专利名称：PEG-干扰素-β制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及PEG化干扰素-3制剂(PEG-IFN- 3 )。
背景技术：
干扰素是一种蛋白质，业经鉴定可作为有用的药物，目前已用于例如治疗多 发性硬化症(MS)。蛋白质可在序列上加以修饰或作其它修饰，以改变或改善例如它们的活性或稳定 性。一种这样的修饰是引入与聚合物如聚乙二醇(PEG)的连接键。例如在W099/55377和EP 0 593 868 A1中已描述了连接于聚乙二醇 (PEG-IFN-^)的干扰素。在医药领域，已采取各种方法如冷冻干燥来稳定蛋白质，或制成液体药物组合物 形式。冻干材料必需在使用前重建为溶液。较容易和特别令人感兴趣的是浓缩的或即用型 液体药物组合物，因为它们应用于患者时不需要作任何进一步的制备。W095/31213和W02004/096263描述了干扰素的液体药物制剂。W02005/084303描述了干扰素lb-的偶联聚合组合物。US 6，531，122是关于含赋形剂、稳定剂和缓冲剂的PEG化干扰素变体制剂。W02004/060299提供了包含干扰素与其受体结合拮抗剂的细胞因子偶联聚合 物的合成方法。US20060051320 A1涉及用海藻糖作为冷冻保护剂制备的PEG化干扰素冻干制剂。W099/48535提供了能防止冻干过程中和冻干后PEG化干扰素-a偶联物丢失和损 害的制剂。W003002152具体涉及包含干扰素多肽和磺烷基醚环糊精衍生物的稳定组合物。以上参考文献无一公开过或提议过本发明的液体制剂。发明概述本发明一方面提供一种包含PEG化干扰素(PEG-IFN-^)、赋形剂、表面活性剂 和缓冲液的液体药物组合物，其中所述赋形剂是多元醇，所述表面活性剂是非离子表面活 性剂，所述缓冲液是乙酸钠缓冲液。本发明另一方面提供制备液体药物组合物的方法，所述方法包括在缓冲液中加入 计算量的赋形剂和表面活性剂，然后加入PEG-IFN-3。本发明另一方面提供在灭菌条件下密封、适合贮存待用的容器，该容器包含本发 明的液体药物组合物。本发明另一方面提供药物组合物的药盒，该药盒包含装有本发明药物组合物的容 器。表格和附图的简要说明L含0.044mg/ml PEG-干扰素-g的本发明制剂表1描述含0. 044mg/ml PEG-干扰素-0的各种本发明制剂。表2描述本发明制剂分别在40°C、25°C和2_8°C下的稳定性试验(SE-HPLC)，整个试验期间pH为4. 2。表3描述本发明制剂分别在40°C、25°C和2_8°C下的稳定性试验(RP-HPLC)，整个 试验期间pH为4. 2。表4描述用SE-HPLC测定本发明制剂的滴度(mcg/mL)。表5描述用SE-HPLC测定本发明制剂的滴度(mcg/mL)；过滤前后的回收百分 率％，并以图表示(
图1 %回收率表示为AF和TO回收百分率％ )。表6显示分别在25°C和2_8°C贮存4_26周后本发明制剂的pH值。表7描述本发明制剂随时间推移生物试验的结果。II.分别含0. 055和0. 110mg/ml PEG-干扰素-|3的本发明制剂这些制剂的PEG-干扰素-0含量已分别增加至0. 055and 0. llOmg/mlPEG-干扰 素。表8描述检测本发明制剂分别在40°C、25°C和2-8°C贮存下纯度的SE-HPLC试验， 整个期间pH为4. 2。表9描述检测本发明制剂分别在40°C、25°C和2_8°C贮存下蛋白含量的SE-HPLC 试验，整个期间pH为4. 2。表10描述检测本发明制剂分别在40°C、25°C和2_8°C贮存下纯度的RP-HPLC试 验，整个期间pH为4. 2。表11显示分别在25°C和2_8°C贮存4_13周后本发明制剂的pH值。表12显示分别在25°C和2_8°C贮存后随时间推移本发明制剂的生物试验数据。表13描述关于本发明PEG-干扰素制剂氧化形式肽图的数据。发明详述本发明涉及一种包含PEG化干扰素-0 (PEG-IFN- ^ )、赋形剂、表面活性剂和缓冲 液的液体药物组合物，其中所述赋形剂是多元醇，所述表面活性剂是非离子表面活性剂，所 述缓冲液是乙酸钠缓冲液。本发明一方面涉及一种包含PEG化干扰素(PEG-IFN-^)或其变体或其活性片 段、赋形剂、表面活性剂和缓冲液的液体药物组合物，其中所述赋形剂是多元醇，所述表面 活性剂是非离子表面活性剂，所述缓冲液是乙酸钠缓冲液。以下章节提供了组成本发明制剂的各种化合物的定义，在整个说明书和权利要求 书中其应用含义均相同，除非另有明确阐述的定义提供更广泛的定义。 制剂中的PEG化干扰素_ 0是任何经过聚乙二醇共价修饰或与其相当的修饰的干 扰素-0。PEG化干扰素的一个例子是PEG-干扰素，其PEG化可采用已知方法进 行，如W099/55377所述方法。具体地说，本发明的IFN-0共价结合于亲水性聚乙二醇(PEG)，也称为聚氧乙烯 (PEO)。PEG可以是两个末端都含有羟基的线性聚合物H0CH2CH20 (CH2CH20) nCH2CH20H也可采用甲氧基-PEG-OH(m-PEG)，其一个末端为相对惰性的甲氧基，而另一末端 为易受化学修饰的羟基CH30 (CH2CH20) nCH2CH20H上式中的n可以是1到几百。
