一种包含干扰素α-缀合物的抗癌用药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗癌用药物组合物及该抗癌用药物组合物与抗癌剂联合给药在治疗癌症中的用途。所述抗癌用药物组合物包含α干扰素或其高分子聚合物缀合物。与现有的α干扰素相比，本发明的作为高分子聚合物缀合物之一的干扰素α-缀合物在体内半衰期得到延长，抗癌活性更为优秀，尤其是与吉西他滨之类抗癌剂联合给药时，在抑制癌细胞增长及增殖方面表现出协同作用，由此显示极为优异的抗癌活性。此外由于本发明抗癌用药物组合物在体内的半衰期和抗癌活性优异，能够显著减少给药次数和频度。通过联合给药抗癌活性优异的干扰素α-缀合物和抗癌剂，能够降低抗癌剂给药量，减少抗癌剂的副作用，并且提高患者对治疗的顺应性。
【专利说明】一种包含干扰素α-缀合物的抗癌用药物组合物
【技术领域】
[0001]本发涉及一种包含α干扰素或其高分子聚合物缀合物的用于预防癌症或治疗癌症的药物组合物及该药物组合物与抗癌剂联合给药在治疗癌症中的用途。
【背景技术】
[0002]人干扰素为细胞因子的一种，是通过激活体内免疫反应活性及癌细胞的细胞凋亡来抑制病毒、癌细胞等的增殖的蛋白质。根据产生细胞的种类干扰素分为α干扰素、β干扰素及Y干扰素，尤其是α干扰素是由B淋巴细胞(B lymphocytes)、无标志淋巴细胞(Null lymphocytes)以及巨卩遼细胞(Macrophage)产生,具有抗病毒活性、抗癌活性、激活NKNK(Nature Killer)细胞以及抑制骨髓细胞活性等功能。
[0003]目前,通过利用基因重组人α干扰素的临床实验结果，已知干扰素具有治疗多种实体癌的作用。两种重组DNA技术制得的干扰素正在市售并使用(重组干扰素a_2b (干扰素A (Intron A)，先灵公司)、重组干扰素a _2a (罗扰素(Roferon)，罗氏制药股份有限公司))。干扰素A作为处方跟手术并用于治疗恶性黑色素瘤，跟蒽环类化学疗法联用于治疗侵略性滤泡非霍奇金淋巴瘤(aggressive follicular Non-Hodgkin's Lymphoma),且用于尖锐湿疣、毛细胞白血病及艾滋病(AIDS)相关的卡波希氏肉瘤病变治疗。罗扰素作为处方用于费城染色体阳性(Philadelphia chromosome positive)慢性骨髓性白血病(CML)及艾滋病(AIDS)相关的卡波西氏肉瘤的治疗。另外，已知对膀胱癌(Bladder cancer)(Torti, F.Μ.等，J.clin.0nc0.，3，506-512，1985 年)、肾癌(Vugrin, D.等，Cancer treat.Rep.,69,817-820, 1985年)等也有疗效。最近，用聚乙二醇(PEG)修饰的干扰素作为恶性黑色素瘤治疗剂获得临床认可。不过由于半衰期短、药效差，天然α干扰素或PEG修饰α干扰素被认为抗癌效果差。
[0004]癌(cancer)作为细胞非正常生长的状态，其不能根据基因表达的多种变化正常调控细胞死亡。癌渗透到相邻组织中破坏组织并转移到其他部位，是最终导致死亡的疾病。已知癌细胞具有非正常分裂、分化的性质，能够在人的任一组织中发生，由一种因素或共同作用的多种因素诱发。这些因素包括各种化学物质、放射线等环境因素，病毒感染等感染性疾病以及遗传性因子。根据产生器官和形成癌组织的细胞，癌可分类为数百种。
[0005]可采用手术、放疗、化疗方式治疗上述的癌，但放疗和化疗同时引发副作用的问题，诸如严重的恶心和呕吐、血细胞减少症、感染、恶液质骨髓抑制、粘膜炎、脱发等。尤其是，化疗的副作用不仅会给患者的生命带来很大影响，还会极大地降低患者对治疗的顺应性。
[0006]另外，胰腺癌是一种预后不好的癌，5年生存率小于5%。大多数在病情发展阶段被发现，但可用手术切除治疗可能性为20%以内，即便做了切除，由于经常发生微转移和淋巴结再发作，2年内再发率为50%，非常高。胰腺癌被认为是与发生率相比死亡率最高的消化器官癌，在西欧占癌死亡病因的第四位、韩国占第六位的恶性肿瘤，虽然仅占全部癌患者的2~3%，但占据了所有癌 死亡率的6%。到目前为止不论采用何种抗癌治疗，局部进行性胰腺癌的平均生存期为8~12个月，转移性胰腺癌为3飞个月程度，是非常致命的癌。
[0007]目前，进行性胰腺癌的有效治疗策略是使用吉西他滨(Gemcitabine，Lilly)，其能够诱发人胰腺癌细胞的细胞死亡，抑制肿瘤的生长和进行，是用于静脉给药的2’ -脱氧胞嘧啶核苷类似物。但是单独使用吉西他滨治疗胰腺癌时，平均生存率为(median overallsurvival) 5.7个月，效果非常微小。最近虽然认可埃罗替尼(erlotinib, Tarceva)与吉西他滨结合治疗转移性胰腺癌，但即便在吉西他滨与埃罗替尼结合治疗的情况下，同单独使用吉西他滨进行治疗相比，胰腺癌患者的I年生存率从18%上升到24%,而抗癌治疗的重要因素即平均生存率仅延长了 0.33个月。而且，埃罗替尼作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶的低分子量合成抑制剂，不能区分癌细胞和快速分裂的正常细胞，因此相比单独给药吉西他滨毒性强，长期使用会引发抗性。 [0008]对此，除吉西他滨和埃罗替尼的结合以外，尽管还尝试吉西他滨/α干扰素、吉西他滨/顺钼、吉西他滨/卡培他滨、吉西他滨/阿瓦斯丁等结合治疗，但治疗效果都确认为微弱。
[0009]因此，本发明人通过非肽聚合物将免疫球蛋白恒定区连接到α干扰素上，发现获得的作为干扰素的高分子聚合物缀合物的一种的干扰素α-缀合物与现有的α干扰素相t匕，不仅活体内半衰期得到延长，而且抗癌活性更为优秀，尤其是与吉西他滨之类抗癌剂联合给药时，表现出协同作用，由此显示极为优异的抗癌活性。发明人通过如上发现完成了本发明。此外，通过将抗癌活性优异的干扰素α-缀合物与抗癌剂联合给药，发现能够减少抗癌剂的给药量，降低抗癌剂的副作用，而且提高了患者对治疗的顺应性，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0010]本发明要解决的技术问题
