专利名称：用活体外扩增的cd4+cd25+调节性t细胞降低移植物抗宿主病效应的方法
技术领域：
在一个实施例中，本发明涉及⑶4+⑶25+调节性T细胞的活体外扩增方法。该方 法包括从人供体提取包括外周血单核细胞的样品的步骤。提取的细胞中包含一定数量的 ⑶4+⑶25+调节性T细胞。对⑶4+⑶25+调节性T细胞的相对数量进行富集，使Treg细胞 组成样品中的大多数细胞。此后，对可能包括源自第三方供体的Treg细胞的富集Treg细 胞进行数量扩增，形成可用于治疗GVHD的有临床意义的细胞群。
背景技术：
异源造血干细胞移植(HSCT)是恶性血液病和遗传血液病的潜在治疗方法。临床 HSCT中一个主要的障碍以及危及生命的并发症是移植物抗宿主病(GVHD)，这是激活的供 体T细胞对宿主组织的广泛攻击。虽然低等级的移植物抗宿主效应可在消除恶性细胞方面 起重要的作用，但严重的GVHD是接受HSCT的患者死亡和发病的主要原因。在异源干细胞 移植后，II-IV级急性GVHD的风险高达70%。多种免疫抑制剂，例如钙调磷酸酶抑制剂和 类固醇，被广泛用于降低GVHD的风险，但是当前的疗法难以治愈50%以上的II-IV级GVHD 患者。另外，使用高剂量的免疫抑制剂会损害免疫重建，并降低T细胞介导的移植物抗白血 病(GV L)反应。由于传统治疗方法的失败率很高，期待提供替代的GVHD治疗方法。
发明内容
本发明的一种形式包括生成富集的⑶4+⑶25+ Treg细胞样品的方法。根据本发 明的说明分离和扩增的细胞可用于治疗GVHD症状。
本发明参照附图进行公开，其中图1A、IB和IC为纯化前和纯化后CD4+CD25+Treg细胞纯度的图表；图ID、IE和IF为扩增前和扩增后CD4+CD25+Treg细胞纯度的图表；图2示出的几个图表显示了⑶4+⑶25+Treg细胞的表型特征；图3A和3B为描述⑶4+⑶25+Treg细胞在长期扩增后发生的某些表型变化的图表。图4A、4B和4C为显示CD4+CD25+Treg细胞的体外抑制活性的图表；图5描绘了 Treg细胞对N0D/SCID小鼠的DTH样局部炎症的效应；图6A至6E示出了 Treg细胞对NOD/SCID GVHD小鼠模型的效应；以及
图7A至7B中的图表显示了扩增的人Treg细胞在体外抑制实验中等同抑制异源 ⑶4+⑶25-T效应T细胞的增殖和同源⑶4+⑶25-T效应T细胞的增殖。在所有这几个视图中，对应的参考符号指示对应的部分。本文列出的例子示出了 本发明的几个实施例，但是不应该理解为以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式在一个实施例中，本发明涉及从健康供体提取人⑶4+⑶25+Treg细胞的方法。 Treg细胞(即调节性T细胞)为抑制免疫系统激活，从而防止自身免疫性疾病的细胞。 ⑶4和⑶25为可由某些细胞表达的蛋白质。因此，⑶4+和⑶25+的Treg细胞为Treg细 胞的亚群。从供体抽取原始血样，例如淋巴细胞或者全血。纯化提取的原始血样以富集 CD4+CD25+Treg细胞的相对数量。对富集的样品进行活体外扩增以增加总细胞群同时维持 ⑶4+⑶25+Treg细胞的相对数量。对患者施用所得的细胞，帮助抑制GVHD症状。来自健康供体的人外周血剂可从商业血库购买或者用常规技术直接从供体获得。 人外周血单核细胞(PBMC)首先用Ficoll Hypaque (Amersham)通过密度梯度离心法从血 样中分离。根据厂家的说明，用标准分离试剂盒(例如使用人CD4+CD25+调节性T细胞的 autoMACS，来自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)从分离的 PBMC 中纯化 CD4+CD25+Treg 细胞。 例如，首先通过用抗人 CBS、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRY/6 和 CD235a 的单克 隆抗体的混合物耗尽非CD4细胞，对PBMC中的CD4+T细胞进行阴性分离。然后用抗人CD25 抗体偶联的微珠对富集的CD4+细胞群中的人CD4+CD25+Treg进行阳性分离。如果需要，可 在纯化后用流式细胞仪确定分离细胞的纯度。