，1μg/ml)、HSA、3％w/v脱脂奶粉和StrepTactin(IBA，10μg/ml)以及溶于PBS的RNA酶A和洋地黄毒苷的缀合物(Fluka，10μg/ml)在4℃包被过夜。
根据生产商的说明书通过使RNA酶A以两倍摩尔比与洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DIG-NHS；Roche)反应制备此缀合物。使用PBS作为工作缓冲液，根据生产商的说明书用HiTrap柱(Amersham)通过分子筛层析的方法从RNA酶A缀合物去除过量的反应物。
过夜孵育之后，如上所述洗涤平板并通过在上述条件下每孔加入100μl含2％w/v BSA的PBST/0.05封闭，然后再次洗涤平板。10μl上文提到的所选TLPC突变蛋白的封闭细菌裂解物转移到rhuVEGF165或对照蛋白质包被的每一个孔中并于环境温度孵育1h。如上所述用抗T7单克隆抗体-HRP缀合物和荧光HRP底物QuantaBluTM检测结合的TLPC突变蛋白。
rhuVEGF165(昆虫细胞)验证了选择的36个TLPC突变蛋白并另外对rhuVEGF165(大肠杆菌)和rmVEGF164(昆虫细胞)表现高信号，但是对无关对照蛋白质(HSA或奶粉)不显示结合。
选择与对照蛋白质相比对指定靶rhuVEGF165具有最高结合信号的TLPC突变蛋白进行序列分析。因此，用40μl来自384孔标准平板各个孔的甘油贮存物接种4ml LB/Amp并培养，以随后如该实施例开始所述分离质粒DNA。使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)，根据生产商的说明书用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO37作为引物在自动Genetic Analyzer system(Applied Biosystems)上阐明TLPC基因盒的DNA序列。
六个测序克隆中的六个独特序列携带功能性插入。具有最佳结合值的一个命名为S69.4 O13。将这个克隆的核苷酸序列翻译成氨基酸序列(序列表中的SEQ ID NO12)并且表1中给出了与分别由pTLPC8和野生型Tlpc编码的修饰TLPC不同的那些氨基酸。如实施例6所述，选择克隆S69.4 O13测定其与rhuVEGF165的结合亲和力。
表1抗rhuVEGF165 TLPC突变蛋白的序列特征


°此氨基酸替换来自随机化位置外的偶然突变。
实施例5TLPC突变蛋白的产生为制备型生产实施例4所述的突变蛋白S69.4 O13，根据Schlehuber，S.等人(J.Mol.Biol.(2000)，297，1105-1120)所述的方案使用大肠杆菌K12菌株JM83(带有编码此突变蛋白的表达载体pTLPC8(图8，SEQ ID NO24))在适当培养体积的LB-氨苄青霉素培养基中通过摇瓶表达进行周质生产。
当需要更大量的材料时，基于Schiweck，W.和Skerra，A.(Proteins(1995)23，561-565)所述的方案使用大肠杆菌K12菌株W3110(带有编码此突变蛋白的表达载体pTLPC8)通过在0.75L或10L的生物反应器中发酵培养进行周质生产。发酵在25℃进行。氧浓度保持在30％饱和。在0.75L生物反应器中，通过控制搅拌器的速度为1500转/分保持氧饱和在30％。在10L的生物反应器中，自动调节空气和纯氧气供应的同时保持搅拌器速度为480转/分。在补料分批培养阶段(OD＝22.5)，从17.5ml/h开始到50ml/h分步供应50％w/v的蔗糖。
根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和合适的设备用Strep-Tactin Superflow(IBA)以一步层析方案从周质级分中纯化突变蛋白。
根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和合适的设备用Superdex75材料(AmershamPharmacia Biotech)进行凝胶过滤。合并单体级分并用于进一步的表征步骤。
实施例6在ELISA中测量TLPC突变蛋白与VEGF的亲和力如下测量TLPC突变蛋白与VEGF的亲和力。简言之，在ELISA测定法中测试如实施例5所述得到的突变蛋白S69.4 O13的连续稀释物与rhuVEGF165和对照蛋白质BSA的结合。
为此目的，black Fluotrac 600微量滴定板(Greiner；384孔)的孔在4℃用1μg/ml的rhuVEGF165(昆虫细胞)和10μg/ml的BSA(Roth)O/N包被并用2％w/v的BSA(溶于PBST/0.1)封闭。洗涤步骤，随后用3％w/v奶粉(溶于PBST)的封闭步骤和另一个洗涤步骤之后，涵盖适当浓度范围的连续稀释的突变蛋白S69.4 O13(溶于PBST)在包被且封闭的孔中室温孵育1h。随后如上所述通过抗T7单克隆抗体-HRP缀合物和荧光HRP底物QuantaBluTM检测结合的突变蛋白。室温孵育适当时间之后，在GENiosPlus平板读取仪中于320nm(±12.5nm)的波长激发荧光并于430nm(±17.5nm)测量。
根据[p·L]＝([P]t[L]t)/(KD+[P]t)等式在计算机程序Kaleidagraph(Synergy软件)帮助下通过非线性最小二乘方回归来拟合曲线。在此，[P]t是固定靶的总浓度(以相对荧光单位表示)，[L]t分别是使用的TLPC突变蛋白的浓度，[P·L]是形成的复合物的浓度(以相对荧光单位表示，rFU)，KD是表观解离常数。
针对rhuVEGF165和BSA得到的结合曲线在图9中描述。鉴定为TLPC突变蛋白S69.4 O13和指定靶蛋白rhuVEGF165复合物的表观解离常数获得的数值为109±34nM(表2)。对照蛋白质BSA没有获得可测量的结合活性。
表2TLPC突变蛋白和VEGF165的亲和结合常数

*无可检测的结合活性实施例7噬菌粒呈递和用聚苯乙烯多孔板选择针对人hCD22胞外结构域的TLPC突变蛋白使用来自实施例1的噬菌粒文库选择TLPC突变蛋白。如实施例3所述选择TLPC突变蛋白。下面描述了方案的差别与靶蛋白孵育之前，在BSA封闭的聚苯乙烯孔中孵育来自文库的噬菌粒两次，每次15分钟来去除呈递多反应性或错误折叠的泪脂质运载蛋白的噬菌粒。hCD22(Peprotech EC LTD，UK)的胞外结构域以5μg/ml的浓度包被在聚苯乙烯板上。在第一个洗脱步骤中，吸附的噬菌粒用每个孔300μl的0.1M甘氨酸/HCl(pH 2.2)处理10分钟，然后加入适量的0.5M Tris立即中和每一个洗脱级分的pH。碱性洗脱步骤用每个孔300μl 70mM三乙胺进行，然后加入适量的1M Tris/HCl(pH 7.4)立即中和每一个洗脱级分的pH。作为最后的洗脱步骤，将300μl指数增长的XL1 blue(OD600大约为0.5)转到每一个孔中，并37℃孵育30分钟。如实施例3所述，从第二个富集循环开始只使用一半的组合噬菌粒溶液进行噬菌粒扩增。从用于淘选的噬菌粒、第八个洗涤级分和根据实施例3洗脱的噬菌粒进行每一轮选择之后，实施点滴定，以测定噬菌粒输入量和洗脱的噬菌粒数量。
使用来自各个前面富集循环的扩增噬菌粒制品进行针对hCD22的三个额外的选择循环，而从第二个富集循环开始只使用大约1×1011个噬菌粒。
实施例8使用高通量ELISA筛选法鉴定结合hCD22的TLPC突变蛋白为分析型生产带有C端T7检测标签(Novagen)以及Strep-tagII亲和标签的结合hCD22的TLPC突变蛋白和通过高通量ELISA筛选法描述其特征，将在两个BstXI切割位点之间含有TLPC的基因盒从载体pTLPC7(图4)亚克隆到载体pTLPC8(图8)中。如实施例4所述通过高通量ELISA筛选法鉴定结合hCD22的TLPC突变蛋白。也如实施例4所述，选择在初级筛选中特异结合hCD22的TLPC突变蛋白在二级高通量ELISA筛选实验中进行更详细的结合分析。
为检测TLPC突变蛋白的靶特异性，用20μl hCD22(5μg/ml，Peprotech)溶液在4℃包被black Fluotrac 600 ELISA平板(Greiner；384孔)过夜，或作为对照用hCD33-Fc(1μg/ml，R&D Research)、hIgG1(10μg/ml，Jackson ImmunoResearch)、streptactin(10μg/ml，IBA)、人血清白蛋白(HSA，10μg/ml，Sigma)以及带洋地黄毒苷的RNA酶A缀合物(10μg/ml；RNase from Fluka)在4℃包该平板被过夜。
所有检测的TLPC突变蛋白特异结合hCD22并且使用Big DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)根据生产商的推荐用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO37作为引物在自动Genetic Analyzer系统(Applied Biosystems)上确定其TLPC基因盒的核苷酸序列。所有测序克隆显示与S76.1 H10克隆相同的序列。将这个克隆(S76.1 H10)的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并且在表3中给出了与pTLPC(图8)编码的修饰TLPC不同的那些氨基酸。S76.1 H10克隆的核苷酸序列也以SEQ ID NO13给出。
表3所选hCD22突变蛋白抗体的序列特征


实施例9TLPC突变蛋白的产生为制备型生产实施例8得到的突变蛋白S76.1 H10，将两个BstXI切割位点之间的诱变编码区从载体pTLPC7(图4)亚克隆到表达质粒pTLPC8(图8)上。得到的质粒因此编码突变蛋白的融合蛋白，其在C端带有OmpA信号序列和T7标签以及Strep-tagII。
大肠杆菌JM83和大肠杆菌W3110的单菌落分别用编码TLPC突变蛋白S76.1 H10的质粒pTLPC8转化。如实施例5所述进行摇瓶表达、1L发酵、SA层析和分子筛层析。发现突变蛋白S76.1 H10从分子筛层析中(SEC)中以两个不同峰洗脱，其分别含有单体和二聚体蛋白质。两个蛋白质级分的结合亲和力都在ELISA中测定。
实施例10在ELISA中测量TLPC突变蛋白的亲和力在ELISA中测试如实施例9所述得到的突变蛋白S76.1 H10的连续稀释物与直接包被的hCD22和对照蛋白质hCD33-Pc、HSA和hIgG1的结合。
为此目的，用20μl hCD22(5μg/ml，Peprotech)或对照蛋白质hCD33-Fc(1μg/ml，R&D Research)、HSA(10μg/ml，Sigma)、hIgG1(10μg/ml，Jackson ImmunoResearch)O/N在4℃包被black Fluotrac 600ELISA平板(Greiner；384孔)的孔。
