一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学分析检测领域，可W快速高通量的进行样品前处理，大大提高了 检测效率，降低了人工成本，具体设及一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法。
【背景技术】
[0002] 遗传代谢病是指参与体内代谢的某种酶、运载蛋白、膜受体等编码基因发生突变， 使其编码的产物功能不良而引发代谢失常的一组疾病。许多遗传代谢病与氨基酸代谢异常 有关，且常常与多种氨基酸有关。氨基酸遗传代谢病不仅病种数量繁多、发病机理复杂，而 且其临床表现具有多样性和缺乏特异性。因此，临床上很需要一种能够同时检测血多种氨 基酸及其中间代谢产物的方法，W便应用于疾病的诊断和治疗。近几年开展的液相串联质 谱联用技术化C-MS/M巧，能够同时对一个样品中所含的数十种物质进行定性和定量分析。 国外已有报道采用LC-MS/MS检测血浆中氨基酸浓度，进行遗传代谢病筛查及诊断。近年 来，随着人们对遗传代谢病筛查及诊断的重视，氨基酸检测的临床样品越来越多，快速高通 量的检测方法越来越重要。
[0003] 目前，血浆中氨基酸检测的样品前处理方法主要是传统的衍生化法，样品处理过 程比较复杂，而非衍生化法因标本预处理简便易操作，已经越来越多的应用到检测患儿血 液中的各种氨基酸含量，并用来指导临床诊断和治疗。但是随着样品量的增加，目前的样品 前处理方法仍然不能满足临床大量样品的检测需求，临床上迫切需要一种高通量、低成本 的检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法，该方法采用96 孔板的样品前处理方法，在96孔板中沉淀蛋白、加内标、离屯、后取上清直接与液质联用的 自动进样装置连接，可W-次处理、分析96个样品，大大提高了检测效率，并且避免了反复 转移样品而导致的样品损失和人为误差，降低了人工成本。本发明为大量临床样品检测提 供了一种快速、高通量的检测方法。 阳0化]具体地，本发明设及W下各项：
[0006] 1. 一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法，所述方法包括W下步骤：
[0007] 1)将人体血浆用有机溶剂如甲醇、乙腊等沉淀蛋白、离屯、得到含有待测氨基酸的 上清液；
[0008] 2)将上清液用液质联用的方法进行定性定量分析。
[0009] 2.根据权利要求1所述的多种氨基酸分别为：蛋氨酸、亮氨酸、天冬酷胺、丙氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、异亮氨酸、鄉氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酷胺、 脯氨酸、赖氨酸和甘氨酸（缩写分别为：Met，Leu,Asn，Ala,Tyr，F*he，Τ'虹，Ser，Arg，lie, Val，Trp，Glu，Gin，Pro,Lys，Gly)。
[0010] 3.根据权利要求书1中的步骤1)所述，其特征在于样品前处理的步骤是在96孔 板中进行的，步骤如下： W11] 1)在96孔板中加入20-100μL的血清，加入待测氨基酸的内标物，再加入5倍至 10倍体积的有机溶剂包括甲醇、乙腊等。
[0012] 2)将步骤3)得到的混合溶液满旋l-5min，4°C冰箱静置10-30min。
[0013] 3)将步骤4)处理的混合溶液在3000r/min离屯、5-15min。
[0014] 4)将离屯、后的上清用排枪转移至96孔的进样板中。
[0015] 4.根据权利要求1中的步骤2)，其特征在于样品直接用96孔板进样，可W-次处 理96个样品。
[0016] 5.根据权利要求1中的步骤2)，其特征在于液相的流动相A为含有lOmM的醋酸 锭和0. 5%的甲酸的水溶液，流动相B为含有lOmM的醋酸锭、0. 5%的甲酸和10%水的乙腊 溶液；
【附图说明】
[0017] 图1是实施例1中17种氨基酸标准品的高效液相色谱图。
[0018] 图2是实施例2的样品1中17种氨基酸的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1
[0020] 1.血浆样品前处理步骤：
[0021] 在96孔板中，每个孔分别加入50μL待测血浆样品、5μL内标、50μL水和900μL 乙腊。将上述混合溶液满旋3min，然后在4°C冰箱静置30min，将处理后的溶液在3000r/min 下离屯、lOmin，用排枪把上清液转移至96孔的进样板中。其中，待测的17种氨基酸及其内 标见下表：