[0011]本发明的一个目的是提供一种包含α干扰素或其高分子聚合物缀合物的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
[0012]本发明的目的在于提供一种包含干扰素α-缀合物的用于预防或治疗癌症的药物组合物。所述干扰素α-缀合物是通过非肽聚合物连接α干扰素与免疫球蛋白恒定区而得。所述非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多聚糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、聚乳酸、聚乳酸-乙二醇酸、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸及它们的组合。
[0013]本发明的另一目的在于提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物除了上述干扰素α -缀合物之外，还包含选自Ras抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂以及MAPK抑制剂的抗癌剂。
[0014]解决技术问题的技术手段
[0015]作为一种方式，本发明提供一种包含α干扰素的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
[0016]人干扰素为细胞因子的一种，是通过激活体内免疫反应活性及癌细胞的细胞凋亡来抑制病毒、癌细胞等的增殖的蛋白质。干扰素由B淋巴细胞(B lymphocytes)、无标志淋巴细胞(Null lymphocytes)以及巨卩遼细胞(Macrophage)产生,具有抗病毒活性、抗癌活性、激活NK(Nature Killer)细胞以及抑制骨髓细胞活性等功能。α干扰素优选干扰素a _2b、干扰素a_2a等。
[0017]人α干扰素的分子量为17，500至21，000左右，固有活性为2xl08IU/mg蛋白质左右，效价非常高。由于α干扰素是由活体内的165个氨基酸组成的蛋白质，当第23位氨基酸为赖氨酸时是干扰素a -2a (序列号:1 (Seq ID N0.1))、第23位氨基酸为精氨酸时是干扰素 ct-2b (序列号:2 (Seq ID N0.2))。
[0018]本发明中所使用的α干扰素不仅包含野生型α干扰素，还包含拮抗剂(agonist)、衍生物(derivatives)、片段(fragments)和变体(variants)等。拮抗剂是指与α干扰素的结构无关，同α干扰素的体内受体结合，从而显示与α干扰素相同生物活性的物质。衍生物是指与天然α干扰素比较时，在氨基酸序列中显示最少80%的同一性，氨基酸残基的部分基团进行了化学置换、去除或修饰的形态，并且仍保留α干扰素的肽。片段是指以在天然α干扰素的N-末端或C-末端增加或删除一个或一个以上氨基酸的形态，保留α干扰素功能的肽，也可以增加非天然存在的氨基酸(例如D-型氨基酸)。变体是指与天然α干扰素相比，氨基酸序列中一个以上的部分不同并保留α干扰素功能的肽。上述拮抗剂、衍生物、变体和片段能够与α干扰素的体内受体结合，从而能够显示与α干扰素相同或相应的生物活性。
[0019]本发明中可使用的α干扰素的制备方法公开在韩国专利第10-0360594号，上述说明书的全部内容作为本发明的参考资料而被包含在本发明中。但是，上述α干扰素不限于上述韩国专利第10-0360594号中公开的内容，本领域中制备α干扰素的一般的方法皆可以被本发明所采用.[0020]另外，本发明提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中，包含在α干扰素上进一步缀合高分子聚合物的高分子聚合物缀合物形态的α干扰素。
[0021]在本发明中，“高分子聚合物缀合物”这一用语是指，在α干扰素上进一步缀合有高分子聚合物的形态。可用于上述缀合物的高分子聚合物只要是能够与本发明的目的一致地延长α干扰素的体内半衰期而提高治疗效果的高分子聚合物，则不限其种类，作为其例子，可以是聚乙二醇之类的高 分子聚合物，还可以是抗体、抗体片段、纤维连接蛋白、白蛋白、免疫球蛋白片段或弹性蛋白之类的蛋白质形态的高分子聚合物，但并非仅限于此。
[0022]上述高分子聚合物缀合物包含α干扰素与高分子聚合物直接连接的形态，以及通过肽连接体或非肽聚合物之类的非肽连接体来连接的形态。缀合了上述蛋白质形态的高分子聚合物的本发明缀合物，能够以融合蛋白质的形态利用遗传工程技术来从I个以上的细胞中生成，或分别生成α干扰素以及蛋白质形态的高分子聚合物之后，利用化学方法在细胞外进行缀合。作为其例子，上述α干扰素缀合物可按照韩国专利第10-0725315号中记载的方法来进行制备，上述说明书全部作为本发明的参考资料来包含在本发明中。但是，对上述α干扰素缀合物的制备方法而言，并不限于上述专利中公开的方法，只要是为了实现延长α干扰素的半衰期的目的而能够连接高分子聚合物的方法，则皆可采用。
[0023]另外，上述高分子聚合物缀合物是α干扰素以及免疫球蛋白恒定区通过非肽聚合物连接而得的α干扰素缀合物。所述非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多聚糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸及它们的组合。本发明中，上述α干扰素以及免疫球蛋白恒定区通过非肽聚合物连接的形态的高分子聚合物缀合物能够与α干扰素缀合物混用。
