专利名称：一种新型α干扰素的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种新型的α干扰素。
本发明对IFNα阿片样功能位点结构的改变，是采用基因定位突变来实现的。基因定位突变方法参照White的方法进行[White BA.PCR cloning protocols.Totowa，New Jersey，Humana Press，1997，141]。将编码IFNα阿片样功能位点氨基酸残基的密码子，突变为其它氨基酸残基的密码子，就能改变其阿片样功能位点的结构。既可改变其中任何一个氨基酸残基的密码子，也可同时改变两个或三个或四个氨基酸残基的密码子，都可达到降低IFNα毒副作用的目的。
具体操作步骤包括1.IFNα的基因定位突变(1)引物合成根据重组PCR原理，除合成外侧引物外，还根据突变体的不同合成相应的内侧引物，引入突变位点。
(2)以IFNα基因为模板，外侧引物与相应的内侧突变引物组合，进行PCR扩增，分别形成短PCR产物。然后以相对应的两个短PCR产物为模板，再以两个外侧引物，进行第二次PCR反应，由此获得PCR产物。
2.构建IFNα突变体表达质粒PCR产物经纯化、测序鉴定后，与表达质粒pLy-5连接，获得表达质粒pLy-5-IFNα。
3.构建IFNα突变体工程菌将表达质粒pLy-5-IFNα转入大肠杆菌RR-感受态菌，即得IFNα突变体工程菌。
4.制备IFNα突变体蛋白培养IFNα突变体工程菌，离心收集菌体，超声波破碎，采用亲和层析方法进行纯化，获得IFNα突变体蛋白。
将所得的IFNα突变体蛋白，采用细胞病变抑制法[Van Heuvel M，et al.J GenVirol，1986；672215]、电刺激甩尾法[Jiang CL，et al.Neurochem Int，2000；36(3)193]等，检测其抗病毒活性、阿片样镇痛活性；同时，测定其对细胞内cAMP含量的影响、对下丘脑脑片PGE2释放的影响以及致热作用[Zawada WM，et al.Neurochem Int，1997；30441]等。结果表明，通过改变IFNα阿片样功能位点的结构，即置换或突变构成IFNα阿片样功能位点的第122位(或123位)Tyr、第36和38位Phe以及第39位Pro中的任何一个氨基酸残基，或几个氨基酸残基的不同组合的突变或置换，其阿片样镇痛作用明显减弱甚至消失，进而因IFNα作用于神经内分泌系统所致的发热等毒副作用明显减弱甚至消失，且部分IFNα突变体的抗病毒活性等免疫学活性无明显影响甚至活性增强。
图2为制备38Leu-IFNα2b突变体流程示意图。
基因定位突变方法参照White的方法进行[White BA.PCR cloning protocols.Totowa，New Jersey，Humana Press，1997，141]。其基本原理是重叠延伸，即两种PCR产物序列一端重叠，其重叠是通过两个互补的内侧引物造成的以获得定点突变的基因。这两个引物分别在相同的位置加入替换的碱基，也就是由PCR引物引入同样的突变位点，除去未掺入的多余的引物后，两种产物变性混合，可形成3’凹端的异源双链。这种3’凹端可由TaqDNA多聚酶延伸产生一个两重叠产物的重组体。该重组体可由两片段的外侧引物进行PCR扩增。由此，可产生一种远离片段末端的突变体。具体步骤如下1.合成引物按常规合成下列引物外侧引物15’CGGAATTCAT GCAGGAC3’外侧引物25’CGCGGTCGACTCATTCCTTACT3’内侧突变引物15’CTCCTCCTGGGGTAATCCAAAGTC3’内侧突变引物25’CATGACTTTGGATTACCCCAGGAG3’在内侧突变引物中，引入了亮氨酸密码子TTA，以便将IFNα2b第38位Phe突变为Leu。
2.IFNα2b的基因定位突变以IFNα2b基因为模板，外侧引物1与内侧突变引物1组合，进行PCR扩增，形成短PCR产物。同样，外侧引物2与内侧突变引物2组合，形成另一短PCR产物。通过胶上回收短PCR产物，以相对应的两个短PCR产物为模板，再以两个外侧引物，进行第二次PCR反应，由此获得突变体基因。