在另一优选实施方式中，PEG也可以是R(PEG-0H)m表示的分枝PEG，其中R代表中 央的核心，如季戊四醇或甘油，m代表分枝臂数。分枝臂数(m)的范围为3-100个或几百个。 所述羟基易受化学修饰。本发明的另一种分枝形式见例如W096/21469中所述，其中PEG有一个易受化学修 饰的末端。此种类型的PEG可表示为(CH30PEG)pRX，其中的p等于2或3，R代表中央的核 心，如赖氨酸或甘油，X代表功能基团，如易受化学激活的羧基。本发明的另一种分枝形式称为“悬垂体PEG”，其沿PEG骨架而非在PEG链末端含
有反应活性基团，例如羧基。也可以制备在主链中带有弱的或可降解连接键的本发明的PEG-干扰素-0，如美 国专利申请06/026，716中所述。因此，可制备聚合物主链中含有易受水解的酯键的PEG。 根据下面的反应方程式，水解可导致该聚合物切断形成低分子量的片段-peg-co2-peg+h2o — -peg-co2h+ho-peg-环氧乙烷与环氧丙烷的共聚物在化学上与PEG密切相关，按照本发明可用于代替 PEG。已开发了 PEG化蛋白质的各种方法。通常采用亲电子活化PEG衍生物，可使PEG 结合于蛋白质的反应活性基团。一种方法利用赖氨酸残基的a-或氨基和N-末端产 生包括产品混合物的结合物。该结合物优选包含结合于每个蛋白质分子的1个至几个PEG分子的分子群，其数 量为1个至该蛋白质中氨基酸的数目。宜在干扰素中引入针对PEG化的位点，如Woghiren等.BioconjugateChem.， 4(5) =314-318,1991中所述，合成巯基选择性PEG衍生物。在一实施方式中，将IFN特异性PEG化。可按照EP 675 201的方法在N_末端残 基处用例如mPEG-正丙醛(proprionaldehyde)进行特异性PEG化。特别优选如Woghiren 等.Bioconjugate Chem. ,4(5) =314-318,1991 中描述的位点特异性单-PEG 化。本发明的一种实施方式是如W099/55377中所述含有共价结合于Cys17的单-PEG 化干扰素。其PEG部分可以是线性或分枝的甲氧基PEG、可水解或酶降解的PEG和PEG 的一种或多种多元醇和共聚物，以及PLGA(聚乳酸/乙醇酸)。根据本发明的一种实施方式，可使半胱氨酸的巯基与巯基反应性PEG化制剂反 应。也可以是含功能基团如二硫邻吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺、碘乙酰亚胺的PEG。优选的巯 基反应性PEG化制剂是PEG的二硫邻吡啶(0PSS)衍生物。可采用单-甲基化形式的PEG 化制剂，其中只有一个末端可用于偶联，或采用双功能形式的PEG化制剂，其二个末端可用 于偶联。在一优选的反应实施方式中，采用IFN-0-Cys17按本申请中描述的反应方案进行 反应。所述反应是针对Cys17的特定位点反应，因为IFN-0中的其它两个半胱氨酸残基(31 和141位)已形成二硫键而不能进行PEG化。PEG-干扰素的有效分子大小相当于分子 量50-110kDa(优选约70kDa)的蛋白质的分子大小。在此特定位点干扰素的修饰中， PEG分子优先结合分子量大于20kDa的蛋白。在一种实施方式中，PEG分子通过一间隔臂结 合于2x20kDa蛋白的Cys17。按照以下合成方案，此间隔臂与IFN形成IFN-PEG 2kDa_0PSS。
PEG化后将溶液纯化，以使PEG-干扰素与游离的间隔臂和/或PEG分离。优 选用超滤法进行此纯化步骤。在温度低于10°c，优选5+/-3°C，更优选4°C下进行超滤。纯 化步骤优选采用0. 1M NaOH。得到的PEG-干扰素溶液含有低于0. 5EU/ml的内毒素，更 佳为低于0. 25EU/ml内毒素。在一种实施方式中，按以下方案将PEG引入干扰素中 在一种实施方式中，将低分子量的PEG连接于干扰素。低分子量的PEG具有以下结构式ff-CH2CH20 (CH2CH20) nCH2CH2_X此式中的W和X是能独立地与胺、巯基、羧基或羟基功能基团反应的基团，使低分 子量的PEG结合于干扰素-0。W和X较佳为独立地选自二硫邻吡啶、马来酰亚胺、乙烯 砜、碘乙酰胺、胺、硫醇、羧基、活性酯、碳酸苯丙三唑、对-硝基苯酚碳酸酯、异氰酸酯和生物素。低分子量PEG优选分子量为100_5000Da的PEG。在一优选实施方式中，PEG分子 量为1000-3000道尔顿，优选1500-3000道尔顿，更优选2000道尔顿。
含有可结合干扰素的游离末端的低分子量单功能或双功能PEG的优选分子量 范围是100-200Da。优选甲氧基PEG、分枝状PEG、可水解或酶可降解的PEG、悬垂体PEG或 树枝状PEG。单功能和双功能PEG进一步具有以下结构式
