多重甲基化-特异性扩增系统和方法
【专利说明】多重甲基化-特异性扩增系统和方法
[0001] 本申请要求于2013年3月14日提交的临时专利申请序列号61/782, 370的优先 权，该临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基 化-特异性扩增系统和方法。
[0003] 背景 DNA甲基化为可被遗传并随后去除而不改变DNA序列的一种DNA化学修饰。因此，其为 表观遗传密码的一部分（Jaenisch & Bird. (2003) Nature Genetics, 33，245,通过引用 以其整体结合到本文中）。DNA甲基化涉及向DNA核碱基添加甲基。在最常见的例子中，将 甲基添加到胞嘧啶嘧啶环的第5个碳。胞嘧啶甲基化通常具有减少基因表达的作用。
[0004] 甲基化为所有病毒自我/非自我识别的常见能力。所检查的每种脊椎动物中均已 发现胞嘧啶5位置的DNA甲基化。在成年体细胞组织中，DNA甲基化通常发生在CpG二核 苷酸背景下；非-CpG甲基化在胚胎干细胞中普遍存在（Dodge等（2002) Gene 289 (1-2): 41-48·，Haines 等（2001) Developmental Biology 240 (2): 585 - 598·，通过引用以 其整体结合到本文中）。在植物中，胞嘧啶对称（CpG或CpNpG)和不对称（CpNpNp)地甲基 化。人的长期记忆存储可通过DNA甲基化调节（Miller & Sweatt. (2007-03-15) Neuron 53 (6): 857 - 869·，Powell & Devin. (2008) New Scientist·,通过引用以其整体结合 到本文中）。
[0005] 在哺乳动物中，DNA甲基化是正常发育所必不可少的并且与包括印记、X-染色 体失活、重复元件和致癌作用的抑制在内的许多关键过程有关。哺乳动物中所有CpG的 60-90%为甲基化的（Tucker. (2001) Neuron. 30(3): 649-52.，通过引用以其整体结合 到本文中）。CpG被分为称作"CpG岛"的簇，其存在于许多基因的5'调节区域。在许多疾 病过程例如癌症中，基因启动子CpG岛获得异常的超甲基化，这导致可遗传的转录沉默。
[0006] 用于改善甲基化检测测定的灵敏度和鲁棒性（robustness)的方法是需要的。 [0007] 发明概述 本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基 化-特异性扩增系统和方法。
[0008] 例如，在一些实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测 试剂处理靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的多个（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20 等）核酸片段以产 生多个扩增子；和c)检测所述多个扩增子。在一些实施方案中，所述靶包含CpG岛。在一 些实施方案中，所述靶为基因的启动子区域。在一些实施方案中，所述甲基化特异性试剂 为亚硫酸氢盐。在一些实施方案中，所述同时扩增在单个反应容器（例如，孔、管等）中进 行。在一些实施方案中，所述核酸靶富含GC。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐与未甲基化的 胞嘧啶残基反应，将其转化为尿嘧啶残基，并且不与甲基化的胞嘧啶残基反应，使其保持为 5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，所述扩增为PCR。在一些实施方案中，所述检测包括使 扩增子与多个核酸探针接触。在一些实施方案中，所述核酸探针包含可检测的标记。在一 些实施方案中，所有探针包含相同的标记。在一些实施方案中，所述标记为荧光标记，尽管 考虑其它标记。在一些实施方案中，所述扩增和检测包括实时PCR扩增和检测。在一些实 施方案中，所述检测包括选自，例如，质谱分析、测序或杂交的核酸检测技术。
[0009] 本发明进一步的实施方案提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测试剂处 理靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的至少5个核酸片段以产生多个扩增子；和c)检测所述 多个扩增子。
[0010] 本发明额外的实施方案提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测试剂处理 靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的至少10个核酸片段以产生多个扩增子；和c)检测所述多 个扩增子。
[0011] 在一些实施方案中，本发明提供扩增核酸的方法，包括：a)同时扩增已经用甲基 化-特异性检测试剂处理的靶核酸内的多个核酸片段以产生多个扩增子；和b)检测所述 扩增子。
[0012] 在进一步的实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测 试剂处理启动子核酸；b)同时扩增靶核酸内的多个（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20 等）核酸片段以 产生多个扩增子；和c)检测所述多个扩增子。
[0013] 在又其它的实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a)用亚硫酸氢盐试剂处理 靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的多个（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、 25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20 等）核酸片段以产生多个扩增 子；和c)检测所述多个扩增子。
[0014] 在更进一步的实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检 测试剂处理靶核酸；b)同时PCR扩增靶核酸内的多个（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20 等）核酸片段以 产生多个扩增子；和c)检测所述多个扩增子。