另一个洗涤步骤之后，在包被的hCD22和对照蛋白质hCD33-Fc、HSA和hIgG1中加入实施例9获得的连续稀释的突变蛋白S76.1H10(溶于PBST，涵盖适当的浓度范围)并室温孵育1h。随后根据各个生产商的推荐通过Streptactin-HRP缀合物(IBA)和荧光HRP底物QuantaBluTM(PIERCE)检测结合的突变蛋白。室温孵育适当时间之后，于GENiosPlus平板读取器中在320nm(12.5nm)的波长激发荧光并在430nm(17.5nm)测量。
如实施例6所述在计算机程序Kaleidagraph(Synergy软件)帮助下通过非线性最小二乘方回归来拟合曲线。
得到的曲线在图10和图11中描述。为TLPC突变蛋白和靶蛋白hCD22的复合物以及TLPC突变蛋白和对照蛋白质hCD33-Fc(R&D Systems)、人IgG1(Jackson ImmunoResearch)、人血清白蛋白(HSA，Sigma)的复合物的表观解离常数获得的数值概括于表4中。对照蛋白质没有获得可测量的结合活性。
表4TLPC突变蛋白的亲和结合常数

*没有可检测的结合活性实施例11噬菌粒呈递和使用聚苯乙烯多孔板选择针对人CD25的胞外结构域的TPLC突变蛋白用于从实施例1所述的噬菌粒文库中选择CD25特异性突变蛋白并随后在ELISA实验中表征这些突变蛋白的靶购自R&D系统(重组人IL-2 Rα/Fc嵌合体)。
进行5个选择循环以从实施例1所述的噬菌粒文库中选择CD25特异性TLPC突变蛋白，其中以5μg/ml的浓度将捕获mAb(小鼠抗人IgG，Fcγ片段特异性；Jackson ImmunoResearch)包被在聚苯乙烯板上。用2.5％w/v BSA(溶于PBS)封闭之后，以5μg/ml的浓度加入CD25-Fc，室温孵育1小时并用于富集CD25特异性噬菌粒。如实施例3所述在变性条件下用0.1M甘氨酸/HCl(pH 2.2)洗脱吸附的噬菌粒。
实施例12使用高通量ELISA筛选法鉴定结合CD25的TLPC突变蛋白为分析型生产带有C端T7检测标签(Novagen)以及C端Strep-tagII亲和标签的TLPC突变蛋白和通过高通量ELISA筛选法描述其特征，将两个BstXI切割位点之间的TLPC的基因盒从载体pTLPC7(SEQ ID NO1；图4)亚克隆到载体pTLPC8(SEQ ID NO24；图8)中。
为此目的，从大肠杆菌克隆混合物中分离质粒DNA，所述大肠杆菌克隆通过用来自实施例11的噬菌粒感染获得，所述噬菌粒作为最后选择循环的结果洗脱。根据实施例4所述的高通量ELISA方案进行CD25特异性突变蛋白的筛选。测试粗细胞提取物与特异性靶CD25(如实施例11所述固定于微量滴定板上)的结合。与之平行，测试粗细胞提取物与无关蛋白质HSA、人γ球蛋白(Jackson ImmunoResearch)和捕获mAb的结合，所述无关蛋白质分别以10μg/ml、10μg/ml、5μg/ml的浓度包被。在二级高通量ELISA测定法中验证具有特异结合特性的克隆。在此测定法中测试粗细胞提取物与初级筛选法中所用的相同蛋白质和其他无关蛋白质(BSA、CD154(重组人sCD40配体；Acris；目录号PA151XC)和奶粉(其分别以10μg/ml、5μg/ml和3％包被)的结合。
选择对特异性靶具有高信号并对无关蛋白质具有低信号的12个克隆并且使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，根据生产商的推荐用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO37作为引物，在自动Genetic Analyzer system(Applied Biosystems)上确定TLPC基因盒的核苷酸序列。发现一种突变蛋白在选择流程中富集。将这个克隆(S67.7 C6)的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并且在表5中给出了与pTLPC8(SEQ IDNO24)编码的修饰TLPC不同的那些氨基酸。克隆S67.7 C6的核苷酸序列也以SEQ ID NO20给出。
表5具有CD25特异性的所选TLPC突变蛋白的序列特征


实施例13TLPC突变蛋白的产生如实施例5所述，带有编码此突变蛋白的表达载体pTLPC8的大肠杆菌K12菌株W3110用于通过发酵培养的周质生产，以制备型生产实施例12所述的突变蛋白S67.7 C6。
根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和适当设备用Strep-actin Superflow材料(IBA)在一步层析方案中从周质级分纯化突变蛋白。
根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和适当设备用Superdex 75材料(Amersham Pharmacia Biotech)进行凝胶过滤。合并单体级分并用于其他表征步骤。
实施例14在ELISA中测量TLPC突变蛋白对CD25的亲和力在ELISA测定法中测试如实施例13所述获得的连续稀释的突变蛋白S67.7 C6与捕获CD25-Fc和对照蛋白质捕获mAb、HSA、FCS及捕获的人IgG Fc片段的结合。
为此目的，用5μg/ml浓度的捕获mAb(小鼠抗人IgG、Fcγ片段特异性；Jackson ImmunoResearch)室温或O/N 4℃包被black Fluotrac 600微量滴定板(Greiner；384孔)孔1h。洗涤步骤及随后用3％w/v奶粉(溶于PBST)的封闭步骤之后加入5μg/ml浓度的CD25-Fc并室温孵育1小时。与之平行，无关蛋白质捕获mAb、HSA和FCS(Petal Calf Serum；Invitrogen)分别以5μg/ml、10μg/ml、10μg/ml的浓度包被。此外，通过以5μg/ml包被的捕获mAb，以5μg/ml的浓度捕获人IgG Fc片段(Accurate Chemical)。
另一个洗涤步骤之后，在捕获CD25和对照蛋白质捕获mAb、HSA、FCS及捕获的人IgG Fc片段中加入连续稀释的突变蛋白S67.7 C6(溶于PBST，涵盖适当的浓度范围)并室温孵育1h。随后根据各个生产商的推荐通过Streptactin-HRP缀合物(IBA)和荧光HRP底物QuantaBluTM(PIERCE)检测结合的突变蛋白。室温孵育适当时间之后，于GENiosPlus平板读取器中在320nm(12.5nm)的波长激发荧光并在430nm(17.5nm)测量。
如实施例6所述，在计算机程序Kaleidagraph(Synergy软件)帮助下通过非线性最小二乘方回归来拟合曲线。
得到的针对捕获CD25-Fc和捕获mAb的结合曲线在图12中描述。为TLPC突变蛋白S67.7 C6和指定靶蛋白CD25-Fc的复合物的表观解离常数获得的数值概括于表6中。没有获得与对照蛋白质捕获mAb、HSA、FCS和捕获的人IgG Fc片段可测量的结合活性。
表6TLPC突变蛋白和CD25-Fc的亲和结合常数

实施例15表达人CD25的CHO细胞系的产生用编码人CD25(NCBI ACCESSION NM_000417[gi4557666])的表达载体CD25-pcDNA3.1Zeo(+)(SEQ ID NO10；图13)转染CHO-K1细胞(DSMZ，No.ACC 110)，以产生表达人CD25的稳定细胞系。
如下所述获得表达载体CD25-pcDNA3.1Zeo(+)。用正向引物SEQ IDNO35和反向引物SEQ ID NO36通过PCR从人外周血淋巴细胞的cDNA扩增人CD25的完整编码序列。根据生产商的推荐，将编码全长蛋白质(包括信号肽)的PCR产物连接到克隆载体pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中。通过XhoI/HindIII限制性酶切消化从得到的载体中切下CD25 cDNA并如Sambrook等人(上文)所述通过琼脂糖凝胶电泳分离。纯化此片段(Wizard SV Clean Up Kit，Promega)并连接到表达载体pcDNA3.1Zeo(+)(Invitrogen)中，所述表达载体已用相同的限制性内切酶线性化。用得到的表达载体(CD25-pcDNA3.1Zeo(+))转化大肠杆菌XL1-Blue并用EndoFree Plasmid Maxi Kit(Qiagen)提取和纯化DNA。
将37℃生长于DMEM Glutamax I培养基(Gibco)(含10％(v/v)FCS和5％CO2)中的400.000 CHO-K1细胞(DSMZ，No.ACC110)涂于3.5cm平板上并于次日根据生产商的推荐用4μg质粒DNA和10μlLipofectarnine2000(Invitrogen)转染。细胞用CD25-pcDNA3.1Zeo(+)转染或用pcDNA3.1Zeo(+)转染作为对照。一天后胰酶消化细胞并转移到5个9.5cm平板中。次日，每毫升培养基中加入200μg Zeocin开始筛选。一周后，将抗Zeocin克隆转移到24孔板中并随后在T25培养瓶(Greiner)中培养。如实施例16所述通过FACS分析若干克隆的CD25表达。保留表现最高表达的克隆，冷冻贮存物并且用这些细胞系进行其他测定直到第30代。
实施例16测试TLPC突变蛋白与表达人CD25的CHO细胞系的特异结合在流式细胞仪测定法中测试突变蛋白S67.7 C6与表达人CD25的CHO细胞系的特异结合。为此目的，用0.2％w/v EDTA从培养瓶中拆分如实施例15所述用CD25-pcDNA3.1Zeo(+)-或pcDNA3.1Zeo(+)-转染的CHO细胞。将大约200,000个细胞重悬于30μl PBS/2％v/v FCS中并用10μg如实施例13所述获得的S67.7 C6孵育并且基于Schlehuber和Skerra(Biol.Chem.(2001)382，1335-1342)中所述的方案用萤光素(萤光素-5(6)-羰基氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯；Fluka)以等摩尔比标记。作为阴性对照，使用10μg pTLPC8编码并用萤光素以等摩尔比标记的重组野生型TLPC。使用FITC标记的IgG1(Acris，SM10F)作为同种型对照，用FITC标记的抗CD25 mAb(Acris，DM519F)确认CD25的表达。冰上孵育30min之后，通过使用FACSCalibur(Becton Dickinson)进行流式细胞术分析之前用PBS/2％v/v FCS洗涤细胞两次。
CD25特异性突变蛋白S67.7C6和CD25特异性mAb都表现表达人CD25的CHO细胞系的显著染色，而没有出现假转染CHO细胞系的显著染色。对照野生型TLPC和IgG1没有表现与两个所测试细胞系的显著结合。得到的直方图在图14中描述。