Y-CH2CH20 (CH2CH20) mCH2CH2-Z此式中，Y是低分子量PEG部分游离末端上的末端反应活性基团，能与干扰素 的结合；Z是_0CH3或是能形成双功能偶联物的反应活性基团。因此，可利用2个或多个PEG分子，通过逐步方式产生用于本发明组合物和用作医 疗药物的PEG-干扰素。有益的是，PEG与IFN-0之间的二硫键在血循环中稳定，而一旦进入细胞时可被 切断。用于本发明制剂中的PEG-干扰素具有与天然干扰素大致相同或比其更 高的干扰素活性。赋形剂可以是任何多元醇，与制剂的其它组分一起产生稳定的PEG-干扰素_ 3制 剂。多元醇的例子有甘露醇(PEARLIT0L )、山梨醇(NE0S0RB )、麦芽糖醇(MALT I SORB)、 木糖醇(XYLIS0RB)和麦芽糖醇(LYCASIN)。优选的多元醇赋形剂是甘露醇。按照本发明采用非离子表面活性剂。非离子表面活性剂包括多元醇衍生物、聚氧 乙烯酯和醚、泊洛沙姆(泊洛沙姆188)、壬基苯基醚、聚乙烯醇、丙二醇二乙酸酯、链烷醇酰 胺。非离子表面活性剂可优选泊洛沙姆，特别优选泊洛沙姆188。能维持pH于所选水平的任何缓冲液均可使用。缓冲液可以是醋酸钠缓冲液或 PBS。特别优选醋酸钠缓冲液。在一个实施方案中，本发明是一种包含PEG-干扰素、赋形剂、表面活性剂和缓 冲液的液体药物组合物，其中所述赋形剂是甘露醇，所述表面活性剂是泊洛沙姆188，所述 缓冲液是醋酸钠缓冲液。干扰素可以是经受本发明的PEG化的天然人干扰素或重组产生的干扰 素-0。还有，本发明的干扰素(IFN-0)指机体对病毒感染的应答反应中产生的糖蛋 白。有报告将干扰素单位或干扰素国际单位(U或国际单位IU)作为衡量干扰素活性 的值，定义为保护50%细胞避免病毒伤害所必需的量。已报导的可用于测量其生物学活性 的试验是细胞病变作用抑制试验(Rubinstein等 1981 ；Familletti, P. C.等，1981)。在 此抗病毒试验中，约1单位/ml的干扰素是产生50%细胞病变作用所需干扰素的量。可用 美国国立卫生研究院提供的人-干扰素国际参比标准品(Pestka，S. 1986)检测其单位 量。干扰素也称为生物反应调节剂(BRM)，因为其通过免疫调节在生物体对肿瘤 的反应、感染的识别中起作用。人成纤维细胞干扰素(IFN-0)具有抗病毒活性，还能刺激自然杀伤细胞对抗肿 瘤细胞。它是一种由病毒和双链RNA诱生的约20，OOODa的多肽。已用重组DNA技术克隆 了成纤维细胞干扰素基因的核苷酸序列(Derynk等，1980)并推导出该蛋白的完整氨基酸 序列。它的长度为166个氨基酸。
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一种治疗多发性硬化症(MS)的干扰素Reb i f (Merck Serono-重组人干扰 素是从哺乳动物细胞系产生的干扰素(IFN)-0-la。它的推荐的国际非专利药品名称 (INN)是“干扰素_la”。本说明书所用的“干扰素”或“IFN-日”意指包括文献中如此定义的任何分子， 包括例如以上章节提及的任何类型IFN-日。适合本发明用的IFN-0可从商业上购得，如 Rebif (Merck Serono)、Avonex (Biogen Idee)，只要它含有 PEG 化的专用连接位点。 本发明也优选采用人来源的干扰素。本说明书所用的术语干扰素包括其盐、功能衍生 物、变体、突变蛋白、同类物和活性片段。本说明书所用的术语“干扰素(IFN-旧”，指包括成纤维细胞干扰素，特别是人 来源的，例如从生物体液分离获得的，可用DNA重组技术获自真核宿主细胞的干扰素，用其 盐、功能衍生物、变体、同类物及活性片段。优选的干扰素指干扰素_la。本说明书所用的术语"突变蛋白"，指IFN-0的同类物以及天然IFN-0的一个 或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代或缺失或在IFN-3的天然序列中加入一个或多 个氨基酸残基的PEG-IFN-0，但它们所产生的产物与野生型IFN-0相比活性无显著改变。 可用已知的合成技术或定点诱变技术，或已知的任何其它合适的技术制备这些突变蛋白。 优选的突变蛋白包括，例如Sh印ar等(1981)或Mark等(1984)所描述的那些。具体说，本 发明的突变蛋白分子中含有Cys17同时含有上述变化的任何一种变化。任何这类突变蛋白其氨基酸序列优选充分复制了 IFN-0的序列，例如具有与 IFN-3基本相似或甚至更好的活性。本领域技术人员熟知干扰素的生物学功能，其生物 标准品业已建立可从美国国立卫生院生物标准品和控制中心(http://immunoloRy. org/ links/NIBSC)购得。测定IFN-0/PEG-IFN-0活性的生物学试验已有报导。例如可按照Rubinstein， 1981等人所描述的进行干扰素测定。因此，可用常规实验检测任何给定的突变蛋白是否具 有与IFN-0基本相似或甚至更好的活性。