[0024]上述免疫球蛋白恒定区是指除免疫球蛋白的重链和轻链变化区之外的部分，可由选自CH1、CH2、CH3及CH4结构域的I至4个结构域形成；另外，也可由选自除轻链恒定区(Ql)和重链恒定区I (ChI)之外的重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)形成。此外还可再包含铰链区，也可以在重链恒定区包含铰链(hinge)区。还可以是去除了相当于(^2和/*CH3的非常长的氨基酸序列的区。具体为，本发明的免疫球蛋白恒定区可以是(I)ChI结构域、Ch2结构域、Ch3结构域和Ch4结构域、(2) ChI结构域和CH2结构域、(3) ChI结构域和Ch3结构域、(4)Ch2结构域和Ch3结构域、(5)—个以上的结构域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合，(6)重链恒定区各结构域和轻链恒定区的二聚体。
[0025]本发明的免疫球蛋白恒定区可源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。也可以是源自免疫球蛋白恒定区的各结构域IgG、IgA、Ig、IgE和IgM形成中选择的免疫球蛋白，具有非同源结构域的杂化物。上述杂化物(hybrid)是指在单链免疫球蛋白恒定区内存在相当于2个以上非同源免疫球蛋白恒定区结构域的序列。本发明可以为多种形态的杂化物。例如，可以从IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的CH1、CH2、CH3及CH4形成的基团中选择I至4个结构域所形成的结构域的杂化物，可以包含铰链。
[0026]另外，在形成二聚体或多聚体时，能够编码同源单链免疫球蛋白恒定区的聚肽与非同源的单链聚肽进行结合。例如，选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的恒定区片段中的2个以上的片段，能够制备二聚体或多聚体。
[0027]可优选使用源自人血液中最丰富的IgG或IgM的免疫球蛋白恒定区，在本发明的具体实施例中使用源自Ig G的免疫球蛋白恒定区。IgG还可分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类，在本发明中也可以是它们的组合多聚体或它们的杂化物。可优选使用IgG2和IgG4亚类，在本发明的具体实施例中使用几乎没有类似于补体依赖细胞毒性(CDC, Complementdependent cytotoxicity)的效应子功能(effector function)的 IgG4 的 Fe 区。
[0028]此外，免疫球蛋白恒定区可以为天然型糖链、同天然型相比增加的糖链、同天然型相比减少的糖链或糖链被去除的形态。如上所述的免疫球蛋白恒定区糖链的增减或去除可以采用常规方法，诸如化学方法、酶法及利用微生物的遗传工程法。在此，去除糖链的免疫球蛋白恒定区的补体(Clq)的结合力显著降低，由于抗体-依赖性细胞毒性或补体-依赖性细胞毒性的减少或去除，不会引发体内不必要的免疫反应。从这点来看，更符合作为药物载体的原来目的的形态为，根据化学方法、酶法去除糖链，或在原核动物优选在大肠菌中产生的没有形成糖链的免疫球蛋白恒定区。
[0029]本发明的免疫球蛋白恒定区不仅包含天然氨基酸序列，还包含其序列的突变体(mutant)。所谓氨基酸序列的突变体是指天然氨基酸序列中的一个以上的氨基酸残基，通过缺失、插入、非保存性或保存性置换或它们的组合具有不同的序列。例如，IgG Fe的情况下，已知对结合非常重要的214至238、297至299、318至322或327至331位氨基酸残基是合适的变形部位，因此可以加以利用。此外还能形成如下多种突变体:可形成双硫键的部位被去除、在天然Fe中N-末端的几个氨基酸被去除或在天然Fe的N-末端增加蛋氨酸残基等的突变体。另外为了去除效应子功能，可以去除补体结合部位，例如可以去除Clq结合部位，还可以去除ADCC部位。国际专利公开第97/34631号、国际专利公开第96/32478号等公开了如上所述的免疫球蛋白恒定区的序列突变体的制备技术。[0030]在没有整体改变分子活性的蛋白质和在肽中的氨基酸交换是本领域公知技术(H.Neurath, R.L.Hill,蛋白质(The Proteins),学术出版社(Academic Press),纽约，1979 年)。最通常发生的交换为氨基酸残基 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe> Ala/Pro> Lys/Arg> Asp/Asn>Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly 之间的交换。
[0031]根据情况也可通过磷酸化作用(phosphorylation)、硫酸盐化作用(sulfation)、酰化作用(acrylation)、糖基化作用(glycosylation)、甲基化作用(methylation)、法呢酰化作用(farnesylation)、乙酰化作用(acetylation),酰胺化作用(amidation)等修饰(modifcation)。[0032]如上所述的恒定区衍生物是指虽然显示与本发明恒定区相同的生物学活性，但相对于恒定区提高了对于热、PH等的结构稳定性的衍生物。
[0033]此外，免疫球蛋白恒定区可源自人或牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、几内亚猪(天竺鼠)等动物，优选源自人。因人的体内抗原作用，使用非源自人的恒定区可能在人的体内引发不必要的免疫反应，使人体内生成抗体，因此优选源自人的恒定区。
[0034]这样的Fe区可以从人和牛、羊、猪、老鼠、兔子、仓鼠、大鼠、几内亚猪等动物体内分离的天然型获得，也可为来自转化的动物细胞或微生物的重组体或其衍生物。在此，天然型是通过人或动物体中分离全部免疫球蛋白后，用蛋白质分解酶处理的方法获得的。例如，用木瓜蛋白酶处理时，切断为Fab和Fe ;用胃蛋白酶处理时，切断为pF' c和F(ab)2。对此可以采用尺寸排阻色谱分析法(size-exclusionchromatography)等分离出Fe或pF’ C。
[0035]在本发明的具体实施例中，使用从微生物获得的重组免疫球蛋白Fe区作为源自人IgG4非糖基化的Fe区。