实施例17产生用于CD25特异性TLPC突变蛋白的亲和力成熟易错PCR文库使用实施例12所述的CD25特异性突变蛋白S67.7-C06进行亲和力成熟过程。因此通过使用易错PCR方案，基于突变蛋白S67.7-C06制备第二代文库。根据文献(Zaccolo等人(1996)J.Mol.Biol.255，589-603)所述的方法，使用核苷类似物8-oxodGTP和dPTP(TEBU-Bio)制备这个已印上CD25结合信息的文库。为进行易错扩增反应，与核苷类似物一起使用5’生物素化的寡核苷酸SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。因为这些寡脱氧核苷酸位于BstXI限制酶切位点两侧，扩增造成随机分布于BstXI基因盒的点突变，所述基因盒包含TLPC突变蛋白结构基因的大部分。使用WizardSV Gel和PCR Clean-Up System(Promega)纯化PCR产物，并且为克隆目的，首先根据生产商的说明书用限制性内切酶BstXI(Promega)切割这个代表核酸形式TPLC突变蛋白亲和力成熟文库的片段，然后如上所述纯化，得到大小为303个核苷酸大小的双链DNA片段。如实施例1所述，用链霉抗生物素包被的顺磁小珠(Merck)通过其5’生物素标签去除未消化或未完全消化的DNA片段。
为随后连接上文的亲和力成熟的突变蛋白，制备3907片段并如实施例1所述从载体pTLPC7(图4)的DNA中纯化。为连接反应，在4200μl(50mM Tris/HCl pH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，50μg/ml BSA)的总体积中，在存在420 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)的条件下于16℃孵育3.32μg(15pmol)PCR片段和38.7μg(15pmol)载体片段48h。然后加入105μl酵母tRNA(10mg/ml水溶液(Roche))、4200μl 5M乙酸胺和16.8ml乙醇沉淀连接混合物中的DNA。其他操作根据实施例1进行并且最后将DNA在210μl水中溶解成终浓度200μg/ml。
根据实施例1进行电感受态大肠杆菌XL1-Blue(Bullock等人，上文)的制备和转化。使用总计42μg连接的DNA在21次电穿孔中得到大约2.6×109个转化体。根据PCT申请WO 03/029471的实施例7进一步使用转化体制备噬菌粒。
实施例18噬菌粒呈递和用聚苯乙烯多孔板选择亲和力提高的CD25特异性TPLC突变蛋白根据实施例3所述的通用方法用2种不同策略(分别为选择策略A和B)进行3个循环的选择来从实施例17所述的易错PCR文库中选择亲和力提高的CD25特异性TLPC突变蛋白。与方案的差别在下文描述。与靶蛋白孵育之前，来自文库的噬菌粒在BSA封闭的聚苯乙烯孔中孵育两次(每次15分钟)以排除呈递多反应性和错误折叠的脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒。
以5μg/ml的浓度将捕获mAb(小鼠抗人IgG，Fcγ片段特异性；JacksonImmunoResearch)包被在聚苯乙烯平板上。用2.5％w/v BSA(溶于PBS)封闭之后，加入0.063μg/ml(选择策略A)或0.016μg/ml(选择策略B)的CD25-Fc并室温孵育1小时。在变性条件下并通过使用实施例7所述的细菌菌株XL1 blue竞争洗脱吸附的噬菌粒。在第一个、第二个和第三个选择循环中使用大约2×1011、1×1011和1×1010个噬菌粒作为富集过程的输入量；并且分别进行8、10和12个洗涤循环。如实施例3所述进行噬菌粒扩增而其中在22℃而不是26℃孵育噬菌粒。
实施例19使用菌落筛选法鉴定亲和力提高的CD25特异性TLPC突变蛋白为分析型生产作为Strep-tagII以及白蛋白结合结构域(ABD)的融合蛋白的TLPC突变蛋白和通过菌落筛选描述其特征，将两个BstXI切割位点之间的基因盒从噬菌粒载体pTLPC7(SEQ ID NO1；图4)亚克隆到pTLPC9(SEQ ID NO22；图15)中。
为此目的，从大肠杆菌克隆的混合物中分离质粒DNA，所述大肠杆菌克隆通过用来自实施例18的选择策略B的噬菌粒感染获得，所述噬菌粒作为最后选择循环的结果洗脱。将基因盒亚克隆到筛选载体pTLPC9中并转化大肠杆菌K12TGI-F-细胞之后基于Schlehuber，S.等人(上文)所述的方案通过过滤夹层菌落筛选法进行亲和力提高的CD25特异性突变蛋白的筛选。
将从384孔微量滴定板中O/N培养物获得的单个克隆收集物一式两份以相同的方式通过384pin head(Genetix)到6张亲水PVDF膜上(铺于LB/Amp琼脂平板上)。37℃生长4小时之后，22℃再孵育2小时，将亲水膜放于HSA包被的疏水膜上，疏水膜依次放于含200μg/l的aTc的LB/Amp琼脂板上。在22℃孵育叠放两种膜O/N的培养板。在这个阶段，各个TLPC突变蛋白从上层膜上的菌落释放并通过其白蛋白结合结构域固定于下层膜上的HSA上。
为鉴定亲和力提高的CD25特异性突变蛋白，与5个不同浓度的CD25-Fc(10nM、3nM、1nM、0.3nM和0.1nM)平行筛选疏水膜。根据各个生产商的推荐，通过抗人IgG-Fc-HRP缀合物(过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性；Jackson ImmunoResearch)和过氧化物酶产色DAB底物试剂盒(Vector Laboratories)检测突变蛋白/CD25-Fc复合物。与之平行，根据各个生产商的推荐，通过Streptactin-HRP缀合物(IBA)和DAB底物试剂盒监测突变蛋白表达。
选择来自选择策略B的对最低浓度CD25-Fc具有最高信号的总共9个克隆并且使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)根据生产商的说明书用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO37作为引物在自动Genetic Analyzer system(Applied Biosystems)上确定各个TLPC基因盒的核苷酸序列。鉴定出8个含功能性插入的独特突变蛋白。从这9个克隆中选择1个克隆进行进一步的表征。将这个克隆(F92.8 M1.2 E15)的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并且在表7中给出了与pTLPC9(SEQ IDNO22)编码的修饰TLPC不同的那些氨基酸。克隆F92.8M1.2 E15的核苷酸序列也以SEQ ID NO21给出。
表7所选具有提高的CD25亲和力的TLPC突变蛋白的序列特征

如表7所见，CD25突变蛋白F92.8 M1.2 E15与野生型Tlpc相比在构架位置23、50和51带有氨基酸突变。
实施例20通过菌落筛选法选择的亲和力提高TLPC突变蛋白的产生为制备生产如实施例19所述的突变蛋白F92.8 M1.2 E15，用带有编码此突变蛋白的表达载体pTLPC9的大肠杆菌K12菌株W3110如实施例5所述通过发酵培养进行周质生产。
HSA根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和适当设备用Strep-TactinSupcrflow材料(IBA)在一步层析法中从周质级分纯化突变蛋白。
HSA根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和适当设备用Superdex 75材料(AmershamPharmacia Biotech)进行凝胶过滤。发现突变蛋白F92.8 M1.2 E15从分子筛柱子上的两个峰中洗脱，其分别含单体和二聚体蛋白质。合并单体和二聚体级分并用于其他表征步骤。
实施例21用ELISA测量亲和力提高的TLPC突变蛋白对CD25的亲和力在ELISA测定法中检测如实施例20所述获得的连续稀释的突变蛋白F92.8 M1.2 E15单体和二聚体级分与捕获的CD25-Fc和对照蛋白质捕获mAb、HSA、FCS及捕获的人IgG Fc片段的结合。
如实施例14所述进行测定，而其中使用2.5μg/ml的CD25-Fc和2.5μg/ml的人IgG Fc片段进行捕获。
对捕获的CD25-Fc和捕获mAb得到的结合曲线分别在图16和图17中描述。为TLPC突变蛋白F92.8M1.2 E15单体或二聚体和指定靶蛋白CD25-Fc复合物的表观解离常数获得的数值概括于表8中。对照蛋白质捕获mAb、HSA、FCS和捕获的人IgG Fc片段没有获得可测量的结合活性。
表8亲和力提高的TLPC突变蛋白和CD25-Fc间的亲和结合常数


实施例22表达人CD154的CHO细胞系的产生为产生表达人CD154的稳定细胞系，用编码人CD154(NCBIACCESSIONBC_074950[gi49902361])的表达载体CD154-pcDNA3.1Zeo(+)(SEQ ID NO11；图18)转化CHO-K1细胞(DSMZ，No.ACC 110)。
如下所述获得表达载体CD154pcDNA3.lZeo(+)。我们从亚克隆CD54的pLXSN载体(BD Biosciences Clontech)获得了编码人CD154(NCBIACCESSIONBC_074950[gi49902361])的DNA。通过使用寡核苷酸SEQ ID NO38和SEQ ID NO39测序质粒，确认了完整cDNA的正确序列。通过用XhoI/Apal限制性酶切消化，从载体中切出编码人CD154完整序列的DNA片段，并如Sambrook等人(上文)所述通过琼脂糖凝胶电泳分离。纯化片段(Wizard SV Clean Up Kit，Promega)并连接到表达载体pcDNA3.1Zeo(+)(Invitrogen)中，所述表达载体已用相同的限制性内切酶线性化。用得到的表达载体CD154-pcDNA3.1Zeo(+)转化XL1-Blue细菌并用EndoPree Plasmid Maxi Kit(Qiagen)提取和纯化DNA。
基于实施例15所述的方案进行CHO-K1细胞(DSMZ，No.ACC 110)的生长和用表达载体CD154-pcDNA3.1Zeo(+)转染。如实施例23所述通过FACS分析法分析若干克隆的CD154表达。表现最高表达的克隆用于所有其他测定直到第30代。