可用于本发明的IFN-0突变蛋白和PEG-IFN-0或其编码核酸包括有限的一组基 本相对应的序列，如本领域普通技术人员根据本说明书提供的说明和指导，无需过多实验， 即可常规获得的取代肽或多聚核苷酸。本发明突变蛋白的优选变化是称之为"保守性"的取代。本发明多肽或蛋白质的 保守性氨基酸取代可包括同义组中的氨基酸取代，它们具有充分相似的理化特性，同组成 员之间的取代保留了分子的生物学功能。很清楚，在上述序列中可制作一些氨基酸插入或 缺失而不改变它们的功能，特别是，如果这些插入或缺失只涉及到少数氨基酸，如30个以 下，优选10个以下，并且不移动或替换对于功能构象至为关键的氨基酸，如半胱氨酸残基。 这种缺失和/或插入所产生的蛋白和突变蛋白落入本发明的范围。在蛋白中产生氨基酸取代，可用于获得本发明所用的PEG-IFN- 0突变蛋白，其例 子包括任何已知的方法步骤，例如参见授予Mark等人的美国专利4，959，314,4, 588，585和 4，737，462，授于Koths等人的5，116，943，授于Namen等人的4，965，195，授于Chong等人的 4，879，111和授于Lee等人的5，017，691。赖氨酸取代蛋白参见美国专利4，904，584(Shaw 等)。IFN-0的特有突变蛋白已有描述，例如可参见Mark等人.，1984。本说明书所用的"功能衍生物"包括PEG-IFN-0衍生物和它们的突变蛋白及融
9合蛋白，可用本领域已知方法，从氨基酸残基侧链的功能基团或N-或C-末端基团加以制 备。只要它们仍然是药学上可接受的，即蛋白活性未受破坏基本上类似于IFN-0的活性， 并且不使包含它的组合物产生毒性，这些蛋白质均包括在本发明中。这些衍生物，例如可包 括与羧基的脂肪族酯、羧基与氨或伯胺或仲胺反应所产生的酰胺，氨基酸残基的游离氨基 与酰基(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物或游离羟基(例如丝氨酰或苏氨 酰残基的羟基)与酰基形成的0-酰基衍生物。作为PEG-IFN-0的"活性部分"，或突变蛋白和融合蛋白，本发明包括该蛋白分 子多肽链的任何片段或前体，它们无论是单独的或与其连接的分子或残基(例如糖残基或 磷酸残基)一起，或该蛋白分子或糖残基本身的聚集体，只要所述部分的活性不显著低于 相应的IFN。术语“盐"本说明书用于指上述蛋白质或其同类物的羧基盐或氨基的酸加成盐。 羧基盐可用本领域已知的方法形成，包括无机酸盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等 等；与有机碱，例如胺类如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等形成的那些盐。酸 加成盐包括，例如，与无机酸如盐酸或硫酸形成的盐；与有机酸，例如乙酸或草酸形成的盐。 当然，任何这些盐必须保留本发明相关蛋白质(IFN)的生物学活性，即能结合相应的受体 和启动受体信号传递。在还有一实施方式中，本发明组合物所含的融合蛋白包括Ig融合。这种融合可以 是直接融合，或通过一短接头肽融合，此短肽长度可为1-3个氨基酸残基或更长，例如长度 为13个氨基酸残基。所述接头可以是例如在IFN序列与免疫球蛋白序列之间引入的三肽 序列 E-F-M(Glu-Phe-Met)，或 13 个氨基酸 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的接头序列。所产生的融合蛋白可具有如下改善的性能，例如，在体液中的驻 留时间(半寿期)延长，比活性增加，表达水平提高或有利于该融合蛋白的纯化。所述组合物中的PEG-IFN-3浓度以约0. lmg/ml-0. 01mg/m为宜，优选约0. 06mg/ ml-O. 03mg/ml，甚至更优选约0. 044mg/ml的浓度。在另一实施方式中，所述制剂中的PEG-IFN-0浓度为0. 05-0. 150mg/ml，优选 0.055 或 0. 110mg/mlo组合物中所用的剂量或其可应用于个体的剂量因各种因素而异，包括药代动力学 特性、给药途径、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况和个头大小)、症状程度、同 时进行的治疗、治疗的频率和需要达到的效果。人用IFN-0/PEG-IFN-0 的标准剂量范围是每天 80000IU/kg-200000IU/kg 或 每人每天6MIU (百万国际单位)-12MIU，或相当于每人22-44 y g (微克)IFN- ^。按照本 发明，本发明组合物中的PEG-IFN-3所用量为相当于IFN-3优选约1-50 yg，更优选约 10-30 u g,或每人每天约10—20 u g0可通过静脉内、肌肉内、皮下途径给予本发明的活性成分。本发明组合物的优选给 药途径是皮下和肌肉内途径。也可每天、隔天或不经常给予本发明的PEG-IFN-0组合物。优选每周一次、二次 或三次给予PEG-IFN-0组合物。优选每二周给药一次。优选的给药途径是皮下给药，例如一周给予三次。另一优选的给药途径是肌肉内 给予，例如可一周一次。
