体外诱导巨核系祖细胞的三维细胞培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地，设及细胞培养的方法，更具体地，设及体外诱 导巨核系祖细胞的=维细胞培养方法。
【背景技术】
[0002] 血小板是血液中最小的细胞，具有防止出血并减少血管损伤的重要作用，近年来 肿瘤发病率呈上升趋势，肿瘤放化疗病人血液学检查常出现血小板减少，临床上往往通过 输注机采血小板作为治疗手段，由于血源紧张且需要反复输注血小板，迫使我们寻找新的 血小板来源。造血干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的造血前体细胞，目前已用于恶 性及非恶性血液病、实体肿瘤等多种疾病的治疗。造血干细胞可来源于骨髓、外周血和厮带 血等，其中厮带血造血干细胞具有增殖能力强、免疫原性低、易于获得等优点，已成为人们 关注的焦点。厮血造血干细胞能够分化为巨核系祖细胞，并进一步发育成熟产生血小板，因 此有望通过体外回输巨核系祖细胞W提高血液中血小板的数量，缓解或替代血源紧张造成 的血小板缺乏。
[0003] 因此，体外诱导巨核系细胞的方法有待于进一步研究。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种体外诱导巨核系祖细胞的=维细胞培养方法。 阳〇化]需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
[0006] 发明人发现，将分离的厮血单个核细胞接种于两种细胞培养袋中分别在WIGGENS 摇床和WAVE生物反应器中进行=维震荡培养，同时W静止的细胞瓶二维培养为对照，观察 二维培养与=维培养诱导巨核系祖细胞。研究发现，采用=维培养方式诱导巨核系祖细胞， 可W显著提高诱导效率
[0007] 因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种体外诱导巨核系祖细胞的=维 细胞培养方法。根据本发明的实施例，该方法包括将单个核细胞培养于细胞培养袋中，并置 于晓晓板式生物反应器上进行培养，其中，所述晓晓板式生物反应器的振荡角度为2-13°， 转速为3-40;rpm。
[0008] 发明人惊奇的发现，采用该=维细胞培养方法诱导单个核细胞转化为巨核系祖细 胞，诱导效率显著提高。
[0009] 根据本发明的实施例，所述振荡角度为5°。
[0010] 根据本发明的实施例，所述转速随细胞培养时间的延长而增加。由此，更适于细胞 的增殖、诱导和分化。
[0011] 根据本发明的实施例，在细胞培养的第1-10天，所述转速为lOrpm ;在细胞培养的 第10天W后，所述转速为14rpm。由此，细胞增殖速度快。
[0012] 根据本发明的实施例，用于培养单个核细胞的培养基为：含SCF、比-3、比-6、TP0 的stemspan无血清培养基。由此，培养环境适于细胞生长。 阳01引根据本发明的实施例，所述SCF的浓度为20~20化g/mU优选50ng/mL ;所述比-3 的浓度为5~lOOng/mL，优选20ng/mL ;所述]X-6的浓度为10~200ng/mL，优选50ng/mL ; 所述riiTPO的浓度为20~20化g/mU优选50ng/mL。由此，培养环境更适于细胞生长。
[0014] 根据本发明的实施例，所述用于培养单个核细胞的培养基，进一步包含：泊洛沙姆 188。由此，细胞诱导分化成巨核系祖细胞的效率更高。
[0015] 根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆188(poloxame;r 188, P188)的浓度为0. 2~ 2mg/mU优选Img/血。由此，细胞生长速度快，细胞诱导分化成巨核系祖细胞的效率显著提 局
[0016] 根据本发明的实施例，分别于细胞培养的第4天、第7天、第10天，向所述细胞培 养袋中补充原培养基的1/3体积的培养基。由此，细胞增殖速度快。
[0017] 根据本发明的实施例，所述晓晓板式生物反应器的种类不受特别的限制，只要能 为细胞培养袋提供角度为2-13°C，转速为3-40rpm的振荡即可，例如：晓晓板摇床和WAVE 生物反应器。
[0018] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0019] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0020] 图1显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测体外2D培养方式诱导巨核 系祖细胞的细胞表面标志CD41、CD61的表达情况；
[0021] 图2显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测体外3D培养方式诱导巨核 系祖细胞的细胞表面标志CD41、CD61的表达情况；
[0022] 图3显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测体外3D+P188培养方式诱导 巨核系祖细胞的细胞表面标志CD41、CD61的表达情况。
[0023] 图4显示了根据本发明一个实施例的2D诱导培养14d瑞±姬姆萨染色的细胞形 态。
[0024] 图5显示了根据本发明一个实施例的3D诱导培养14山瑞±姬姆萨染色的细胞形 态。
【具体实施方式】
[00巧]下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，运些实施例仅仅是说明 性的，而不能理解为对本发明的限制。
[00%] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品。 阳〇27] 实施例1 w測一、材料
[0029] 厮带血：70ml来源北京厮带血库，采集单位通州妇幼保健院；
[0030] 透气式培养袋：货号邸0005,300ml，宝日医生物技术有限公司，日本生产； 阳03U WIGGENS摇床：晓晓板振荡器，WS - 350德国生产；
[0032] C〇2细胞培养箱：Thermo Scientific Model 3111。
[0033]二、方法
[0034]分离厮带血单个核细胞，然后，分别采用细胞瓶（2D)、细胞培养袋（3D)、细胞培养 袋（3D+P188)=种方法对其进行培养，具体方法如下：
[0035] 1、细胞瓶畑）培养：
[0036] 1)培养基：含 50ng/mL SCF、20ng/mL 比-3、50ng/mL 比-6、50ng/mL TP