[0036]本发明的非肽聚合物是指由2个以上重复单元结合而成的体内适应性聚合物，上述重复单元通过非肽键的任意共价键相连接。
[0037]本发明能够使用的非肽聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多聚糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸(polylacticacid, PLA)及聚乳酸-聚乙二醇酸(polylactic-glycolic acid, PLGA)之类的可生物降解的高分子聚合物、脂质聚合物、甲壳质类、透明质酸及它们的组合，虽然优选聚乙二醇但不限于此。本领域已知的上述化合物的衍生物及在本领域技术水平可容易制备的衍生物也包含在本发明范围之内。
[0038]在利用现有的框内融合(inframe fusion)方法制得的融合蛋白质中所使用的肽连接体的缺点为，在体内容易被蛋白质分解酶切断，无法获得所期望的利用载体增加活性药物的血液半衰期效果。但是在本发明中，使用对蛋白质分解酶具有抗性的非肽聚合物，能够维持活性药物的血液半衰期。因此能够在本发明中使用的非肽聚合物是对体内蛋白质分解酶具有抗性的聚合物时，没有使用限制。非肽聚合物的分子量为I至IOOkDa范围，优选I至20kDa范围，不仅可使用一种聚合物还可结合使用不同种类的聚合物。
[0039]本发明所使用的非肽聚合物具有在两个末端可以与免疫球蛋白恒定区和α干扰素结合的反应基团。上述两个末端的反应基团可选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺(11^16；[111丨(16)基团和琥拍酰亚胺(811(^；[11；[111丨(16)衍生物,琥拍酰亚胺衍生物可使用琥拍酰亚胺基丙酸酯、羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基羧甲基酯或琥珀酰亚胺基碳酸酯。[0040]上述非肽聚合物的两个末端反应基团可相同亦可不同。例如，一个末端中可以有马来酰亚胺基，另一末端中可以有醛基、丙醛基或丁醛基。
[0041]尤其是上述非肽聚合物在两个末端具有醛基反应基团时，可使非特异性反应最小化，有利于在非肽聚合物的两个末端分别与α干扰素和免疫球蛋白恒定区结合。通过醛结合的还原烃化作用所产生的最终产物比胺键连接的更为稳定。醛反应基团在低PH条件下与N-末端进行选择性反应，而在高pH，例如在ρΗ9.0条件下能够同赖氨酸残基形成共价键。本发明的干扰素α-缀合物可优选为在α干扰素的N-末端上特异性的连接有非肽聚合物的结合体，也可以为在ct干扰素N-末端的氨基或硫醇基(Thiol group)上连接有非肽聚合物的缀合物。本发明人确认在α干扰素N-末端结合非肽聚合物可增加α干扰素的活性。同上所述的N-末端特异结合体的制备可在pH调节下发生，优选pH范围为4.5至7.5。
[0042]将两侧末端具有羟基反应基团的聚乙二醇用作非肽聚合物时，通过公知的化学反应将上述羟基激活为上述多种反应基团，也可利用市售的具有变异反应基团的聚乙二醇。
[0043]本发明的干扰素α-缀合物是α干扰素蛋白质通过非肽聚合物与免疫球蛋白恒定区连接的形态，能够出色地维持体内的持续性和稳定性。由于免疫球蛋白恒定区是在活体内代谢的可生物降解的聚肽，因此可安全地用于药物载体。并且，相对于免疫球蛋白的全部分子免疫球蛋白恒定区的分子量小，不仅在结合体制备、精制和收率方面非常有利，而且每个抗体的氨基酸序列都不同，由于非均质性高的变化区(Fab)部分被去除，可以期待大幅增加物质同质性的效果及降低诱发血液中抗原功能的效果。
[0044]本发明的干扰素α-缀合物同天然α干扰素相比，不仅体内半衰期得到延长，而且抗癌活性更为优秀。使用本发明的干扰素α-缀合物，会结合到α干扰素受体，从而诱导癌细胞的细胞凋亡，并显示出减少癌大小和抑制癌细胞增殖的效果。因此，本发明的包含α干扰素或其高分子聚合物缀合物的药物组合物能够用于癌症的预防或治疗。
[0045]在本发明中，用语“预防”是指，通过上述组合物的给药来抑制或延长癌症的发病的所有的行为。另外，在本发明中，用语“治疗”是指，通过上述组合物的给药，癌症的症状好转或变得有利的所有的行为。
[0046]在本发明一具体实施例中，在人何杰金氏淋巴瘤细胞，即在Daudi细胞中进行的体外抗增殖效果实验结果表明，本发明的干扰素α-缀合物同天然α干扰素相比，具有优秀的抑制癌细胞增殖的效果(表1，图1)。另外，在本发明一具体实施例中，将人卵巢癌细胞(SK-0V-3)移植到裸鼠皮下，然后给本发明的α干扰素，观察癌大小变化推移的结果表明，同阴性对照组、天然α干扰素和PEG修饰α干扰素相比，癌的大小没有增加(表2，图2)。
[0047]另外，本发明的干扰素α -缀合物为从Ras抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂和MAPK抑制剂中选出的抗癌剂，优选通过与吉西他滨或索拉非尼(Sorafenib, Raf抑制剂)联合给药显示具有优异的抗癌活性。
[0048]本发明的“Ras抑制剂”是指将Ras (包含H-Ras、K-Ras或N-Ras)肿瘤基因活性作为靶点的或能够降低其活性或抑制其活性的化合物。例如可包含法尼基转移酶抑制剂(FTI)，如 L-744832、DK8G557 或 R115777 (替匹法尼(ZARNESTRA))。
[0049]本发明的“Raf抑制剂”可指将在细胞分化、增殖和细胞凋亡中对细胞外信号调节发挥重要作用的Raf激酶作为靶点的或降低其作用或抑制其作用的化合物，Raf抑制剂靶点不受此限制可包含RAF1。例如可包含3- (3，5- 二溴-4-羟基苯亚甲基)-5_碘-1，3- 二氢吲哚-2-酮、以及苯甲酰胺、3- (二甲胺)-N-[3-[ (4-羟基苯亚甲基)氨基]-4-苯甲基]-(9C1)。