在商购的细胞培养袋(Miltenyi Biotec和LIFECELL，Baxter)或细胞培养板中用 CD3/CD28 T Cell Expander Dynalbeads(Invitrogen)在重组人 IL-2 (rhIL-2，1000U/mL， R&D systems)存在的情况下对纯化的人⑶4+⑶25+Treg细胞进行活体外激活和扩增。在 X-VIV0 15培养基中培养⑶4+⑶25+Treg细胞，该培养基添加了 10%加热灭活的人AB血 清(Lonza，MD)、L-谷氨酰胺、HEPES、丙酮酸钠、青霉素、链霉素(Gibco)。每周添加2_3次 新鲜的含有rhIL-2的培养基。两周后，从Treg细胞中移走CD3/CD28微珠，然后在进行体外 鉴定和功能分析之前，在IL-2含量较低(50U/mL)的培养基中将扩增的Treg细胞静置1_2 天。某些添加剂例如雷帕霉素和/或DRB可用于富集样品并在扩增步骤中保持高纯度。人Treg细胞活体外扩增实例用autoMACS和人⑶4+⑶25+调节性T细胞分离试剂盒从PBMC纯化人 CD4+CD25+Treg细胞，PBMC来自全血或正常供体(η = 16)的Ieukopak细胞。用细胞内 Foxp3染色确定分离的⑶4+⑶25+Treg细胞的纯度。⑶4阳性细胞占纯化细胞的90%到 98%，其中平均55%为Foxp3阳性(在40 %到78%的范围内)(图1B、1C)。这些结果表 明人Treg细胞可从PBMC显著富集，其中FoXp3+Treg细胞仅占细胞数目的约1 %或⑶4+ 细胞的10% (图1A、1C)。Treg细胞的产率为PBMC的约0.5%。从测试的6种正常供体 Ieukopak细胞(2-6 X IO9PBLs)中，我们能从每个供体获得至少1 X IO7个Treg细胞。在使 用ClinMACS(Miltenyi Biotec, CA)的大规模纯化中，该结果也得到了证实。有利地，当扩 增时间为约两周时，CD4+CD25+细胞的群体相对于细胞的整体组成没有明显改变。从功能 性观点来看，希望使经过扩增的细胞群的组成足以在用于治疗时维持所需的生物效应。在
5一个实施例中，相对数量的变化不大于约10%。然后以1/3的比例用⑶3/28 T细胞扩增微珠在X-VIV0 15 培养基中(含有 rhIL2和10%的热灭活人男性AB血清)激活和扩增富集的人⑶4+⑶25+FoXp3+Treg细胞。 在小规模培养板上，人Treg细胞两周后扩增近100倍并保持其纯度，用细胞内Foxp3染色 测量(η = 15，图1D、1E)。在更大规模的细胞袋培养中(η = 10，4批使用IOOmL的Miltenyi T细胞扩增袋，6批使用0. 3至3L LIFECELL培养袋)，在2_3周内将人CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞扩增100倍以上，大约为十亿个细胞(图1F)。在扩增14天的样品中，这代表增加约 30到约300倍的倍数变化。这些结果表明，可以通过大规模活体外扩增培养获得有临床用 途的Treg细胞群。用所述的细胞内Foxp3染色评估扩增2周的人Treg细胞的纯度。在10次细胞袋 培养中，获得平均57. 3%的Foxp3阳性细胞(分别为37%、39%、45%、51.8%、62%、65%、 68%、68%、68%和 70% )。另外，这些细胞还显示出 CD27、CD25、CTLA4、GITR、HLA-DR、 CD39、CD62L、CCR4、CD49d、intergrinp7 的强效表达和 0X40、Granzyme B、CCR7 的部分 表达，但CCR5、CCR6、CCR8、CLA、⑶106呈阴性(图2)。这些结果暗示，活体外扩增的人 ⑶4+⑶25+FoXp3+Treg细胞保留了人Treg细胞的大部分表型特征。在第二周培养物中，那 些标记物的表达在Foxp3+和Foxp3-细胞群之间并无明显差别(未显示数据)。然而，在第 三周培养物中，Foxp3+细胞优先表达CD27、CD62L、CD25和CCR7 ；Foxp3+细胞中CTLA-4和 HLA-DR的表达百分比也高于Foxp3-细胞(图3A、3B)。显示活体外扩增的Treg细胞可在体外维持效力的实例为了评估活体外扩增的人⑶4+⑶25+FoXp3+Treg细胞的体外抑制功能，我们制 备了异源树突状细胞(DC)作为抗原呈递细胞并用同源的CD4+CD25-T细胞作为应答细 胞。