实施例23测试亲和力提高的TLPC突变蛋白与表达人CD25的CHO细胞系的特异结合在流式细胞术测定法中测试突变蛋白F92.8M1.2E15与表达人CD25的CHO细胞系的特异结合。为此目的，用0.2％w/v EDTA将如实施例15和22所述的用CD25-pcDNA3.1Zeo(+)和CD154-pcDNA3.1Zeo(+)转染的CHO细胞分别从培养瓶中分离(detach)。将大约200,000个细胞重悬于30μl PBS/2％v/v FCS中并用如实施例20所述得到的2.5μg单体F92.8M1.2 E15级分孵育并且基于Schlehuber和Skerra(上文)所述的方案用萤光素(萤光素-5(6)-羰基氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯；Fluka)以两倍摩尔比标记。作为阴性对照，使用2.5μg pTLPC8编码并用萤光素以两倍摩尔比标记的重组野生型TLPC。用FITC标记的抗CD25 mAb(Acris，DM519F)确认CD25的表达，使用FITC标记的IgG1(Acris，SM10F)作为同种型对照。冰上孵育30分钟后，在使用FACSCalibur(Becton Dickinson)通过流式细胞术分析前，用PBS/2％v/v FCS洗涤细胞两次。
亲和力提高的CD25特异性突变蛋白F92.8 M1.2 E15和CD25特异性mAb都表现表达人CD25的CHO细胞系的显著染色，而没有发生表达人CD154的CHO细胞系的显著染色。对照野生型TLPC和IgG1没有表现与两种所测试细胞系的显著结合。获得的直方图描述在图19中。
实施例24通过高通量ELISA筛选法鉴定亲和力提高的结合CD25的TLPC突变蛋白为分析型生产带有C端T7检测标签(Novagen)以及C端Strep-tagII亲和标签的亲和力提高的TLPC突变蛋白并通过高通量ELISA筛选描述其特征，将两个BstXI切割位点间的基因盒从载体pTLPC7(图4)亚克隆到pTLPC8(图8)中。
为此目的，从用实施例18的噬菌粒(作为最后选择循环的结果洗脱)转染得到的大肠杆菌克隆混合物中分离质粒DNA。根据实施例4所述的高通量ELISA方案进行亲和力提高的CD25特异性突变蛋白的筛选。测试粗细胞提取物与不同浓度(分别为5μg/ml、1μg/ml、0.2μg/ml、0.04μg/ml和0.008μg/ml)捕获的CD25-Fc的结合。与此平行，通过以5μg/ml包被的捕获mAb测试粗细胞提取物与5μg/ml浓度捕获的人IgG Fc片段(Accute Chemical)的结合。在二级高通量ELISA中确认表现特异结合特征并在最低靶浓度保持高信号的克隆。在此测定中，测试粗细胞提取物与1μg/ml和0.1μg/ml捕获的CD25-Fc的结合。此外，测试粗细胞提取物与无关蛋白捕获mAb、HSA、CD154和人γ球蛋白(JacksonImmunoResearch)(分别以5μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、10μg/ml包被)的结合。
从两个选择策略中选择对最低浓度捕获的CD25-Fc产生高信号且在无关蛋白质上产生低信号的总计13个克隆，并使用Big Dye TerminatorCycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)根据生产商的说明书在自动基因分析仪系统(Applied Biosystems)上用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO37作为引物确定各个TLPC基因盒的核苷酸序列。鉴定了7个含功能性插入的独特突变蛋白。从这些突变蛋白中选择3个克隆进一步表征。将来自选择策略A的这些克隆S99.3 H24和S99.3 C13与从选择策略B获得的S99.4 F15的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并且在表9中给出与pTLPC8(SEQ IDNO24)编码的修饰的TLPC有差别的那些氨基酸。克隆S99.3 H24、S99.3C13和S99.4 F15的核苷酸序列也分别以SEQ ID NO17、SEQ ID NO18和SEQ ID NO19给出。
表9与CD25具有提高亲和力的所选TLPC突变蛋白的序列特征


如可从表9中见到的，亲和力成熟鉴定的TLPC突变蛋白不仅在β桶结构的闭合末端的结合位点中含有突变，也在形成天然脂质运载蛋白结合口袋的肽片段(这里指AB肽环的残基28、32)和构架区域位的位置(分别是Tlpc序列的位置67和86)中含有突变。
实施例25高通量ELISA筛选法所选的亲和力提高TLPC突变蛋白的生产为制备型生产实施例24所述的突变蛋白S99.3 H24、S99.3 C13和S99.4F15，如实施例5所述通过发酵培养用带有编码这些突变蛋白的表达载体pTLPC8的大肠杆菌K12菌株W3110进行周质生产。
根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和适当设备用Strep-TactinSupcrflow材料(IBA)在一步层析法中从周质级分纯化突变蛋白。
HSA根据生产商的推荐，使用适当柱床体积的柱子和适当设备用Superdex 75材料(AmershamPharmacia Biotech)进行凝胶过滤。合并单体级分并用于进一步表征步骤实施例26用ELISA测量亲和力提高的TLPC突变蛋白与CD25的亲和力在ELISA测定法中测试如实施例25所述获得的连续稀释的突变蛋白S99.3 H24、S99.3 C13和S99.4 F15与捕获的CD25-Fc和对照蛋白质捕获mAb、HSA、FCS及捕获的人IgG Fc片段的结合。
如实施例14所述进行测定，而其中使用2.5μg/ml CD25-Fc和2.5μg/ml人IgG Fc片段进行捕获。
对捕获的CD25-Fc和捕获mAb得到的结合曲线分别在图20中描述。为TLPC突变蛋白S99.3 H24、S99.3 C13和S99.4 F15和指定靶蛋白CD25-Fc复合物的表观解离常数获得的数值概括于表10中。对照蛋白质捕获mAb、HSA、FCS和捕获的人IgG Fc片段没有获得可测量的结合活性。
表10亲和力提高的TLPC突变蛋白和CD25-Fc的亲和结合常数

实施例27噬菌粒呈递和使用聚苯乙烯多孔板和A蛋白磁珠选择针对人CD33-Fc胞外结构域的TPLC突变蛋白为筛选TLPC突变蛋白，如实施例2所述使用噬菌粒文库。如实施例3所述使用聚苯乙烯多孔板选择TLPC突变蛋白。与方案的差别在实施例7中描述。以1μg/ml的浓度将靶hCD33-Fc(R&D Research)直接包被在聚苯乙烯板上。
用A蛋白磁珠(Dynabeads Protein A，Dynal)进行基本按照生产商的说明书选择TLPC突变蛋白。选择BSA作为噬菌粒和靶的封闭剂。在酸性(0.1M甘氨酸/HCl pH2.2；室温10分钟；用0.5M Tris碱中和)和/或碱性(70mM三乙胺；室温10分钟；用1M Tris/HCI，pH 7.4中和)条件下洗脱噬菌粒，然后是如实施例7所述的最终细菌洗脱步骤。
与方案的差别在实施例7中描述，而在与靶蛋白噬菌粒孵育之前，来自文库的噬菌粒与100μl BSA封闭的A蛋白磁珠孵育2次(每次15分钟)以排除呈递多反应性或错误折叠脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒。
以这种方式进行四轮针对hCD33-Fc的选择，其中使用来自前面各个富集循环的扩增噬菌粒制品，而从第二个循环开始只使用大约1×1011个噬菌粒。
实施例28使用高通量ELISA筛选法鉴定结合hCD33的TLPC突变蛋白为分析型生产带有N端T7检测标签(Novagen)以及C端Strep-tagII亲和标签的结合hCD33的TLPC突变蛋白并通过高通量ELISA筛选描述其特征，将两个BstXI切割位点间的基因盒从载体pTLPC12(图7)亚克隆到pTLPC14(图21)中。如实施例4所述，通过高通量ELISA筛选法鉴定结合hCD33的TLPC突变蛋白。如同一个实施例所述，选择在初步筛选中特异结合hCD33的TLPC突变蛋白在二级高通量ELISA筛选实验中进行更详细的结合分析。
为检测TLPC突变蛋白的靶特异性，用20μl AffiniPure小鼠抗人IgGFcγ片段特异性抗体(5μg/ml，JacksonImmonoResearch)溶液在4℃包被black Fluotrac 600 ELISA板(Greiner；384孔)的孔过夜，并且作为对照用hCD22(5μg/ml，JacksonImmonoResearch)、hIgG1(10μg/ml，JacksonImmonoResearch)和streptactin(10μg/ml，EBA)、人血清白蛋白(10μg/ml，Sígma)以及RNA酶A和洋地黄毒苷的缀合物(10μg/ml；RNA酶来自Fluka)在4℃包被过夜。通过抗人IgG Fcγ片段特异性抗体于室温捕获靶hCD33-Fc1小时。
多个TLPC突变蛋白表现特异结合hCD33-Fc并且使用Big DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)根据生产商的说明书在自动基因分析仪系统上(Applied Biosystems)用寡脱氧核苷酸SEQ IDNO37作为引物从若干克隆中确定TLPC基因盒的核苷酸序列。
聚苯乙烯多孔板淘选揭示的克隆的测序揭示了4种不同的脂质运载蛋白突变蛋白。进一步分析了其中的两个。将这些克隆的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并且与在表11中给出TLPC14(图21)编码的修饰TLPC有差别的那些氨基酸。这些脂质运载蛋白突变蛋白(即S 101.2 O08和S101.2A20)的核苷酸序列分别以SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 15给出。
选自A蛋白磁珠淘选的克隆的测序揭示两种不同的脂质运载蛋白突变蛋白。将选择用于进一步分析的克隆S100.1-I08的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并且在表11中给出与TLPC14(图21)编码的修饰TLPC有差别的那些氨基酸。核苷酸序列也以SEQ ID NO25给出。
表11所选hCD33-Fc突变蛋白抗体的序列特征


°这些氨基酸替换来自随机化位置外的偶然突变。
+2、+4描述了实施例2所述的TLPC文库的环1中两个或四个氨基酸插入。
实施例29TLPC突变蛋白的产生为制备产生实施例28得到的抗hCD33突变蛋白S100.1 I08、S101.2A20和S101.2 O08，将两个BstXI切割位点间的诱变编码区从载体pTLPC12(图7)克隆到表达质粒pTLPC14(图21)上。得到的质粒因此编码突变蛋白与OmpA信号序列和N端T7标签以及C端Strep-tagII的融合蛋白。
分别用编码TLPC突变蛋白S100.1 I08、S101.2 A20或S101.2 O08的pTLPC14质粒转化大肠杆菌W3110(发酵)或大肠杆菌JM83(摇瓶表达)的单菌落。如实施例5所述进行摇瓶表达、1L发酵、SA层析和大小排阻层析(SEC)。SEC揭示了克隆S100.1-I08和S101.2 O08的二聚体和单体蛋白质级分。在ELISA中单独测定单体和二聚体级分的结合亲和力。
