一种基于高通量检测的血小板聚集测定方法及在药物筛选中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种血小板聚集的测定方法W及该方法在药 物研发领域的应用。
【背景技术】
[0002] 血小板在生理性止血、维持血管壁完整性W及某些病理过程，如血栓形成、动脉粥 样硬化、不稳定性也绞痛、肿瘤转移和炎症反应等过程中起着重要作用。大量研究表明，血 小板的激活和聚集是体内血栓形成的始动因素，亦是血栓形成过程中最关键的成份之一。 临床常见的危重急症如也性巧死、也肌梗死、脑卒中、肺梗死等均是血栓性疾病。因此，血小 板功能检测对早期发现血栓风险W及血小板相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。
[0003]冠状动脉动脉粥样硬化斑块破裂后血小板的黏附、聚集和激活是冠状动脉血栓形 成的重要基础。抗血小板药物可通过不同途径阻断血小板的聚集和激活，能够有效地防止 冠状动脉粥样硬化血栓的形成。抗血小板治疗是防治冠状动脉粥样硬化血栓形成非常重 要的手段。目前抗血小板药物主要有血小板二磯酸腺巧（ADP)受体枯抗剂、血小板糖蛋白 IIb/IIIa受体枯抗剂、蛋白酶激活受体PAR1枯抗剂和血栓素TXA2受体枯抗剂等。
[0004]目前临床上常用的能够量化检测血小板功能的方法主要有光学比浊法和血小板 诱导聚集比浊法分述如下：
[0005] 1、光学比浊法测定血小板聚集率（LTA)是最经典的血小板功能检测方法，常作为 诊断研究用的金标准，与临床事件的相关性很好。具体方法：首先分离富含血小板血浆，加 入激活物后促进血小板与血小板之间的聚合，再W贫血小板血浆作为对照测定样品的透光 度，如果血小板聚集，则透光度降低。LTA方法的特点是可W采用特异性激活物，从而检测不 同抗血小板药物的效果，如采用花生四帰酸诱导的血小板聚集率可反映机体对阿司匹林治 疗的反应性，采用ADP作为诱导剂则主要反映对氯化格雷(或其他喔吩并化巧类药物）治疗 的反应性。其主要缺点包括；血样处理要求在短时间内完成、重复检测变异较大、采血量相 对较大、需分离富含血小板血浆因而样品处理时间较长等。
[0006]2、血小板诱导聚集比浊法；VerifyNow由美国Ac州metrics公司研发，2006年经美 国抑A批准用于血小板功能检测。其原理是在试管内预混有血小板激活剂和纤维蛋白原包 被的小珠。加入全血标本后，血小板受激活剂作用而活化，其表面Hb/IIIa受体复合物与 小珠表面的纤维蛋白原交联，使血小板聚集于小珠表面，试管内透光性增强。VerifyNow属 床旁检测设备，可分别W花生四帰酸、ADP及凝血酶受体激活肤（TRAP)作为激动剂，特异性 地检测血小板对阿司匹林、P2Y12阻滞剂及GPI的反应性。VerifyNow技术的优势是采用全 血作为标本，整个检测过程仅需3分钟，在目前所有血小板功能检测方法中耗时最短。迄今 为止，已有上百篇正式发表的文献报道采用VerifyNow检测血小板聚集功能，但此方法仅 是检测血小板聚集的最初阶段，且检测费用较高，短期内难于推广。
[0007]目前针对临床的血小板聚集仪专利有CN1866029A，该检测方法主要局限是通量 低、成本高血样处理要求在短时间内完成、重复检测变异较大、采血量相对较大等。该模型 不适用于体外药物筛选。为了克服传统血小板聚集仪检测方法的缺点，建立能够在临床上 不需要血小板聚集仪就能检测血小板活性的方法。提供了本发明的测定方法，该方法的特 点是：通量高、耗时短、稳定性好和血液样品量少。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是：提供一种基于高通量检测的血小板聚集测定方法。
[0009] 本发明的另一目的是；提供了一种基于高通量检测的血小板聚集测定方法的用 途，该用途为高通量筛选多种刺激剂导致血小板聚集的枯抗剂，用于多个祀点的抗血栓药 物的筛选，包括环氧化酶抑制剂，ADP受体抑制剂，蛋白激活酶受体抑制剂和血小板表面 GPIIb/IIIa受体抑制剂等。适用于药品研发领域进行体外药物高通量筛选，具有设备要求 低、耗时短、成本低和重现性好的特点。
[0010] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0011] a)提供来自生物体的具有活性的血小板样品
[0012] 如志愿者采取手臂静脉抽血，大鼠和豚鼠血采用颈动脉取血等；血样跟3. 8%的 构稼酸轴9 ;1混合抗凝，血样于200Xg室温条件下离也lOmin，吸出上层富含血小板血浆 (PRP)，余下的血浆再WlOOOXg转速离也lOmin，吸取上清液为贫血小板血浆（PPP)。
[0013] b)用溶媒将血小板息液稀释至通过振动能够使之聚集的浓度
[0014] 用PPP、生理盐水或磯酸盐缓释液稀释PRP使其血小板计数2X105-6X1〇7yL后 进行血小板聚集实验。
[0015] C)用单道移液器或多道移液器将富含血小板的溶媒转移至微孔板中
[0016] d)将装有富含血小板的溶媒的微孔板放置于37C赔育5-30min;
[0017] e)用多道移液器将微孔板的每孔加入一定浓度的刺激剂
[001引刺激剂包括；二磯酸腺巧（ADP)、肾上腺素（ADR)、胶原（CDL)、花生四帰酸（ARA)、 凝血酶（TH)和凝血酶激活肤1 (TRAP-1)，ADP终浓度为1-10yM，ADR终浓度为5-10yg/mL， COL终浓度为1-10yg/mL，ARA终浓度为0. 2-lmM，凝血酶终浓度为0. 01-0.抓/ml,TRAP-1 终浓度为2-20yM
[0019] f)用酶标仪的动力学方法在一定波长下测定一定时间内各孔吸光度
[0020] 用酶标仪的动力学方法在波长为390-770皿，优先650皿条件下测定5-30min，优 选lOmin内各孔吸光度（每隔30s测定一次，测定前震动5s，首次测定不震动）；
[0021] g)血小板聚集率计算
[0022] 血小板聚集=APRP(未加刺激剂）-APRP(加刺激剂）/APRP(未加刺激剂）-APPP， 由于首次测定未震动APRP(未加刺激剂）WAPRP(首次值)，抑制率=1-(给药组最大聚集 率/对照组最大聚集率）X100%。
【具体实施方式】
[0023]逼施例1;健康志愿者血小板聚集测定
[0024]1.主要试剂和仪器
[00巧]凝血酶（31肖1113)、凝血酶受体激动肤巧^?-1)(?册6化《？齡1^.抑(：.），心500离 也机(长沙湘仪)，烧杯，无菌注射器，无菌采血针、采血管，5'二磯酸腺巧二轴（阿拉下）纯 度；95%，批号=34995,花生四帰酸、肾上腺素、胶原（阿拉下)，CMC-Na(国药集团化学试 剂有限公司），批号；F20081015。96孔板（Costar)，湘仪低速离也机心500(长沙湘仪）， SpectraMaxM5 酶标仪（TOPBiotek&Mole州larDevic