优选皮下注射一周三次给予本发明的PEG-IFN-0组合物，相当于22-44 iig或 6MIU-12MIU 的 IFN-3。皮下给予PEG-IFN-0组合物的剂量为每隔一天25-30iig或8MIU-9. 6MIU。还可 一周一次肌肉内给予相当于30 ii g或6MIU IFN- 0的PEG-IFN- ^组合物。术语“稳定性”指本发明干扰素制剂的物理、化学和构象稳定性(包括生物效应的 维持)。导致蛋白制剂不稳定的原因有蛋白分子的化学降解或聚集形成较高等级的聚合物、 去糖基化、糖基化修饰、氧化或其它任何结构修饰，它们导致本发明干扰素多肽的至少一种 生物学活性降低。“稳定的"组合物、溶液或制剂是其中蛋白质的降解、修饰、聚集程度、生物学活 性的丧失等是可接受地得到控制，并且不随时间的推移而增加至不可接受的程度。优选在 12-24月内保留标记干扰素活性的至少或约60%，更优选至少或约70%，最优选至少或约 80%。当在2-8°C贮存时，优选的本发明PEG-IFN-0组合物的半寿期较佳约为至少6个月、 12个月、18个月，更佳为至少20个月，还要更佳为至少约22个有，最佳为至少约24个月。监测本发明的液体PEG-IFN-0药物组合物稳定性的方法在本技术领域可以获 得，包括本说明书描述的那些方法。因此，通过检测溶液中可溶性PEG-IFN-0随时间的变 化，不难测定本发明的液体药物组合物在贮存期间PEG-IFN-0聚集物的形成状况。采用适 合于检测颗粒性PEG-IFN-0的各种分析试验法可测定溶液中可溶性多肽的含量。这类试 验包括，例如以下实施例中描述的反相(RP) -HPLC和UV吸收分光光度法实现对贮存期间液体组合物中可溶性和不溶性聚集物的检测，例如，可采用以下 实施例中阐述的分析型超离心法，以区分可溶性聚集物形式存在的可溶性多肽部分与不聚 集的生物活性分子形式存在的部分。术语“缓冲液”或“生理上可接受的缓冲液”指制剂中所含的对医用或兽用安全、 能有效维持或控制该制剂pH在制剂所需pH范围内的化合物溶液。控制pH在温和酸性pH 的可接受的缓冲液包括但不限于诸如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、TRIS和组氨酸缓 冲液。“TRIS”指2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇及其药学上可接受的盐。优选的缓冲液 是含盐水或可接受的盐的乙酸盐缓冲液。赋形剂优选以约30mg/ml-50mg/ml的浓度存在，更优选约40mg/ml-50mg/ml的浓 度，甚至还要优选约45mg/ml的浓度。表面活性剂的浓度以约0. lmg/ml-lmg/ml为宜，优选浓度约0. 4mg/ml-0. 7mg/ml, 甚至更优选浓度约0. 5mg/ml。术语“表面活性剂”指能降低液体表面张力或降低二种液体或液体与固体之间界 面张力的可溶性化合物，表面张力是作用于液体表面，倾向于使表面面积降至最小的力。表 面活性剂有时用于药物制剂，包括递送低分子量药物和多肽，以改善药物的吸收或向靶组 织的递送。熟知的表面活性剂包括聚山梨酯(polysorbates)(山梨醇脂肪酯的聚氧乙烯衍 生物Tween )和泊洛沙姆，如德国BASF的普奴尼克Pluronic 或Lutrol 。按照本发明的优选实施方式，发现配制PEG-IFN-0采用的表面活性剂选自 Pluronic F77、Pluronic F8、Pluronic F88 和 Pluronic F68，特别优选 Pluronic F68 (BASF, Pluronic <g)F68也称为泊洛沙姆188)时，获得的稳定制剂最大程度减少了因 吸附于小瓶和/或递送装置(如针管、泵、插管等)表面所造成的活性成分丢失。也发现用选自 Pluronic F77、Pluronic F87、Pluronic F88 和 Pluronic F68，特别 优选Pluronic； F68(BASF，Pluronic F68也称为泊洛沙姆188)的表面活性剂配制 PEG-IFN-0时，获得的稳定组合物更能抵制氧化和蛋白聚集体的形成。Pluronic; :表面活性剂是环氧乙烷(E0)与环氧丙烷(P0)的嵌段共聚物。环氧丙 烷嵌段(P0)夹心在二个环氧乙烷(E0)嵌段中。 在Pluronic ; F77中，聚氧乙烯(亲水)百分比为70%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量约2，306Da。在Pluronic F87中，聚氧乙烯(亲水)百分比为70%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量约2，644Da。在Pluronic F88中，聚氧乙烯(亲水)百分比为80%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量约2，644Da。