实施例30用ELISA测量TLPC突变蛋白的亲和力为在ELISA中测定实施例28的所选TLPC突变蛋白与规定蛋白靶hCD33-Fc以及无关对照蛋白质的亲和力，用20μl hCD33-Fc(1μg/ml)、AffiniPure小鼠抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(5μg/ml，JacksonImmunoResearch)在4℃包被black Fluotrac 600 ELISA平板(Greiner；384孔)的孔，并且作为对照用IgG1(10μg/ml，Jackson ImmunoResearch)O/N在4℃包被。通过AffiniPure小鼠抗人IgG Fcγ片段特异性抗体室温捕获靶hCD33-Fc(1μg/ml，R&D Research)和hCD22-Fc(1μg/ml，Peprtoech)1小时。之后如实施例10所述，用实施例29的TLPC突变蛋白进行ELISA。
如实施例10所述拟合得到的结合曲线并描述在图22-24中。为TLPC突变蛋白与靶蛋白hCD33-Fc的复合物以及TLPC突变蛋白与对照蛋白质hCD22-Fc(R&D Systems)和HSA(Sigma的)复合物的表观解离常数获得的数值概括于表12中。
表12TLPC突变蛋白的亲和结合常数

*没有可检测结合活性；ND＝未测定实施例31在BIAcore中测量TLPC突变蛋白的亲和性根据生产商的推荐，将14000个反应单位(RU)的AffiniPure小鼠抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)与同CM5传感器芯片(Biacore)偶联的胺偶联。通过以2μl/min的流速注入10μl 0.2mg/ml的hCD33-Fc溶液将3000个RU的hCD33-Fc(R&D research)捕获到这个表面上。使用HBS(10mM HEPES、150mM NaCl、2mM EDTA、0.005％v/v Tween pH7.4)作为工作缓冲液。所有样品在这个工作缓冲液中稀释。通过以20μl/min的流速注入40μl样品，在hCD33-Fc捕获的表面加入实施例29获得的TLPC突变蛋白。加入的TLPC突变蛋白的溶液分别为10μM的S101.2 A20和6.4μM的S101.2 O08。芯片表面用10mM HCl再生，然后在测量下一个脂质运载蛋白突变蛋白前再次偶联hCD33-Fc。所有测量在BIAcore X仪器上进行。为测定S100.1 I08的结合亲和力，在如上所述的表面上捕获2000RU的hCD33-Fc并加入5μM浓度的脂质运载蛋白突变蛋白溶液。用Biacore的BIAevaluation软件3.1拟合获得的结合曲线，并在图25-27中显示。得到的TLPC突变蛋白的亲和力结合常数概括于表13中。
表13TLPC突变蛋白的亲和力常数

序列表<110>皮里斯蛋白实验公司<120>泪脂质运载蛋白突变蛋白<150>PCT/EP03/09404<151>2003-08-25<160>39<210>1<211>1123<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_肽<222>(22)...(84)<220>
<221>mat肽<222>(85)...(1113)<223>修饰的TLPC与噬菌体外壳蛋白pIII的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(540)<223>成熟TLPC<220>
<221>misc_feature<222>(541)...(543)<223>琥珀终止密码子<220>
<221>CDS<222>(544)...(1113)<223>外壳蛋白pIII的217-406氨基酸<400>1tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcc cag gcc gat gga90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Gly-10 -5 -1 1gga gag gag att cag gat gtg tca ggg acg tgg tat ctg aag gcg135Gly Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala5 10 15atg acg gtg gac agg gag ttc cct gag atg aat ctg gaa tcg gtg180Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val20 25 30
aca ccc atg acc ctc acg acc ctg gaa ggg ggc aac ctg gaa gcc225Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala35 40 45aag gtc acc atg ctg ata agt ggc cgg tgc cag gag gtg aag gcc270Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Ala50 55 60gtc ctg gag aaa act gac gag ccg gga aaa tac acg gcc gac ggg315Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly65 70 75ggc aag cac gtg gca tac atc atc agg tcg cac gtg aag gac cac360Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His80 85 90tac atc ttt tac tct gag ggc cag ctc cat ggg aag ccg gtc cga405Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Gln Leu His Gly Lys Pro Val Arg95 100 105ggg gtg aag ctc gtg ggc aga gac ccc aag aac aac ctg gaa gcc450Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala110 115 120ttg gag gac ttt gag aaa gcc gca gga gcc cgc gga ctc agc acg495Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr125 130 135gag agc atc ctc atc ccc agg cag agc gaa acc tgc tct cca ggg540Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly140 145 150tag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc tct gag585Xaa Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu155 160 165ggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct gag ggt ggc ggc tct gag630Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu170 175 180gga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt tcc ggt gat ttt gat tat675Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr185 190 195gaa aag atg gca aac gct aat aag ggg gct atg acc gaa aat gcc720Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala200 205 210gat gaa aac gcg cta cag tct gac gct aaa ggc aaa ctt gat tct765Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser215 220 225gtc gct act gat tac ggt gct gct atc gat ggt ttc att ggt gac810Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp230 235 240gtt tcc ggc ctt gct aat ggt aat ggt gct act ggt gat ttt gct855Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala245 250 255
ggc tct aat tcc caa atg gct caa gtc ggt gac ggt gat aat tca900GlV Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser260 265 270cct tta atg aat aat ttc cgt caa tat tta cct tcc ctc cct caa945Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln275 280 285tcg gtt gaa tgt cgc cct ttt gtc ttt ggc gct ggt aaa cca tat990Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr290 295 300gaa ttt tct att gat tgt gac aaa ata aac tta ttc cgt ggt gtc1035Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val305 310 315ttt gcg ttt ctt tta tat gtt gcc acc ttt atg tat gta ttt tct1080Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser320 325 330acg ttt gct aac ata ctg cgt aat aag gag tct taataagctt 1123Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser335 340<210>2<211>535<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_肽<222>(22)...(84)<220>