如图4A和4B所示，活体外扩增的人CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在MLR和0KT3诱导 的T细胞增殖实验中都显示出强大的体外抑制活性。在两个实验中，扩增的人Treg细 胞均对T细胞增殖显示出剂量依赖性抑制(图4A、B)。在两个实验中，活体外扩增的人 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的大部分批次在Treg/Teffector比率为1/10到1/27时显示出 大于50%的T细胞扩增抑制(图4)。另外，扩增的人Treg细胞在0KT3实验中抑制IFNy的 生成(图4C)。这些结果表明活体外扩增的人⑶4+⑶25+FoXp3+Treg细胞保留了强大的体外 抑制活性。同时，与同源⑶4+⑶25-T细胞增殖相比，扩增的人Treg细胞对异源⑶4+⑶25-T 细胞增殖显示出同等的抑制效力(图7A、7B)。从来自PBMC的粘附细胞或CD14微珠-纯化单核细胞制备人树突状细胞(DC)， 并用 RPMI1640 培养基在使用 10% FCS、重组人 GM-CSF (50ng/mL，R& ;D systems)和 IL-4(25ng/mL, R& ；R&Dsystems)的条件下培养。细胞因子和培养基隔天更换。在第5 到第6天，收集DC细胞用于体外抑制实验。在混合淋巴细胞反应(MLR)和抗CD3抗体诱导的T细胞增殖实验中测量根据本发 明的教导内容分离的活体外扩增人Treg细胞的体外抑制活性。在MLR实验中，在96孔U 型底板上培养⑶4+⑶25-T效应细胞(1 X IO5细胞/孔)与异源人树突状细胞(1 X IO4细胞 /孔)。扩增的人Treg细胞被连续稀释并以不同的Treg/Teffector效应细胞比率添加到 培养物中，然后培养细胞6天。在培养的最后16个小时，加入3H-胸腺嘧啶核苷(IyCi/孔)。收集培养板，用Topcoimt (PerkinElmer)对3H-胸腺嘧啶核苷结合进行计数。计算三 份培养物的每分钟计数(cpm)平均值和标准偏差。用下式计算增殖的抑制百分比％抑制 =[(cpm响应细胞-cpm响应iTreg)/(cpm响应细胞)]X 100。在抗人CD3抗体(0KT3，Ebioscience)诱导的T细胞增殖实验(0KT3实验)中，在 抗人⑶3抗体(1 μ g/mL, 0KT3)存在下在96孔板上培养⑶4+⑶25-T细胞和异源DC细胞。 扩增的人Treg细胞被连续稀释，并以不同的Treg/T效应细胞比率添加到培养物中，然后培 养细胞4天。读数和抑制活性的计算与MLR实验相同。N0D/SCID小鼠异基因GVHD治疗实例在异基因GVHD模型中进一步评估活体外扩增的人⑶4+⑶25+Foxp3+Treg细胞的 体外活性，所述模型用人PBL在N0D/SCID (非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠中诱 导。通过将人PBL脾内注射进经过调整的N0D/SCID小鼠来诱导异基因GVHD。如图6A至 6C所示，移植人PBL后，受体N0D/SCID小鼠表现出GVHD样症状，例如驼背、腹泻、体重减轻， 并且小鼠通常在4周内死亡。与PBL共移植到N0D/SCID小鼠的脾脏时，活体外扩增的Treg细胞显著增加了 N0D/SCID小鼠的存活率(图6A)。8只同时接受人PBL和扩增Treg细胞的小鼠中，仅有1只 在1个月内死亡；而6只仅接受人PBL的N0D/SCID小鼠中，有5只在1个月内死亡。同时，活 体外扩增的人⑶4+⑶25+Foxp3 Treg细胞还显著降低了 N0D/SCID小鼠的GVHD症状，包括驼 背和体重减轻(图6B、6C)。另外，扩增的人Treg细胞还抑制了 hu-PBL_N0D/SCID小鼠中人 IgG和IgM的血清水平。人细胞注射后两周，含有共移植的扩增人Treg细胞的hu-PBL-NOD/ SCID小鼠(η 7)血清中人IgG和IgM的平均浓度分别为63. 04pg/mL和4. 548pg/mL,与之 相比，没有人 Treg 细胞的 hu-PBL-NOD/SCID 小鼠(η 5)为 1163pg/mL 和 16. 398pg/mL(图 6D、6E)。该结果表明扩增的Treg细胞抑制了人B细胞的激活和增殖。