在Pluronic ; F68中，聚氧乙烯(亲水)百分比为80%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量约1，967Da。本发明组合物中也可采用性质与普奴尼克(Pluronic)系列类似的其它聚合物。 优选的表面活性剂是Pluronic F68和具有类似性质的表面活性剂。Pluronic，特别是Pluronic ; F68，优选以在整个贮存期间(例如12-24个月)足 以维持PEG-IFN-0稳定性的浓度存在，也以足以防止蛋白质因吸附于表面(如小瓶、安瓶 或插管、针管表面)而损失的浓度存在。液体制剂中Pluronic <g),特别是Pluronic F68的优选浓度是或约0. Olmg/ ml-10mg/ml，更优选是或约0. 05mg/ml-5mg/ml，还要特别优先是或约0. lmg/ml-2mg/ml，最 优选是或约lmg/ml。在另一优选实施方式中，采用甲硫氨酸，具体是L_甲硫氨酸。具体的使用浓度 为 0. lmg/ml-0. 5mg/ml,优选的浓度约为 0. lmg/ml-0. 3mg/ml,更优选约 0. 25mg/ml 或约 0. 12mg/ml。甲硫氨酸的加入被发现有利于制剂的进一步稳定并减少蛋白质氧化。本发明制剂中所含或包含的各种化合物可如上文所述进行改变，仍可实现甲硫氨 酸的正面作用。在一实施方式中，该制剂包含或含有O.O55mg/mlPEG-IFN-0 UOmM乙酸钠 缓冲液(pH 3. 5-4. 5、优选pH4. 2)、45mg/ml甘露醇和0. 5mg/ml泊洛沙姆188，或者可包含 0. 110mg/ml PEG-IFN-旦。本发明的组合物含有足够量的缓冲剂以维持所述组合物的pH在特定pH的士0. 5 单位。该特定PH是约3. 0-5.0，优选所述pH是约3.5-4.5，甚至更优选所述pH是约 4. 2 士 0. 2。本发明组合物中的缓冲液浓度约5mM-500mM，优选浓度约10mM。
所述组合物以水溶液为宜。本发明包括液体组合物。优选的溶剂是注射用水。调节PEG-IFN- 0组合物的pH至约pH3-5，优选至约3. 5-4. 5，更优选至约 4. 2+/-0. 2，可显示能提供稳定的制剂。本发明的组合物达到对PEG-IFN-0降解过程有正面影响，而这一降解过程在液 体组合物中是起负面影响的。可分别在例如40°C和25°C用SE-HPLC检测这种影响。本发 明的组合物观察到PEG-IFN-0含量(SE-HPLC)无明显减少，特别是40°C二周和25°C六周 PEG-IFN-^含量无减少。本发明组合物显示了良好的稳定特征，特别是实现了贮存期蛋白 质聚集减少。玻璃小瓶(优选3ml)或玻璃针管(优选1ml)中制备的包含0. 044mg/ mlPEG-IFN-3、pH约4. 2的10mM乙酸钠缓冲液、45mg/ml甘露醇和0. 5mg/ml泊洛沙姆188 的组合物，特别可达到正面效果。用SE-HPLC、RP_HPLC测定纯度，用SE-HPLC测定蛋白含量和生物学活性检测，显示 本发明组合物良好的稳定性。另一方面，本发明涉及制备上述液体药物组合物的方法，其中所述方法包括在缓 冲液中加入计算量的赋形剂和表面活性剂，然后加入PEG-IFN-3。还有另一方面，本发明涉及在无菌条件下密封的适合贮藏待用的容器，该容器包 含本发明的液体药物组合物。任何适合医用的容器均可采用。所述容器优选预充填的针管、自动注射器用的小 瓶或药筒。可用已被认可的装置给予本发明的制剂。包含这些单个小瓶系统的例子包括递送 溶液的自动注射器或注射笔装置，如Rebiject 。本申请要求保护的产品包括包装材料。包装材料除管理机构要求提供的信息外， 还提供该产品使用的条件。本发明的包装材料向患者提供使用说明书，如果需要，也提供制 备二个小瓶干/湿产品最后溶液和在24小时内或更长时间内使用该最后溶液的说明。对 于单个小瓶溶液产品，标签上指明该溶液可在24小时或更长时间内使用。本申请要求保护 的产品是人用的药物产品。向患者提供的组合物是澄清溶液。按照本发明，PEG-IFN-0可通过各种递送方法给予患者，包括SC或IM注射、透皮、 经肺、经粘膜、植入、渗透泵、注射药筒、微型泵、口服或本领域熟知的、技术人员认可的其它 方式。另一方面，本发明涉及药物组合物的药盒，该药盒包含充装了本发明药物组合物 的容器。所述容器优选作为递送装置的针管。本说明书引用的所有参考文献，包括杂志文章或摘要，公开或未公开的美国或外 国专利申请，批准的美国或外国专利或其它参考文献，它们的内容通过引用整体纳入本说 明书，包括所引用参考文献中提供的所有数据、表格、附图和正文。此外，本说明书引用的参 考文献中所引用的参考文献，其全部内容也整体纳入本说明书作为参考。以下通过实施例阐述本发明，这些实施例并不构成对本发明范围的限制。实施例