<221>mat_肽<222>(85)...(570)<223>TLPC与a Strep-tag II亲和标签的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(540)<223>成熟TLPC<220>
<221>CDS<222>(541)...(570)<223>Strep-tag II亲和标签<400>2tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcc cag gcc gat gga90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Gly-10 -5 -1 1
atg acg gtg gac agg gag ttc cct gag atg aat ctg gaa tcg gtg135Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val5 10 15aca ccc atg acc ctc acg acc ctg gaa ggg ggc aac ctg gaa gcc180Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala20 25 30aag gtc acc atg ctg ata agt ggc cgg tgc cag gag gtg aag gcc225Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Ala35 40 45gtc ctg gag aaa act gac gag ccg gga aaa tac acg gcc gac ggg270Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly50 55 60ggc aag cac gtg gca tac atc atc agg tcg cac gtg aag gac cac315Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His65 70 75tac atc ttt tac tct gag ggc cag ctc cat ggg aag ccg gtc cga360Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Gln Leu His Gly Lys Pro Val Arg80 85 90ggg gtg aag cte gtg ggc aga gac ccc aag aac aac ctg gaa gcc405Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala95 100 105ttg gag gac ttt gag aaa gcc gca gga gcc cgc gga ctc agc acg450Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr110 115 120gag agc atc ctc atc ccc agg cag agc gaa acc tgc tct cca ggg495Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly140 145 150agc gct tgg tct cac ccg cag ttc gaa aaa taataagctt 535Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys155 160<210>3<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(21)...(38)<223>na，g，c or t；kg or t<220>
<223>引物<400>3gtagcccagg ccgatggagg nnknnknnkn nknnknnkgt cagggacgtg 50gtatc 55
<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(19)...(21)<223>na，g，c or t；ma or c<220>
<221>misc_feature<222>(25)...(27)<223>na，g，c or t；ma or c<220>
<221>misc_feature<222>(31)...(33)<223>na，g，c or t；ma or c<220>
<223>引物<400>4gaccttggct tccaggttmn ncccmnncag mnncgtgagg gtcatgggtg 50<210>5<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(20)...(22)<223>na，g，c or t；kg or t<220>
<221>misc_feature<222>(26)...(28)<223>na，g，c or t；kg or t<220>
<221>misc_feature<222>(32)...(37)<223>na，g，c or t；kg or t<220>
<223>引物<400>5ggtgaaggcc gtcctggagn nkactnnkga gnnknnkaaa tacacggccg 50acgg54
<210>6<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(22)...(24)<223>na，g，c or t；ma or c<220>
<221>misc_feature<222>(31)...(33)<223>na，g，c or t；ma or c<220>
<221>misc_feature<222>(37)...(39)<223>na，g，c or t；ma or c<220>
<221>misc_feature<222>(43)...(45)<223>na，g，c or t ；ma or c<220>
<223>引物<400>6ctggccctca gagtaaaaga tmnngtggtc mnncacmnnc gamnngatga 50tgtatgccac gtgc 64<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gtttcgctac cgtagcccag gccggtgg 28<210>8<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gaccggcttc ccatggagct ggccctcaga gtaaaag37
<210>9<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9ccaggacggc cttcaectcc tggcaccggc cactgatcag catcgtgacc 50ttggcttcca ggt 63<210>10<211>862<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(541)...(543)<223>琥珀终止密码子<220>
<223>CD25 cDNA<400>10tctagataacg agggcaaaaa atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ilegca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcc cag gcc gat gga 90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Glygga gag gag att cag gat gtg tca ggg acg tgg tat ctg aag gcg 135Gly Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Alaatg acg gtg gac agg gag ttc cct gag atg aat ctg gaa tcg gtg 180Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Valaca ccc atg acc ctc acg acc ctg gaa ggg ggc aac ctg gaa gcc 225Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Alaaag gtc aec atg ctg ata agt ggc cgg tgc cag gag gtg aag gcc 270Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Alagtc ctg gag aaa act gac gag ccg gga aaa tac acg gcc gac ggg 315Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Glyggc aag cac gtg gca tac atc atc agg tcg cac gtg aag gac cac 360Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