[0015] 在一些实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测试剂 处理靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的多个（例如，2，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20 等）核酸片段以产生多 个扩增子；和c)使用包含相同标记的多个核酸探针检测所述多个扩增子。
[0016] 在一些实施方案中，本发明提供包含实施甲基化-特异性多重扩增反应中所必需 的、足够的或有用的试剂（例如，引物、探针、亚硫酸氢盐、缓冲液等）的系统、组合物或试剂 盒。
[0017] 基于本文所包含的教导，额外的实施方案将对相关领域技术人员显而易见。
[0018] 发明详述 本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基 化-特异性扩增系统和方法。
[0019] 定义 为了便于理解本技术，下文定义了多个术语和短语。额外的定义贯穿整个详述而说明。
[0020] 如本文所使用的，"一个"或"一种"或"所述"可意指一个或一个以上。例如，"一 个"物件可意指一个物件或多个物件。
[0021] 如本文所使用的术语"标记"是指可用于提供可检测（优选可定量）效果并且可 连接至核酸或蛋白质的任何原子或分子。标记包括但不限于染料、放射性标记例如 32P、结 合部分例如生物素、半抗原例如地高辛、发光、发磷光或发荧光的部分以及单独或与可抑制 或改变荧光共振能量转移（FRET)发射谱的部分组合的荧光染料。标记可提供可通过荧光、 放射性、比色法、重量分析法、X-射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可为带 电的部分（阳性或阴性电荷）或备选地，可为电荷中性，只要包含该标记的序列可被检测。
[0022] 术语"引物"是指当放置在诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时 (例如，在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下以及在合适的温度和pH下）能够充当 合成起始点的寡核苷酸，无论是在纯化的限制酶消化产物中天然存在的还是合成产生的。 为了在扩增中达到最大效率，所述引物优选为单链的，但可备选地为双链的。若为双链，首 先处理引物以分开其两条链，然后用于制备延伸产物。优选地，所述引物为寡脱氧核糖核苷 酸。引物必须足够长以便在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于 多个因素，包括温度、引物来源和方法的用途。
[0023] 术语"靶"，当关于聚合酶链反应使用时，是指用于聚合酶链反应的引物所结合的 核酸区域。因此，"靶"寻求从其它核酸序列中分选出。"片段"定义为靶序列内的核酸区域。
[0024] 如本文所使用的，术语"受试者"和"患者"是指任何动物，例如狗、猫、鸟、牲畜，特 别地哺乳动物，优选人。
[0025] 如本文所使用的，术语"灵敏度"定义为通过真阳性数目除以真阳性和假阴性总和 而计算的测定（例如，方法、检验）性能的统计度量。
[0026] 如本文所使用的，术语"特异性"定义为通过真阴性数目除以真阴性和假阳性总和 计算的测定（例如，方法、检验）性能的统计度量。
[0027] 如本文所使用的，术语"扩增子"是指经由扩增反应产生的核酸。扩增子通常为双 链DNA ;然而，其可为RNA和/或DNA:RNA。扩增子包括与样品核酸互补的DNA。在一些实 施方案中，引物对配置为从样品核酸产生扩增子。因此，任何给定扩增子的碱基组成可包括 引物对、引物对的互补序列和经扩增产生扩增子的样品核酸区域。本领域技术人员理解，所 设计引物对序列掺入扩增子中可替代引物结合位点的天然序列及其互补序列。在某些实施 方案中，使用引物扩增靶区域后，得到的具有引物序列的扩增子被用于后续分析（例如碱 基组成测定）。在一些实施方案中，扩增子进一步包含与后续分析相容的一段。
[0028] 术语"使…扩增"或"扩增"在核酸的情况下是指多核苷酸或多核苷酸的一部分的 多个拷贝的产生，典型地从少量的多核苷酸（例如，少至单个多核苷酸分子）开始，其中扩 增产物或扩增子一般为可检测的。多核苷酸的扩增包括多个化学和酶促过程。在聚合酶链 反应（PCR)或连接酶链反应（LCR)期间从靶或模板DNA分子的一个或少数拷贝产生多个 DNA拷贝为扩增的形式。扩增并不限于起始分子的严格复制。例如，使用反转录（RT)-PCR 从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子为扩增的一种形式。此外，在转录过程中从单个 DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的一种形式。
[0029] 如本文所使用的，术语"样品"以其最广泛的含义使用。在某种意义上，其意味着 包括获自任何来源的代表性部分或培养物，包括生物和环境来源。生物样品可从动物（包 括人）获得并且包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，例如血浆、血清等。 环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、泥、淤泥、生物膜、水和工业样品。然而这些例 子不应解释为限制适用于本发明的样品类型。
[0030] 本技术的实施方案 尽管本文的公开内容涉及某些说明性的实施方案，应理解的是这些实施方案以举例的 方式而非以限制的方式呈现。
[0031] 本公开内容的实施方案提供用于多重甲基化-特异性PCR的系统和方法。在一些 实施方案中，对于特定甲基化靶（例如，启动子或其它核酸，如CpG岛）所述系统和方法利 用多于一个的扩增子（例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、 7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多等）。在一些实 施方案中，在单个反应中产生2到30、2到20、2到15、2到10、5到30、5到20、5到10或5 到10个扩增子。在一些实施方案中，扩增子重叠或不重叠。
[0032] 本公开内容的实施方案在图1中说明。本公开内容用亚硫酸氢盐PCR说明，尽管 可利用其它甲基化-特异性检测或鉴定试剂或方法。黑色实线（顶部）代表DNA靶的序 列。中间分段的黑线代表亚硫酸氢盐处理之后的序列，亚硫酸氢盐处理导致非甲基化C'转 化为U'并且还