以下实施例将描述本发明的优选实施方式。1. PEG-IFN- P偶联物的制各以下流程说明了 PEG-IFN-3的制备实例PEG-IFN合成和钝化的流稈 PEG 2k OPSS = (2-吡啶基二硫醇)2-PEG-2KPEG (20K) 2 = HS_ 半胱酰胺-赖氨酸-(PEG-20K) 2PEG-IFN合成和钝化的流稈 2.制剂用PEG-IFN-0 la 配制 PEG-IFN-0 组合物。通过 0. 22um 膜(Durapore)过滤溶液， 过滤到最终的容器(1ml小瓶或针管)中。受试组合物含0. 044mg/ml PEG-IFN- 3 la、10mM 乙酸钠缓冲液(pH4. 2)、45mg/ml 甘露醇和0. 5mg/ml泊洛沙姆188。或者，含0. 055或0. 110mg/ml PEG-IFN- ^ la和可加入 甲硫氨酸。将受试组合物的样品分别贮存在40°C、25°C和2_8°C并进行测试，用SE-HPLC或 RP-HPLC检测纯度，用SE-HPLC检测蛋白含量，用依据IFN-0诱导细胞保护作用的抗病毒试 验检测生物学活性，并测PH随时间的变化，以及用肽图/UPLC分析测肽的氧化形式。3.稳定性试验和其它实验3. 1.纯度和 SE-HPLC 测定用SE-HPLC在Shodex柱(Aqueous SE公司，编号KW-803)上评估纯度；用水10倍 稀释PBS 10x(Gibco BRL公司，编号70013-016)制备PBS lx，以1. OmL/分等渗方式进行洗 脱；用紫外光UV于214nm进行检测。注射IFN-PEG制剂样品，采用以下注射体积200mcL (对于44和55mcg/mL样品)； 100mcL (对于 110mcg/mL 样品)。该试验用对照参比标准品PS200-01 (单点试验)进行蛋白质定量测定。3. 2. RP-HPLC 测定纯度用RP-HPLC 在 35°C恒温下，在 C4 柱(Symmetry 300C4，5m size4. 6x250mm, Waters 公司)上进行纯度检测。波长设置为214nm，用以下条件以lmL/分流速进行洗脱
移动相A= 0. 1% TFA/ 水；B = 0. 1 % TFA/ 乙腈梯度30%—70% B,40 分钟 注射IFN-PEG制剂样品，采用以下注射体积160mcL (对于44mcg/mL样品)； 200mcL (对于 55mcg/mL 样品)；lOOmcL (对于 110mcg/mL 样品)。3. 3.生物学活性(体外试验)用现有检测IFN-0的方法测定生物学活性，这是一个抗病毒试验，基于IFN-3可 诱导细胞(WISH细胞，人羊膜组织细胞)保护抵御病毒(水泡性口膜炎病毒)的细胞致病 作用。3. 4.pH 测定用校准的pH计(Mettler-Toledo公司，713型)按照标准操作方案进行pH检测。3. 5.用肽图/UPLC分析氧化形式定量测定被氧化的甲硫氨酸残基(Met 1, Met 117, Met 36)的方法可预见 IFN-PEG样品的蛋白水解消化情况，采用内蛋白酶Lys-C消化然后作梯度UPLC分析；蛋白 水解前对制剂样品作预处理去除基质组分的干扰。在AcquityUPLC分析柱(BEH C18 1, 7um 2. 1x50mm cod. 1860002350，Waters 公 司)上分离蛋白水解混合液；用0. TFA/水(A1)和0. TFA/乙腈(B1)作梯度洗脱。可采用以下仪器设置和分析参数 表1PEG-IFN-3 制剂组合物(mg/mL) 0大体积组合物中也残留有PBS缓冲液(由于5倍稀释PEG-IFN药品)。表2SE-HPLC测定的纯度％ 表3RP-HPLC测定的纯度％表4 SE-HPLC测定的滴度(mcg/ml)
表6pH测定 表7生物检定(MIU/mL) 表8SE-HPLC测定的纯度(％ ) 表10RP-HPLC测定的纯度(％ ) 表13肽图/UPLC显示的氧化形式(％ ) 参考文献1. Derynk R.等，Nature 1980 ；285, 542-547 2. Familletti，P. C.，Rubinstein，S.和 Pestka，S ； 1981 “干扰素的方便快速细胞 病变效应抑制试验”，Methods in Enzymology，78 卷(S. Pestka，主编)，Academic Press, New York,387-394o3. Mark D. F 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,81 (18) 5662-5666 (1984)。4. Pestka, S. (1986) “干扰素的标准品和通用缩写”，Methods inEnzymology (S. Pestka,主编)，Academic Press, New York 119,14-23。5. Rubinstein, S.，Familletti, P. C 和 Pestka, S ；“干扰素的简便试验”，J. Virol 1981 ；37，755-758。6. Sh印ard H. M 等，Nature 1981 ;294，563-565。7.Woghiren 等，Bioconjugate Chem. , 4 (5) :314_318，1993。