tac atc ttt tac tct gag ggc cag ctc cat ggg aag ccg gtc cga 405Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Gln Leu His Gly Lys Pro Val Argggg gtg aag ctc gtg ggc aga gac ccc aag aac aac ctg gaa gcc 450Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Alattg gag gac ttt gag aaa gcc gca gga gcc cgc gga ctc agc acg 495Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thrgag agc atc ctc atc ccc agg cag agc gaa acc tgc tct cca ggg 540Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Glytag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc tct gag 585Xaa Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gluggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct gag ggt ggc ggc tct gag 630Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glugga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt tcc ggt gat ttt gat tat 675Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyrgaa aag atg gca aac gct aat aag ggg gct atg acc gaa aat gcc 720Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Alagtg aca cct caa cct gaa gaa cag aaa gaa agg aaa acc aca gaa 360Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Gluatg caa agt cca atg cag cca gtg gac caa gcg agc ctt cca ggt 405Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Glycac tgc agg gaa cct cca cca tgg gaa aat gaa gcc aca gag aga 450His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Argatt tat cat ttc gtg gtg ggg cag atg gtt tat tat cag tgc gtc 495Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Valcag gga tac agg gct cta cac aga ggt cct gct gag agc gtc tgc 540Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cysaaa atg acc cac ggg aag aca agg tgg acc cag ccc cag ctc ata 585Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Iletgc aca ggt gaa atg gag acc agt cag ttt cca ggt gaa gag aag 630Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu Lyscct cag gca agc ccc gaa ggc cgt cct gag agt gag act tcc tgc 675Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
ctc gtc aca aca aca gat ttt caa ata cag aca gaa atg gct gca 720Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Alaacc atg gag acg tcc ata ttt aca aca gag tac cag gta gca gtg 765Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Valgcc ggc tgt gtt ttc ctg ctg atc agc gtc ctc ctc ctg agt ggg 810Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Glyctc acc tgg cag cgg aga cag agg aag agt aga aga aca atc tag 855Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ileaaaacca 862<210>11<211>820<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD154 cDNA<400>11aagatac catttcsact ttaacacagc atg atc gaa aca tac aac 45Met Ile Glu Thr Tyr Asncaa act tct ccc cga tct gcg gcc act gga ctg ccc atc agc atg 90Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro Ile Ser Metaaa att ttt atg tat tta ctt act gtt ttt ctt atc acc cag atg 135Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Metatt ggg tca gca ctt ttt gct gtg tat ctt cat aga agg ttg gac 180Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Aspaag ata gaa gat gaa agg aat ctt cat gaa gat ttt gta ttc atg 225Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Metaaa acg ata cag aga tgc aac aca gga gaa aga tcc tta tcc tta 270Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leuctg aac tgt gag gag att aaa agc cag ttt gaa ggc ttt gtg aag 315Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lysgat ata atg tta aac aaa gag gag acg aag aaa gaa aac agc ttt 360Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe
gaa atg caa aaa ggt gat cag aat cct caa att gcg gca cat gtc 405Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Valata agt gag gcc agc agt aaa aca aca tct gtg tta cag tgg gct 450Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Alagaa aaa gga tac tac acc atg agc aac aac ttg gta acc ctg gaa 495Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Gluaat ggg aaa cag ctg acc gtt aaa aga caa gga ctc tat tat atc 540Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Iletat gcc caa gtc acc ttc tgt tcc aat cgg gaa gct tcg agt caa 585Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Glngct cca ttt ata gcc agc ctc tgc cta aag tcc ccc ggt aga ttc 630Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phegag aga atc tta ctc aga gct gca aat acc cac agt tcc gcc aaa 675Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lyscct tgc ggg caa caa tcc att cac ttg gga gga gta ttt gaa ttg 720Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leucaa cca ggt gct tcg gtg ttt gtc aat gtg act gat cca agc caa 765Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Glngtg agc cat ggc act ggc ttc acg tcc ttt ggc tta ctc aaa ctc 810Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leutgaacagtgt 820<210>12<211>613<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>S69.4-013<400>12tctagataac gggggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ilegca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcc cag gcc gat gga 90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Asp Gly
