0 的 Stemspan培养基
[0037]。培养方法：
[0038] 将单个核细胞于培养瓶中进行培养，培养基体积20ml，细胞密度2xl〇Vml，然后， 将细胞瓶静止培养，并于第4d、M、lOd按1/3补液。
[0039] 2、细胞培养袋（3D)培养：
[0040] 1)培养基：含50ng/mL SCF、20ng/mL比-3、50ng/mL比-6、50ng/mL TP0的 Stemspan培养基， 阳〇W 。培养方法：
[0042] 将单个核细胞于培养袋中进行培养，培养基体积20ml，细胞密度2xl〇Vml，然后， 将细胞培养袋于晓晓板摇床上培养，角度5° (2-13°均可，优选5-7° )，转速lOrpm，并于 第4d、M、lOd按1/3补液，lOd后转速提高至14巧m。
[0043] 3、细胞培养袋（3D+P188)培养：
[0044] 1)培养基：含Img/mL P188、50ng/mL SCF、20ng/mL比-3、50ng/mL比-6、50ng/mL TPO的stemspan培养基，
[0045] 2)培养方法：与上述的细胞培养袋（3D)培养方法相同。
[0046] 按照上述S种方法，体外诱导巨核系祖细胞14山然后收集细胞，检测细胞存活率， 细胞数，细胞表面标志。
[0047] S、结果 W4引 1、细胞形态 W例采用倒置显微镜观察细胞的形态，其中，2D培养的细胞瓶中单个核细胞培养4山 有贴壁细胞，7d细胞数增多，细胞变大，贴壁细胞增多，lOd成团细胞增加，培养14d，用瑞± 吉姆萨对细胞进行染色，显微镜下，细胞的形态如图4所示，大部分细胞体积小，核类圆形， 核染色质疏松，颗粒型细胞少见，巨核系祖细胞数量少。细胞培养袋（3D)培养和细胞培养 袋（3D+P188)培养的细胞培养袋中，细胞形态及生长状态较一致，培养4d可见细胞成团生 长，有少量红色集落，7d细胞成团，细胞较大；培养14d，用瑞±吉姆萨对细胞进行染色，显 微镜下，细胞的形态如图5所示，核质比增加，细胞体积变大，细胞核形状不规则，出现含颗 粒的细胞，巨核系祖细胞数量增加。 阳化0] 2.细胞生物学检测
[0051] 细胞培养14d后，对上述=种方法诱导获得的巨核系祖细胞的细胞表面标志 CD41、CD61的表达情况进行检测，结果见表1-3 W及图1-3,结果表明，与2D培养相比，3D 培养（包括细胞培养袋（3D)培养和细胞培养袋（3D+P188)培养）诱导的巨核系祖细胞， 细胞表面标志CD41、CD61、CD41/CD61的表达均显著提高，并且加入P188(即细胞培养袋 (3D+P188)培养）表达效果更明显，且加入P188细胞培养袋培养的细胞存活率和细胞数与 细胞瓶培养无差别。
[0052] 表1体外诱导细胞存活率和细胞数检测
[0053]
[0056] A A与2D培养相比相差非常显著。$$与3D培养相比相差非常显著。
[0057] 表3不同细胞培养模式对体外诱导的人厮带血巨核系祖细胞表型的影响
[0058]
[0059]
[0060] *与2D培养相比相差显著。
[0061] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可W在任何 的一个或多个实施例或示例中W合适的方式结合。
[0062] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可W理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可w对运些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种体外诱导巨核系祖细胞的三维细胞培养方法，其特征在于，将单个核细胞培养 于细胞培养袋中，并置于跷跷板式生物反应器上进行培养，其中，所述跷跷板式生物反应器 的振荡角度为2-13度，转速为3-40rpm。2. 根据权利要求1所述的三维细胞培养方法，其特征在于，所述振荡角度为5度。3. 根据权利要求1所述的三维细胞培养方法，其特征在于，所述转速随细胞培养时间 的延长而增加。4. 根据权利要求3所述的三维细胞培养方法，其特征在于， 在细胞培养的第1-10天，所述转速为IOrpm ; 在细胞培养的第10天以后，所述转速为14rpm。5. 根据权利要求1所述的三维细胞培养方法，其特征在于，用于培养单个核细胞的培 养基为：含SCF、IL-3、IL-6和TPO的stemspan无血清培养基。6. 根据权利要求5所述的三维细胞培养方法，其特征在于， 所述SCF的浓度为20~200ng/mL，优选50ng/mL ; 所述IL-3的浓度为5~100ng/mL，优选20ng/mL ; 所述IL-6的浓度为10~200ng/mL，优选50ng/mL ; 所述TPO的浓度为20~200ng/mL，优选50ng/mL。7. 根据权利要求5或6所述的三维细胞培养方法，其特征在于，所述用于培养单个核细 胞的培养基，进一步包含：泊洛沙姆188。8. 根据权利要求7所述的三维细胞培养方法，其特征在于，所述泊洛沙姆188的浓度为 0? 2 ~2mg/mL，优选 lmg/mL〇9. 根据权利要求1所述的三维细胞培养方法，其特征在于，分别于细胞培养的第4天、 第7天、第10天，向所述细胞培养袋中补充原培养基的1/3体积的培养基。10. 根据权利要求1所述的三维细胞培养方法，其特征在于，所述跷跷板式生物反应器 为跷跷板摇床或WAVE生物反应器。
【专利摘要】本发明公开了一种体外诱导巨核系祖细胞的三维细胞培养方法。该方法将单个核细胞培养于细胞培养袋中，并置于跷跷板式生物反应器上进行培养，其中，所述跷跷板式生物反应器的振荡角度为2-13°，转速为3-40rpm。采用该三维细胞培养方法诱导单个核细胞转化为巨核系祖细胞，诱导效率显著提高。
【IPC分类】C12N5/078
【公开号】CN105002138
【申请号】CN201510446748
【发明人】裴雪涛, 陈琳, 谢小燕, 刘大庆, 岳 文, 吕洋, 李思霆, 王思涵, 姚海雷, 贾雅丽
【申请人】军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月24日