权利要求
一种液体药物组合物，包含PEG化干扰素-β(PEG-IFN-β)或其突变蛋白或活性片段、赋形剂、表面活性剂和缓冲液，其中所述赋形剂是多元醇，所述表面活性剂是非离子表面活性剂，所述缓冲液是乙酸钠缓冲液。
2.如权利要求1所述的组合物，包含PEG-IFN-0、赋形剂、表面活性剂和缓冲液，其中 所述赋形剂是甘露醇，所述表面活性剂是泊洛沙姆188，所述缓冲液是乙酸钠缓冲液
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述PEG-IFN-0的浓度约为O.Olmg/ ml-0. lmg/ml0
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述PEG-IFN-0的浓度约为0. 044mg/ml、 0.055mg/ml 或 0. 110mg/mlo
5.如以上权利要求任何一项所述的组合物，其中所述PEG-IFN-0包含线性或分枝性 PEG，优选分枝性PEG。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述PEG的分子量为至少20kDa，优选至少40kDa， 更优选40kDa。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述PEG-IFN-0含有间隔臂。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述间隔臂的分子量为100-5000道尔顿，优选 1500-2500道尔顿，更优选2000道尔顿。
9.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度为约30mg/ml-50mg/ml。
10.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度为约40mg/ml-50mg/ml。
11.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度为约45mg/ml。
12.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.lmg/m-lmg/ml。
13.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.4mg/ ml-0. 7mg/ml。
14.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.5mg/ml。
15.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述缓冲液的量足以维持所述组合物的pH 在特定PH的士 0. 5单位，所述特定的pH是约3. 0-5. 0。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述pH是约3.5-4. 5。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述pH是约4.2士0. 2。
18.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述缓冲液的浓度为约5mM-500mM。
19.如权利要求16所述的组合物，其中所述缓冲液的浓度为约10mM。
20.如以上权利要求任何一项所述的组合物，其中所述组合物是一种水溶液。
21.如以上权利要求任何一项所述的组合物，其中所述组合物还包含甲硫氨酸。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述甲硫氨酸的浓度为0.10-0. 50mg/ml，优选 0. 20-0. 40mg/ml，更优选 0. 12 或 0. 25mg/ml。
23.一种制备权利要求1-22中任何一项所述液体药物组合物的方法，其特征在于，所 述方法包括在所述缓冲液中加入计算量的赋形剂和表面活性剂，然后加入PEG-IFN-3。
24.一种适合于贮存待用的在无菌条件下密封的容器，包含权利要求1-22中任何一项 所述的液体药物制剂。
25.如权利要求24所述的容器，其中所述容器是预装填的针管或自动注射器用的小2瓶。
26. —种药物组合物的药盒，该药盒包含充装了权利要求1-22中任何一项所述药物组 合物的容器。
全文摘要
本发明涉及一种液体药物组合物，该组合物包含PEG化干扰素-β(PEG-IFN-β)、赋形剂、表面活性剂和缓冲液，其中所述赋形剂是多元醇，所述表面活性剂是非离子表面活性剂，所述缓冲液是乙酸钠缓冲液。
文档编号A61K47/48GK101878043SQ200880118584
公开日2010年11月3日 申请日期2008年12月18日 优先权日2007年12月20日
发明者A·德尔里奥, J·里查德 申请人:默克雪兰诺有限公司