ggc ggc ata cga aga agc atg tca ggg acg tgg tat ctg aag gcg 135Gly Gly Ile Arg Arg Ser Met Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Alaatg acg gtg gac agg gag ttc cct gag atg aat ctg gaa tcg gtg 180Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Valaca ccc atg acc ctc acg ctt ctg aag ggg cat aac ctg gaa gcc 225Thr Pro Met Thr Leu Thr Leu Leu Lys Gly His Asn Leu Glu Alaaag gtc acg atg ctg atc agt ggc cgg tgc cag gag gtg aag gcc 270Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Alagtc ctg ggg cgg act aag gag agg aag aaa tac acg gcc gac ggg 315Val Leu Gly Arg Thr Lys Glu Arg Lys Lys Tyr Thr Ala Asp Glyggc aag cac gtg gca tac atc atc cct tcg gct gtg cgt gac cac 360Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Pro Ser Ala Val Arg Asp Hisgtg atc ttt tac tct gag ggc cag ctc cat ggg aag ccg gtc cga 405Val Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Gln Leu His Gly Lys Pro Val Argggg gtg aag ctc gtg ggc aga gac ccc aag aac aac ctg gaa gcc 450Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Alattg gag gac ttt gag aaa gcc gca gga gcc cgc gga ctc agc acg 495Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thrgag agc atc ctc atc ccc agg cag agc gaa acc tgc tct cca ggg 540Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Glygat gca tcg atg acc ggt ggt cag cag atg ggt agc gct tgg tct 585Asp Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Ser Ala Trp Sercac ccg cag ttc gaa aaa taataagctt 613His Pro Gln Phe Glu Lys<210>13<211>613<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>S76.1-H10<400>13tctagataac gggggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
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<223>S100.1-I08
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<223>引物<400>39gagcctgggg actttccaca ccc2权利要求
1.来自泪脂质运载蛋白的多肽或其同系物的突变蛋白，其中突变蛋白在N端肽序列和排列在β桶结构末端的三个肽环BC、DE和FG中的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，所述的β桶结构位于天然脂质运载蛋白结合口袋的对面，其中所述的泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的序列同源性，并且其中突变蛋白以可检测的亲和力结合给定靶。
2.权利要求1的突变蛋白，其中突变蛋白来自人泪脂质运载蛋白。
3.权利要求1或2的突变蛋白，其中突变蛋白在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置7-14、43-49、70-77和87-97对应的肽片段中的任何两个或两个以上序列位置包含氨基酸突变。
4.权利要求1-3中任一项的突变蛋白，其中突变蛋白在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置8、9、10、11、12、13、43、45、47、70、72、74、75、90、92、94和97对应的任何两个或两个以上序列位置包含氨基酸突变。
5.来自泪脂质运载蛋白的多肽或其同系物的突变蛋白，其中突变蛋白在四个肽环AB、CD、EF和GH中的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，所述的肽环包括天然脂质运载蛋白的结合口袋，其中所述的泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的序列同源性，并且其中突变蛋白以可检测的亲和力结合给定靶。
6.权利要求5的突变蛋白，其中突变蛋白来自人泪脂质运载蛋白。
7.权利要求5或6的突变蛋白，其中突变蛋白在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110对应的肽片段中任何两个或更多个序列位置包含氨基酸突变。
8.权利要求5-7中任一项的突变蛋白，其还在N端肽序列和三个肽环BC、DE和FG的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，所述肽环排列在位于天然脂质运载蛋白结合口袋对面的β桶结构的末端。
9.权利要求8的突变蛋白，其在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置7-14、43-49、70-77和87-97对应的肽片段中的任何两个或更多个序列位置包含氨基酸突变。
10.权利要求8或9的突变蛋白，其在与人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置8、9、10、11、12、13、43、45、47、70、72、74、75、90、92、94和97对应的任何两个或更多个序列位置包含氨基酸突变。
11.来自泪脂质运载蛋白的多肽或其同系物的突变蛋白，其中突变蛋白在N端区域和三个肽环BC、DE和FG中的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，所述的肽环排列在位于天然脂质运载蛋白结合口袋反面的β结构的末端，其中突变蛋白在四个肽环AB、CD、EF和GH中的任一序列位置包含至少两个突变氨基酸残基，所述肽环包括天然脂质运载蛋白的结合口袋，其中所述的泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的序列同源性，其中突变蛋白以可检测的亲和力结合至少一个给定靶。
12.权利要求1-11中任一项的突变蛋白，其中突变蛋白与选自有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光素标记、生色标记、发光标记、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属复合物和胶体金的标记缀合。
13.权利要求1-12中任一项的突变蛋白，其中突变蛋白在其N端或其C端与蛋白质、蛋白质结构域或肽融合。
14.核酸分子，其包含编码权利要求1-13中任一项的突变蛋白的核苷酸序列。
15.权利要求14的核酸分子，其包含在载体中。
16.权利要求14的核酸分子，其包含在噬菌粒载体中。
17.宿主细胞，其含有权利要求14-16中任一项的核酸分子。
18.产生权利要求1-13中任一项的突变蛋白的方法，其包括(a)在两个或两个以上不同密码子处诱变编码泪脂质运载蛋白或其同系物的核酸分子，其中所述的泪脂质运载蛋白或其同系物与人泪脂质运载蛋白具有至少60％的序列同源性，(b)在适当表达系统中表达(a)中得到的至少一个突变蛋白的核酸分子，并(c)通过选择和/或分离富集至少一种与给定靶具有可检测结合亲和力的突变蛋白。
19.产生根据权利要求1-13中任一项的突变蛋白的方法，其中通过基因工程方法从编码突变蛋白的核酸开始产生突变蛋白、突变蛋白的片段或突变蛋白与另一多肽的融合蛋白。
20.权利要求19的方法，其中突变蛋白在细菌或真核宿主生物中产生并从此宿主生物或其培养物中分离。
21.产生根据权利要求1-13中任一项的突变蛋白的方法，其中通过肽合成产生突变蛋白、突变蛋白的片段或突变蛋白与另一多肽的融合蛋白。
22.药物组合物，其包含至少一种权利要求1-13中任一项的突变蛋白。
23.权利要求1-13中任一项的突变蛋白用于检测给定靶的用途，其包括以下步骤(a)使突变蛋白与假定含有该靶的测试样品接触，并(b)通过适当信号检测突变蛋白/靶复合物。
24.权利要求23的用途，其中给定靶为蛋白质或蛋白质结构域、肽、核酸分子、有机分子或金属复合物。
25.权利要求23或24的用途，其中进行检测以证实蛋白质为药物靶。
26.权利要求1-13中任一项的突变蛋白用于分离给定靶的用途，其包括(a)使突变蛋白与假定含有该靶的测试样品接触，并(b)从样品中分离突变蛋白/靶复合物。
27.权利要求23-26中任一项的用途，其中将突变蛋白/靶复合物结合到固相上。
28.权利要求1-13中任一项的突变蛋白用于引导化合物到预选位点的用途，其包括(a)使突变蛋白与该化合物接触，并(b)递送突变蛋白/化合物复合物到预选位点。
29.权利要求1-13中任一项的突变蛋白与给定靶形成复合物的用途。
全文摘要
本发明涉及来自泪脂质运载蛋白或其同系物的新突变蛋白。本发明尤其涉及人泪脂质运载蛋白的突变蛋白。本发明也涉及编码此类突变蛋白的相应核酸分子及其产生方法。本发明还涉及产生此类突变蛋白的方法。最后，本发明涉及包含此脂质质运载蛋白突变蛋白的药物组合物以及突变蛋白的多种用途。
文档编号G01N33/573GK1871256SQ200480031336
公开日2006年11月29日 申请日期2004年8月24日 优先权日2003年8月25日
发明者A·斯克拉, S·施勒胡伯尔 申请人:皮里斯蛋白实验公司