同时，在该研究中，扩 增的人Treg细胞和PBL来自不同的供体，这表明源自第三方的人Treg细胞在hu-PBL-NOD/ SCID模型中防止了 GVHD。将0KT3激活的正常供体PBMC皮下注射入N0D/SCID小鼠的右耳以诱导DTH样(迟 发型超敏反应)局部炎症。DTH的强度通过在细胞移植后24小时测量耳朵厚度来确定。如 图5所示，与接受相同量的PBS的阴性对照耳朵相比，0KT3激活的正常供体PBMC引起了显 著的DTH。当活体外扩增的人⑶4+⑶25+Foxp3+Treg细胞(衍生自不同的供体PBMC)与激 活的正常供体PBMC共注射时(Treg/PBMC比率为1/2)，扩增的人Treg细胞显著抑制了 0KT3 激活的PBMC引起的耳肿胀(图5)。然而，相同数量的非扩增、非Treg细胞(CD4+CD25-T细 胞)在与激活的PBMC共注射时却没有抑制耳肿胀。该结果说明活体外扩增的人Treg细胞 抑制了过继转移的局部DTH反应，指示出扩增的Treg细胞在局部组织环境中保留了其免疫 抑制活性。通过将人PBMC过继转移到N0D/SCID小鼠中所诱导的DTH根据Xu等(19)的报 告，用经过改进的方案使用人PBMC在N0D/SCID小鼠中诱导DTH响应。简而言之，将人 PBMC (IX IO7细胞)与抗人CD3抗体(0KT3，每只小鼠10 μ g, Ebioscience)混合，添加或不 添加活体外扩增的人⑶4+⑶25+FoXp3+Treg细胞(5 X IO6细胞)，然后以25 μ 1的最终体 积皮下注射(s. c.)到N0D/SCID小鼠的右耳中。将相同体积的PBS注射到相同小鼠的左耳 中作为内部对照。在细胞注射后第24小时用Series IOlOStarrett calliper(1010系列
7Starrett calliper)测量耳肿胀，耳肿胀是过继转移的人PBL的激活引起的DTH样局部炎 症。使用细胞注射前测量的耳朵厚度作为基线控制。在转移人细胞前一天，对N0D/SCID小鼠进行辐射(300rad的、辐射)。然后在 转移人细胞后的第1天、第7天、第14天和第21天，通过腹膜内注射(i. p.)将20 μ L的抗 asialoGMI抗体(Wako PureChemical，大阪，日本)注入小鼠体内。随后将来自健康正常供 体的人PBL(每只小鼠1 X IO7个细胞)单独或与活体外扩增的人⑶4+⑶25+Foxp3+Treg细 胞(每只小鼠IXlO7个细胞)混合后注射到经过调解的N0D/SCID小鼠的脾脏中，或者静 脉注射到经过调解的N0D/SCID小鼠体内。脾内移植人细胞的详细程序此前D印raetere S 等人已有描述(J. Immunol. 2001 166 =2929-2936)。每天监测小鼠的存活情况以及GVHD症 状包括驼背、痢疾和体重。细胞转移后每周从嵌合N0D/SCID小鼠采集血浆，并用ELISA试 剂盒(Alpha Diagnostic International, TX)确定人 IgG 和 IgM 水平。尽管已参考某些实施例描述了本发明，但本领域技术人员将会理解，可进行多种 改变并且可用等价物取代其要素以适应于具体的情况而不背离本发明的范围。因而，旨在 使本发明不受限于作为执行本发明的最佳方式公开的具体实施例，而是本发明将包括落入 所附权利要求书的范围和精神的所有实施例。
权利要求
一种用活体外扩增的CD4+CD25+调节性T细胞减少移植物抗宿主病效应的方法，包括以下步骤从人供体提取含有外周血单核细胞的样品，其中所述外周血单核细胞含有CD4+CD25+调节性T细胞；富集所述样品中的CD4+CD25+调节性T细胞以产生富集的CD4+CD25+调节性T细胞；扩增所述富集后的CD4+CD25+调节性T细胞群；以及将所述扩增的CD4+CD25+调节性T细胞的一部分施用于人体以治疗移植物抗宿主病。
