一种采用猪脾脏高效生产精制猪白细胞干扰素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用猪脾脏高效生产精制猪白细胞干扰素的方法，属生物制药【技术领域】。方法为采集猪新鲜脾脏，-10℃以下冻存；用时融化、粉碎、洗涤、消化、分离白细胞；加入新城鸡瘟病毒，发酵罐诱导发酵培养，经分离、病毒灭活，制成粗制猪白细胞干扰素；离子交换和高压反向层析纯化，制成精制猪白细胞干扰素原液；真空冷冻干燥制剂，即制成精制猪白细胞干扰素粉针。精制猪白细胞干扰素属纯天然生物制品，具有抗病毒及增强机体免疫力作用，可用于猪瘟、蓝耳病、腹泻等多种病毒性传染病的防治。本发明利用猪脾脏取代猪血作原料进行精制猪白细胞干扰素生产，工艺简便，产品质量好，成本低，为猪白细胞干扰素的生产开辟了一条新的途径。
【专利说明】一种采用猪脾脏高效生产精制猪白细胞干扰素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用猪脾脏作原料高效生产精制猪白细胞干扰素的方法，属于采用细胞分离技术、组织培养技术、诱导发酵技术及制剂技术对猪脾脏进行深加工的生物制药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]猪白细胞干扰素是一种纯天然的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫力功能的细胞因子，同时具有使用安全、治疗效果好、生产成本低等特点，临床用于猪病毒性高热病、瘟病、蓝耳病、腹泻等多种传染性疾病的防治，收到了满意效果。
[0003]目前市场销售和使用的猪白细胞干扰素多采用猪血白细胞作原料生产制备的粗制品。由于猪血收集困难，不易大量储存，且产品未经任何纯化提取，含有大量细胞组织、培养基及其它未知病原微生物等有害成分，导致其生物活性低(每ml仅含干扰素1-2万活性单位)，临床治疗效果差。因此有必要在扩大猪白细胞来源的同时，进一步将粗制猪白细胞干扰素提取纯化，以改进产品质量，提高治疗效果，满足日趋严重的家畜病毒性传染病防治的需要。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于采用猪脾脏代替猪血作原料分离白细胞，经诱导发酵、层析分离纯化，高效生产精制猪白细胞干扰素，从而拓宽了猪白细胞干扰素生产原料的来源。该方法生产的精制猪白细胞干扰素生物活性高(每ml可含干扰素数百万活性单位)，副作用小、治疗效果好，且生产原料来源广、取材方便、易于储存、工艺简捷、回收率高、成本低，便于规模化、标准化和工业化生产。
[0005]上述目的是这样实现的:采集健康猪新鲜脾脏，-1O0C以下冰冻保存；使用时室温无菌水浴融化，剥离脾脏表面的脂肪和结缔组织；粉碎后加入含卡那霉素和庆大霉素的磷酸盐缓冲液洗涤，4°C 2000rpm离心15分钟离心；加入0.25 %胰蛋白酶，37°C保温消化30分钟；用不含抗生素的缓冲液洗涤2次，不锈钢滤网过滤，4°C 2000rpm离心15分钟，收集白细胞沉淀物；用MEM培养液稀释细胞沉淀物，制备成107/ml浓度的白细胞悬液，注入到发酵罐中，同时加入新城鸡瘟病毒(NDV)诱导剂，浓度为100血凝单位/ml ;37°C，pH6.0-7.0，300rpm，通气量3-5L/分，容氧度40-50%，诱导培养发酵18-20小时；4°C，4000rpm离心30分钟收集上清；用盐酸调pH至2.0,4.(TC放置3天,灭活病毒,再用氢氧化钠调pH至6.8,4°C，4000rpm离心30分钟收集上清，即粗制猪白细胞干扰素原液；先经阴离子层析，再经高压反向层析纯化，收集洗脱锋即精制猪白细胞干扰素原液；0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌制剂，无菌分装真空冷冻干燥即制备成精制猪白细胞干扰素粉针。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]采用猪脾脏高效生产精制猪白细胞干扰素的方法步骤如附图所示。【具体实施方式】