[0050]本发明的“MEK抑制剂”是指将作为MAP激酶的MEK激酶活性为靶点的或能够降低其活性或抑制其活性的化合物。MEK抑制剂的靶点不受此限制，可包含ERK、人细胞周期素Dl (CydinDl)0 MEK抑制剂的例子不受此限制，可包含丁二腈、双[氨基[2-氨基苯基)硫基]亚甲基]-(9C1)。 [0051]本发明的“MAPK抑制剂”是指将MAP作为靶点的或能够降低其活性或抑制活性的化合物。MAP激酶(MAPK)可被多种细胞外刺激下所激活、将信号从细胞表面传输到细胞核的载体蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶组。它们调节包含炎症、细胞凋亡型细胞死亡、肿瘤基因转化、肿瘤细胞侵袭与转移的多种生理及病理细胞现象。MAPK抑制剂的例子不受此限制可包含苯磺酰胺、N-[2-[[[3-(4-氯苯基)-2-丙苯基]甲基]氨基]甲基]苯基]-N-(2-羟乙基)-4-甲氧基-(9C1)。
[0052]本发明的吉西他滨是通用名为2’ -脱氧-2’，2’ - 二氟胞苷的化合物，是邻二氟置换的脱氧胞苷类似物，可包含单盐酸盐及β_同分异构物。吉西他滨能够激活RKIP (Rafkinase inhibitor Protein),发挥Raf抑制剂的作用。现有的吉西他滨被认为是胰腺癌治疗中临床活性最优异的药物，但由于具有因癌细胞与快速分裂的正常细胞之间特异性缺失而引发的毒性，且大部分肿瘤细胞对药物具有先天耐药性或后天化学耐药性，因此无法大幅提升胰腺癌对象的健康状况。虽然也尝试了吉西他滨/顺钼、吉西他滨/卡培他滨、吉西他滨/阿瓦斯丁、吉西他滨/α干扰素等的组合治疗，但治疗效果并不好。
[0053]本发明的干扰素α -缀合物是从Ras抑制剂、Raf激酶抑制剂、MEK抑制剂和MAPK抑制剂中选出的抗癌剂(能够克服k-ras变异的抗癌剂)，本发明人具体将上述干扰素α -缀合物与吉西他滨联合给药时能够确认具有显著的抗癌活性。Ras — Raf — MEK — MAPK所形成的信号传输路径的激活促进细胞的分化和生长，并且上述信号传输路径的激活能够抑制α干扰素路径之一的STAT，从而抑制α干扰素的抗癌活性(细胞凋亡)。选自Ras抑制剂、Raf激酶抑制剂、MEK抑制剂和MAPK抑制剂的抗癌剂，尤其是与本发明的干扰素α -缀合物联合给药时，表现非常显著的抗癌活性。特别是对单独给药吉西他滨或干扰素时没有效果的k-ras变异后的Panel和Miapaca2胰腺癌细胞系,具有非常出众的抗癌效果。进一步地，上述显著的抗癌活性为协同作用，将天然α干扰素或PEG修饰α干扰素与上述抗癌剂联用给药时无法显示所述协同作用。当将本发明的干扰素α-缀合物与上述抗癌剂联合给药时产生提升效果，因此可确认抗癌活性非常优异。
[0054]在本发明的一具体实施例中，将人胰腺癌细胞(BxPC-3)移植到裸鼠皮下，单独给本发明的干扰素α-缀合物或将干扰素α-缀合物与吉西他滨联合给药后观察癌大小变化推移情况，结果确认与单独给药吉西他滨、单独给药PEG修饰α干扰素相比，癌大小相对于阴性对照组得到减小(表3，图3)。
[0055]此外，在本发明的一具体实施例中，将人胰腺癌细胞(Panc-1)移植到裸鼠的皮下，将吉西他滨与本发明的干扰素α-缀合物联合给药后观察癌大小变化发展情况，结果确认与阴性对照组相比癌大小得到减小，从而确认了吉西他滨和本发明的干扰素α -缀合物的协同作用(表4，图4，图5)。
[0056]此外，在本发明的一具体实施例中，将人胰腺癌细胞(Miapaca-1)移植到裸鼠的皮下，将吉西他滨与本发明的干扰素α-缀合物联合给药后观察癌大小变化推移情况，结果确认同阴性对照组相比癌大小得到减小。与吉西他滨/PEG修饰α干扰素联用给药的情况相比，能够确认吉西他滨和本发明的干扰素α -缀合物的协同作用(表5、图6)。
[0057]本发明的抗癌用药物组合物可用于k-ras变异的癌治疗，优选用于治疗胰腺癌、黑色素瘤、肾癌或卵巢癌，更优选用于治疗胰腺癌。
[0058]本发明的抗癌用药物组合物在干扰素α-缀合物能够到达目标组织就能够通过任何一种一般途径进行给药。虽然可以为腹腔内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、经口腔给药、局部给药、脾内给药、肺内给药、直肠内给药等，但不限于此。不过由于经口腔给药时蛋白质会被消化，经口腔用组合物优选对活性药剂进行包衣或制成剂型保护其不在胃部被分解。优选能够以注射剂形式进行给药。此外，只要活性物质能够移动到靶细胞，药物组合物可以使用任意装置进行给药。
[0059]本发明中包含α干扰素或其缀合物的抗癌用药物组合物可以包含可药用的载体。可药用载体在经口腔给药时可使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、溶解剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素、香料等；而在注射剂的情况下可混合使用缓冲剂、保存剂、镇痛剂、溶解剂、促渗剂、稳定剂等；局部给药时可使用基础剂、赋形剂、润滑剂、保存剂等。在本发明中抗癌用药物组合物的剂型能与上述可药用载体混合制造多种剂型。例如，经口腔给药时可制备为片剂、含片、胶囊、丹剂(elixir)、悬浮液、糖楽；、薄片(Wafer)等形态；当为注射剂时，可制备为单位给药安瓿或多次给药的形态。其他，可剂型化为溶液、悬浮液、片剂、丸药、胶囊、缓释型制剂等。
[0060]另外，适合制剂化的载体、赋形剂和稀释剂有，例如可使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶质纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等。而且， 还可包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、防腐剂等。
[0061]本发明的抗癌用药物组合物的给药量需考虑治疗的癌症、给药途径、患者的年龄、性别及体重和疾病的严重度等多个相关因素，同时给药的抗癌剂的种类而确定。本发明的抗癌用药物组合物由于体内半衰期及抗癌活性优异，能够显著降低给药次数和频度。此外，与抗癌剂联合给药时，能够减少联合给药的抗癌剂的给药量，降低抗癌剂的副作用，提高患者对治疗的顺应性。