[0022]
[0023] 2.优化质谱条件：
[0024] 用17种氨基酸的标准品及其对应的同位素配置标准溶液1μg/mL直接用针累进 样，优化质谱多反应监测的参数如下： 阳0巧]
[0026]
[0027] 3.优化液相条件：
[0028] 流动相包括A和B，流动相A为含有lOmM的醋酸锭和0.5%的甲酸的水溶液，流动 相B为含有lOmM的醋酸锭、0. 5 %的甲酸和10 %水的乙腊溶液。流速0. 6血/min，柱溫35°C， 色谱柱：甜ridge邸ΗAmide2.IX100mm，2.5μηι粒径。优化的梯度条件如下：
[0029]
[0030] 4.柄;准品及内柄；的检测
[0031] 根据优化的液相和质谱条件对17种氨基酸的标准品及内标进行检测，结果如图1 所示，可见大部分氨基酸可W完全分离。
[0032] 5.标准曲线的测定
[0033] 根据优化的液相和质谱条件对17种氨基酸的标准品进行标准曲线的测定。配制 17 个氨基酸标品的浓度如下：〇. 0625μg/mL、0. 3125μg/mL、1. 5625μg/mL、3. 125μg/mL、 6. 25μ邑/mL、12. 5μ邑/mL、25μ邑/mL、50μ邑/mL。
[0034]
[0036] 实施例2
[0037] 实际样品的测定
[0038] 根据实施例1中的样品前处理的方法，将96个正常人血浆样品（由北京航空总 医院提供）进行蛋白沉淀和氨基酸提取，将氨基酸提取液转入96孔进样板中，按照实施例 1优化的质谱和液相条件对样品进行分析和数据处理，根据内标法计算每种氨基酸的浓度， 下表列出了其中的5个。图2是样品1中17种氨基酸的高效液相色谱图。
[0039]
【主权项】
1. 一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法，所述方法包括以下步骤： 1) 将人体血浆用有机溶剂如甲醇、乙腈等沉淀蛋白、离心得到含有待测氨基酸的上清 液； 2) 将上清液用液质联用的方法进行定性定量分析。2. 根据权利要求1所述的17种氨基酸分别为：蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、酪 氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯 氨酸、赖氨酸和甘氨酸（缩写分别为：Met，Leu，Asn，Ala，Tyr，Phe，Thr，Ser，Arg，lie，Val， Trp，Glu，Gln，Pro,Lys，Gly) 〇3. 根据权利要求书1中的步骤1)所述，其特征在于样品前处理的步骤是在96孔板中 进行的，步骤如下： 3) 在96孔板中加入20-100μL的血清，加入待测氨基酸的内标物，再加入5倍至10倍 体积的有机溶剂包括甲醇、乙腈等。 4) 将步骤3)得到的混合溶液涡旋l-5min，4°C冰箱静置10_30min。 5) 将步骤4)处理的混合溶液在3000r/min离心5_15min。 6) 将离心后的上清用排枪转移至96孔的进样板中。4. 根据权利要求1中的步骤2)，其特征在于样品直接用96孔板进样，可以一次处理96 个样品。5. 根据权利要求1中的步骤2)，其特征在于液相的流动相A为含有10mM的醋酸铵和 0. 5%的甲酸的水溶液，流动相B为含有10mM的醋酸铵、0. 5%的甲酸和10%水的乙腈溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种高通量检测人体血浆中多种氨基酸的质谱方法。采用有机溶剂沉淀血浆中蛋白，并加入稳定同位素内标，高速离心提取上清液中含有的氨基酸直接进样检测血浆中的多种氨基酸。本发明采用96孔板的样品前处理方法，在96孔板中沉淀蛋白、加内标、离心后直接与液质联用的自动进样装置连接，可以一次处理、分析96个样品，大大提高了检测效率，并且避免了反复转移样品而导致的样品损失和人为误差，降低了人工成本。目前氨基酸的检测主要用于遗传代谢病筛查及诊断，随着人们的重视，临床检测样品越来越多，本发明为大量临床样品检测提供了一种快速、高通量的检测方法。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105403637
【申请号】CN201510945747
【发明人】李岩, 谢雯春, 李倩倩
【申请人】广东中科康仪生物技术有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月18日