[0007]采用猪脾脏高效生产精制猪白细胞干扰素【具体实施方式】如下:
[0008]1、从猪脾脏分离白细胞
[0009](I)无菌采集健康猪新鲜脾脏，-1O0C以下冰冻保存备用；
[0010](2)使用时室温无菌水浴融化，剥离脾脏表面的脂肪和结缔组织，用组织粉碎机粉碎成1-2mm3碎块；
[0011](3)加入含庆大霉素40单位/ml、卡那霉素150 μ g/ml的ρΗ6.8的磷酸盐缓冲液洗涤，4V 2000rpm离心15分钟，收集细胞组织沉淀物；
[0012](4)加入0.25%胰蛋白酶，37°C保温消化30分钟；
[0013](5)用不含抗生素的磷酸盐缓冲液洗涤2次，不锈钢滤网过滤，4°C 2000rpm离心15分钟，收集白细胞沉淀物。
[0014]2、诱导发酵制备粗制猪白细胞干扰素原液
[0015](I)用MEM培养液稀释白细胞沉淀物，制备成白细胞悬液，注入到发酵罐中，同时加入新城鸡瘟病毒(NDV)诱导剂，浓度为100血凝单位/ml ；
[0016](2)启动发酵 罐，370C，ρΗ6.5-7.0, 300rpm,通气量 3-5L/ 分，容氧度 40-50%，诱导培养发酵18-20小时；
[0017](3)4°C，4000rpm离心30分钟，收集上清；
[0018](4)加入盐酸调pH至2.0，4.(TC放置72小时，灭活病毒；
[0019](5)用氢氧化钠调pH至6.8，4°C，4000rpm离心30分钟，收集上清，即粗制猪白细胞干扰素原液。
[0020]3、层析纯化制备精制猪白细胞干扰素原液
[0021](I)将粗制猪白细胞干扰素原液上DEAE Sepharose FF柱，15_20ml/分，用Nacl缓冲液作0.1-0.6M/L线性梯度洗脱，流速IOml/分，收集洗脱峰；
[0022](2)将收集的洗脱峰调pH4.0，上C4高压反向层析柱，15_20ml/分，用盐酸缓冲液作pH4-7线性梯度洗脱，流速IOml/分，收集洗脱锋即精制猪白细胞干扰素原液；
[0023](3)用氢氧化钠调pH7.0,0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，分装后置_20°C以下冰箱冻存备用，同时留样做质量检定。
[0024]3、精制猪白细胞干扰素制剂
[0025](I)用PH6.8,0.02M/L磷酸盐缓冲液作稀释液，按配方加入保护剂、稳定剂和赋形剂，即猪白细胞干扰素半成品；
[0026](2)用磷酸或氢氧化钠调pH至6.5-7.5,0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌；
[0027](3)无菌分装，真空低温冷冻干燥后封口，即精制猪白细胞干扰素粉针。
【权利要求】
1.用猪脾脏取代猪血作原料分离白细胞，诱导生产猪白细胞干扰素，其特征在于:扩大了猪白细胞干扰素生产原料来源，且猪脾脏采集方便，易于储存，便于生产规模的扩大。
2.将猪脾脏无菌粉碎成l_2mm3碎块，加入0.25%胰蛋白酶，37°C保温消化30分钟，缓冲液洗涤2次，不锈钢滤网过滤，4°C 2000rpm离心15分钟，收集沉淀物即猪白细胞，其特征在于:经酶消化分离得到的猪白细胞，分散性好，活力高，更加适合发酵培养和干扰素的诱导生产。
3.采用发酵罐发酵技术对从猪脾脏分离的白细胞进行培养和诱导发酵，其特征在于:猪白细胞干扰素产量高，生物活性好，生产可控性强，培养物不易被外源病原微生物及其它有害物质污染。
4.采用离子交换及高压反向层析方法将粗制猪白细胞干扰素纯化成精制猪白细胞干扰素，其特征在于:纯化方法简便、成本低，且精制猪白细胞干扰素纯度好、活性高、副作用小，临床用于猪瘟、蓝耳病、腹泻等多种病毒性传染病的防治，效果优于粗制猪白细胞干扰素。
【文档编号】C07K1/18GK103923960SQ201310008071
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月10日 优先权日:2013年1月10日
【发明者】李广善, 傅李芳 申请人:北京紫辰医药生物技术研究所