[0062]作为另一方式，本发明提供一种癌症治疗方法，其中，包括将包含上述α干扰素的抗癌用药物组合物向个体进行给药的步骤。
[0063]对上述α干扰素、药物组合物以及癌症的说明，如上所述。
[0064]具体而言，本发明的治疗方法包括将上述药物组合物按药学有效剂量向癌症疑似个体体内给药的步骤。上述个体是包括指，狗、牛、马、兔子、小鼠、大鼠、鸡或人在内的所有的哺乳类动物，但是，上述例子并非用以限定本发明的哺乳类动物。上述药物组合物可通过非口服、皮下、腹腔内、肺内以及鼻腔内给药，且为了局部治疗，在有必要时可通过包括病灶内给药的适当方法来进行给药。非口服给药包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下给药。优选的给药方式是静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射以及点滴注射。本发明的上述药物组合物的优选给药量根据个体的状态、体重、疾病的程度、药物形态、给药途径以及期间而不同，但是可由本领域技术人员适当选择。[0065]发明效果
[0066]本发明的干扰素α-缀合物同现有的α干扰素相比，不仅延长体内半衰期，而且抗癌活性更为优秀，尤其是与吉西他滨之类抗癌剂联用给药时，在抑制癌细胞增长及增殖方面表现出协同作用另外由于本发明的抗癌用药物组合物体内半衰期及抗癌活性优异，因此给药次数和频率显著减少。而且通过将抗癌活性优异的干扰素α-缀合物与抗癌剂联合给药，能够减少抗癌剂的给药量，降低抗癌剂的副作用，而且提高了患者对治疗的顺应性。
【专利附图】
【附图说明】
[0067]图1为在Daudi细胞中α干扰素和本发明一实施例中的干扰素α -缀合物对体外癌细胞增殖抑制效果的确认图。
[0068]图2为将人卵巢癌细胞(SK-0V-3)移植到裸鼠(无胸腺BALB/c裸鼠)皮下，给本发明一实施例中的干扰素α -缀合物后，显示癌大小变化推移的图。
[0069]图3为将人胰腺癌细胞移植到(BxPC-3)裸鼠(无胸腺BALB/c裸鼠)皮下，联合给药本发明一实施例中的干扰素α-缀合物和吉西他滨后显示癌大小变化推移的图。
[0070]图4为将 人胰腺癌细胞(Panc-1)移植到裸鼠(无胸腺BALB/c裸鼠)皮下，联合给药本发明一实施例中的干扰素α-缀合物和吉西他滨后显示癌大小变化推移的图。
[0071]图5为将人胰腺癌细胞(Panc-1)移植到裸鼠(无胸腺BALB/c裸鼠)皮下，联合给药本发明一实施例中的干扰素α -缀合物和吉西他滨，实验结束后对各小鼠进行剖检确认癌大小的图。
[0072]图6为将人胰腺癌细胞(Miapaca-2)移植到裸鼠(无胸腺BALB/c裸鼠)皮下，联合给药本发明一实施例中的干扰素α-缀合物和吉西他滨后显示癌大小变化推移的图。
【具体实施方式】
[0073]以下，根据如下实施例对本发明进行进一步的详细说明。但如下实施例仅用于例示本发明，不对本发明范围进行限制。
[0074]实施例1干扰素α -缀合物的制备
[0075]下述实验所使用的α干扰素为根据大韩民国授权专利第10-0360594号中记载的方法而制备的。干扰素α-缀合物是根据大韩民国授权专利第10-0725315号中记载的方法利用上述制得的α干扰素而制备的。
[0076]具体的代表性方法如下。
[0077]实施例1-1.α干扰素(IFNa )-PEG-免疫球蛋白Fe区(Fe)缀合物的制备I
[0078]<步骤1>利用免疫球蛋白的免疫球蛋白Fe区的制备
[0079]为了制备兔疫球蛋白Fe区，将溶于IOmM磷酸盐缓冲液中的200mg分子量为150kDa的免疫球蛋白G (Immunoglobulin G; IgG,绿十字)用2mg作为蛋白水解酶的木瓜蛋白酶(Papain, Sigma公司)进行处理，在37°C温和搅拌2小时而进行反应。酶反应后，为了对生成的免疫球蛋白Fe区进行纯化，依次用Superdex柱、蛋白A柱和阳离子交换柱进行层析。具体而言，就是将反应液滴加到用IOmM磷酸钠缓冲液(PBS，pH7.3)平衡化的Superdex200柱(Pharmacia公司)上，用同一缓冲液以流速Iml/分钟洗脱。与免疫球蛋白Fe区相比具有相对较大分子量的未反应免疫球蛋白分子(IgG)和F(ab’)2由于先被洗脱而先行除去。分子量近似于免疫球蛋白Fe区的Fab通过如下方式进行蛋白A柱层析而除去。将洗脱自Superdex200柱的含免疫球蛋白Fe区的级分(是詞)以5ml/分钟的流速加到用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡的蛋白A柱(Pharmacia公司)上,用同一缓冲液洗柱，以去除未结合在柱上的蛋白质。然后，用IOOmM柠檬酸钠(Na citrate, pH3.0)缓冲液洗脱，获得高纯度的兔疫球蛋白Fe区。最后用阳离子交换柱(polyCAT，PolyLC公司)最终纯化由蛋白A柱纯化的Fe级分，其中，用IOmM乙酸盐缓冲液(pH4.5)以线性浓度梯度方法(氯化钠浓度0.15M — 0.4M)洗脱，从而获得了高纯度的Fe级分，并将此用12%SDS_PAGE进行确认。
[0080]<步骤2>IFN a -PEG复合物的制备
[0081]将两端具有醛反应性基团的分子量为3.4-kDa的聚乙二醇ALD-PEG-ALD (Shearwater公司)添加到以5mg/ml的浓度溶解有人干扰素a -2b (hIFNa.-2b,分子量:20kDa)的IOOmM磷酸盐缓冲液中，使得IFNa:PEG摩尔比为1:1、1:2.5、1:5、1:10和1:20。并向其中以终浓度为20mM的方式加入还原剂氰基棚氢化纳(NaCNBH3, Sigma公司)，并在温和搅拌下在4°C反应3小时。为了获得使PEG与干扰素α的氨基末端选择性连接、且PEG和干扰素α以1:1缀合的复合物，将反应混合物用SuperdexR柱(Pharmacia公司)进行大小排阻层析。用IOmM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)作为洗脱缓冲液将IFNa-PEG复合物从柱上洗脱下来，而未与PEG连接的干扰素α、未反应的PEG以及PEG与两个α干扰素连接的二聚体副产物则被去除。将纯化的IFNa-PEG复合物浓缩至5mg/mL。由此确定反应性最佳且二聚体等副产物少的IFNa:PEG的最佳反应摩尔比是1:2.5至1:50。