2.根据权利要求1所述的方法，其中富集所述调节性T细胞的步骤包括从全血中分离 所述外周血单核细胞的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述分离外周血单核细胞的步骤包括密度梯度离心法。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集CD4+CD25+调节性T细胞的步骤包括通 过用抗体去除非CD4细胞来对CD4+细胞进行阴性分离的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述富集CD4+CD25+调节性T细胞的步骤包括用 抗人⑶25抗体对⑶4+⑶25+细胞进行阳性分离的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增群体的步骤实施至少一周，但少于三周。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述扩增群体的步骤实施约两周。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集CD4+CD25+调节性T细胞的步骤产 生富集的样品，相对于所述富集样品中的总细胞群，所述富集的样品的40%到78%为 ⑶4+⑶25+调节性T细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述扩增群体的步骤后，相对于所述总细胞群， 所述样品的40%到78%为⑶4+⑶25+调节性T细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述样品中所述CD4+CD25+调节性T细胞的所述 浓度在扩增前和扩增后在约10%的范围内相等。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集的CD4+CD25+调节性T细胞包括源自第 三方的人Treg细胞。
12.—种用活体外扩增的CD4+CD25+调节性T细胞减少移植物抗宿主病效应的方法，包 括以下步骤富集样品中的⑶4+⑶25+调节性T细胞，从而产生富集的⑶4+⑶25+调节性T细胞； 扩增所述分离的CD4+CD25+调节性T细胞的群体，其中所述样品中所述CD4+CD25+调 节性T细胞的纯度在扩增前和扩增后在约10%的范围内相等，以及将所述扩增的CD4+CD25+调节性T细胞的一部分施用于人体以治疗移植物抗宿主病。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增群体的步骤实施至少一周，但少于三周。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述扩增群体的步骤实施约两周。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增数量的步骤实施足够的时间以获得细 胞群的倍数变化，范围从不小于30倍的增长到不大于300倍的增长。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述倍数变化为不小于80倍的增长并且不大于 150倍的增长。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述富集的CD4+CD25+调节性T细胞包括源自 第三方的人Treg细胞。
18.一种含有复数种细胞的活体外细胞样品，其至少40%为CD4+CD25+调节性T细胞。
19.根据权利要求18所述的细胞样品，其中所述⑶4+⑶25+调 节性T细胞表达Foxp3。
20.根据权利要求19所述的细胞样品，其中所述⑶4+⑶25+调节性T细胞表达⑶27、 CD25、CTLA4、GITR、HLA-DR、CD39、CD62L、CCR4, CD49d 和 intergrinp7。
21.根据权利要求20所述的细胞样品，其中所述⑶4+⑶25+调节性T细胞不表达CCR5、 CCR 6、CCR8、CLA 禾口 CD106。
全文摘要
本发明公开了一种产生活体外扩增的CD4+CD25+调节性T细胞的方法。该方法包括从人供体提取包括外周血单核细胞的样品的步骤。所述提取的细胞中包含一定数量的CD4+CD25+调节性T细胞。增加所述CD4+CD25+调节性T细胞的相对数量，使所述Treg细胞构成样品中的大多数细胞。随后，对可能含有源自第三方的Treg细胞的所述富集的Treg细胞进行数量扩增，以产生临床上有意义的细胞群用于治疗GVHD。
文档编号A61K38/14GK101970643SQ200880118608
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月1日 优先权日2007年11月30日
发明者L·李, T·曹 申请人:特拉科斯有限公司