[0082]<步骤3>IFNa-PEG_Fc缀合物的制备
[0083]为了将上述步骤2中纯化的IFNa-PEG复合物与免疫球蛋白Fe区的N末端连接，将以上步骤I中制备的免疫 球蛋白Fe区(约53kDa)溶于IOmM磷酸盐缓冲液中，并以IFNa.-PEG复合物Fe的摩尔比分别为1: 1、1:2、1:4和1:8的方式与IFNa.-PEG复合物混合并使其反应。将反应溶液形成IOOmM的磷酸盐缓冲液的形态之后，将还原剂NaCNBH3加入反应液中，使其终浓度为20mM，在温和搅拌下于4°C反应20小时。由此，确定反应性最佳且二聚体等副产物少的IFNa-PEG复合物:Fc的最佳反应摩尔比是1:2。
[0084]<步骤4>IFN a -PEG-Fc缀合物的分离和纯化
[0085]在以上步骤3的反应之后，对反应混合物进行Superdex大小排阻层析，以去除未反应的物质和副产物，并纯化所产生的IFNa-PEG-Fc蛋白缀合物。将反应混合物浓缩并加到柱子上之后，使IOmM磷酸盐缓冲液(pH 7.3)以2.5ml/分钟的流速通过柱子，以去除未结合的Fe和未反应的物质，获得IFNa-PEG-Fc蛋白质缀合物级分。由于所得到的IFNa-PEG-Fc蛋白质缀合物级分混有作为杂质的小量的未反应Fe和干扰素α 二聚休，因此为了将其除去，进一步进行阳离子交换层析。将IFNa -PEG-Fc蛋白质缀合物级分加到用IOmM乙酸纳(pH 4.5)平衡的PolyCAT LP柱(PolyLC公司)上，并用包含IM氯化钠(NaCl)的IOmM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中以线性浓度梯度方法(氯化钠浓度OM — 0.5M)洗脱柱子，进行进一步纯化。最后，用阴离子交换柱纯化IFNa -PEG-Fc蛋白质缀合物。
[0086]将纯化的IFNa-PEG-Fc蛋白质缀合物级分加到用IOmMTris_HCl (pH7.5)缓冲液平衡的PolyWAX LP柱(PolyLC公司)上，然后用含有IM氯化钠的IOmM Tris-HCl (pH
7.5)缓冲液以线性浓度梯度(氯化钠浓度OM — 0.3M)洗脱柱子，从而纯化出了高纯度的IFNa-PEG-Fc蛋白质缀合物。
[0087]实施例1-2:1FN a -PEG-Fc缀合物的制备II
[0088]<步骤DFc-PEG复合物的制备
[0089]将两端具有醛反应性基团的分子量为3.4kDa的聚乙二醇ALD-PEG-ALD (Shearwater公司)添加到以15mg/ml的浓度溶解有实施例1步骤I中所制备的兔疫球蛋白Fe区的IOOmM磷酸盐缓冲液中，使得Fe:PEG摩尔比为1:1、1:2.5,1:5,1:10和1:20。在此混合物中以终浓度为20mM的方式加入还原剂氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，并在温和搅拌下使之于4°C反应3小时。为了得到与兔疫球蛋白Fe区的氨基末端PEG:Fc为1:1的复合物，将反应混合物用SuperdexR柱(Pharmacia公司)进行大小排阻层析。用IOmM磷酸钾缓冲液(PH6.0)作为洗脱液来纯化Fc-PBG，而未与PEG连接的免疫球蛋白Fe区、未反应的PBG以及PBG与两个免疫球蛋白Fe区连接的二聚体副产物则被去除。将纯化的Fc-PBG复合物浓缩至大约15mg/ml。由此,确定反应性最佳且二聚体等副产物少的Fc:PBG的最佳反应摩尔比是1:3至1:10。
[0090]〈步骤2>Fc_PBG复合体和干扰素α的缀合物的形成和纯化
[0091]为了将上述步骤I中纯化的Fc-PEG复合物与IFNa的N末端连接，将Fc-PBG复合物与溶于IOmM磷酸盐缓冲液的干扰素α以Fc-PEG复合物:IFNα的摩尔比分别为1:1、1: 1.5、1:3和1:6的方式进行混合。在将反应液变成浓度为IOOmM的磷酸盐缓冲液形态之后，将还原剂NaCNBH3加入反应液中，使其终浓度为20mM，并使之在温和搅拌下于4°C反应20小时。反应完成后，依照实施例1步骤4中同样的纯化方法将未反应的物质和副产物去除，从而分离出高纯度的Fc-PBG-1FNa蛋白质缀合物。
[0092]实施例2在Daudi细胞中干扰素α -缀合物对体外癌细胞增殖抑制效果的实验
[0093]使用Daudi细胞，并以RPMI1640中加入10%PS、10%FBS的培养基为一般培养基和实验培养基。在96孔圆底板上将α干扰素和本发明的干扰素α-缀合物以4倍为稀释比例，在实验培养基中制备10个不同浓度。将稀释后的实验培养基分别以50 μ L的量转移到96孔的平底板中。将Daudi细胞以1000rpm速度进行5分钟的离心分离后，使用50mLPBS在圆锥管(cornical tube)中洗漆。然后以1000rpm速度进行5分钟离心分离,加入实验用培养基计算细胞数。将Daudi细胞稀释为5x10s个细胞/mL的浓度，然后向各孔加入100 μ L。在37°C下培养72小时后向各孔加入20 μ L CCK_8，3小时后在450nm中测定了吸光度。 [0094]通过EC50确认α干扰素和本发明干扰素α -缀合物(持续型干扰素α -缀合物)对体外癌细胞增殖的抑制效果(表1，图1)。其结果，本发明的干扰素α-缀合物同α干扰素相比可以确认具有优异的癌细胞增殖抑制效果。
[0095]表1
[0096]
【权利要求】
1.一种包含α干扰素的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述α干扰素是能够与体内受体结合而显示与野生型α干扰素相同或相应的生物活性的物质，是选自野生型α干扰素、α干扰素衍生物、变体以及片段中的α干扰素。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述α干扰素是进一步缀合有高分子聚合物的高分子聚合物缀合物形态。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述高分子聚合物是选自聚乙二醇、抗体、抗体片段、免疫球蛋白恒定区、纤维连接蛋白、白蛋白以及弹性蛋白。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述高分子聚合物缀合物是α干扰素与免疫球蛋白恒定区通过非肽聚合物连接而成的，所述非肽聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多聚糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、聚乳酸、聚乳酸-乙二醇酸、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸及它们的组合。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含选自Ras抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂和MAPK抑制剂中的抗癌剂。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括吉西他滨或索拉非尼。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中，所述组合物用于治疗k-ras变异的癌。
9.根据权利要求6或7所述的组合物，其中，所述组合物用于治疗胰腺癌、黑色素瘤、肾癌或卵巢癌。
10.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区为免疫球蛋白Fe区。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述α干扰素为干扰素a_2a或干扰素a -2b 。
12.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述高分子聚合物缀合物在α干扰素的N-末端连接有非肽聚合物。
13.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述高分子聚合物缀合物为在α干扰素的N-末端氨基或硫醇基(Thiol group)上连接有非肽聚合物。
14.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区是非糖基化的。
15.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区由选自CH1、Ch2、Ch3及Ch4结构域的I至4个结构域形成。
16.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区由选自CH1、Ch2、Ch3及Ch4结构域的重链恒定区和轻链恒定区的二聚体形成。
17.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区包含铰链区。
18.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区源自IgG、IgA、IgD、IgE 或 IgM。
19.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区的各结构域为源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM中的免疫球蛋白的、具有非同源结构域的杂化物。
20.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区是由同源结构域形成的单链免疫球蛋白所构成的二聚体或多聚体。
21.根据权利要求4或5所述的 组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区是IgG4Fc区。
22.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述免疫球蛋白恒定区是没有形成糖链的人IgG4 Fe区。
23.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述非肽聚合物的分子量范围为IkDa以上IOOkDa 以下。
24.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述非肽聚合物的反应基团选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基及琥珀酰亚胺衍生物。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述琥珀酰亚胺衍生物为琥珀酰亚胺基丙酸酯、羧甲基琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺盐或者琥珀酰亚胺基碳酸酯。
26.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述非肽聚合物的两个末端反应基团是醛基。`
【文档编号】A61K47/48GK103611163SQ201210326549
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年9月5日 优先权日:2011年9月5日
【发明者】郑圣烨, 禹妗银, 林世荣, 崔仁荣, 李在浩, 权世昌, 文圣焕, 刘家望 申请人:韩美科学株式会社, 北京韩美药品有限公司