PCR反应体系为Taq酶2.5单位H2O 30μl
buffer10μl2.5mM dNTP8μl引物1 5μl(50pmol)引物2 5μl(50pmol)模板 10μl加H2O至100μlPCR反应的条件为94℃10分钟；72℃2分钟；94℃30秒，45℃45秒，72℃1分钟30秒，共30个循环；72℃7分钟；最后保持于4℃。
PCR的反应液用同体积的氯仿抽提1次后，经1％的琼脂糖电泳。割下600bp左右电泳胶带，利用基因公司试剂盒回收、纯化DNA片段。将获得的DNA片段与T载体进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α，转化混合物涂布于含2％X-gal的LB氨苄青霉素平板上。挑取若干白色单菌落，培养扩增后进行质粒抽提，再经EcoRI、SalI双酶切，以1％琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定出含有上述600bp左右的DNA片段的相应转化子。挑取这些转化子的单菌落，由中科院植物生理研究所进行DNA序列测定，筛选出含正确序列的突变体38Leu-IFNα2b。
3.构建突变体表达质粒pLy-5-38Leu-IFNα2b将含正确序列38Leu-IFNα2b基因的T载体质粒与表达质粒pLy-5分别用EcoRI、SalI双酶切，酶切后的反应液以1％琼脂糖凝胶电泳，待DNA片段分离开后，在紫外灯下分别切下38Leu-IFNα2b突变基因和表达质粒pLy-5对应胶带，用基因公司试剂盒回收、纯化DNA。将回收的38Leu-IFNα2b DNA片段和pLy-5表达载体按分子数10∶1比例混合，加入T4 DNA连接酶，16℃连接过夜后转化感受态大肠杆菌DH5α。随机挑取单菌落扩大培养，并抽提质粒，用EcoRI和SalI再经酶切鉴定，获得突变体表达质粒pLy-5-38Leu-IFNα2b。
4.构建38Leu-IFNα2b突变体工程菌将表达质粒pLy-5-38Leu-IFNα2b转入感受态大肠杆菌RR-，即得38Leu-IFNα2b突变体工程菌。
5.制备38Leu-IFNα2b突变体蛋白将突变体38Leu-IFNα2b工程菌接种于50ml M9培养基，在37℃培养过夜，以1∶20转接于含0.2％酪蛋白的500ml M9培养基中，37℃培养至菌体浓度A600为1.0，离心收集菌体，并悬浮于100ml的0.01M pH为7.4的磷酸缓冲液，超声波破碎后离心，上清采用亲和层析方法进行纯化(亲和层析柱购自安徽安科生物高技术有限公司)。纯化过程中的洗涤液为含0.4％Tween20的1M NaCl，洗脱液为0.02MHAc、0.135MNaCl。最后获得纯化的38Leu-IFNα2b突变体蛋白，即本发明的α干扰素，并进行以下检测1.采用常规的细胞病变抑制法，测定38Leu-IFNα2b的抗病毒活性[详见VanHeuvel M，et al.J Gen Virol，1986；672215]，发现其保留了很强的抗病毒活性，为天然重组IFNα2b的71％。
2.动物实验检测38Leu-IFNα2b的镇痛活性取雄性SD大鼠(购自上海计划生育研究所)，体重为160～180g，用侧脑室埋管给药、电刺激甩尾法观察38Leu-IFNα2b突变体对大鼠痛阈的影响，来测定其阿片样镇痛活性[详见JiangCL，et al.Neurochem Int，2000；36(3)193]，发现阿片样镇痛活性完全消失。
3.将突变体38Leu-IFNα2b与转染了μ阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞(中国科学院上海细胞生物研究所)孵育，测定对细胞内cAMP含量的影响(cAMP测定试剂盒购自上海中医药大学同位素实验室)，发现38Leu-IFNα2b对环腺苷酸(cAMP)含量无明显影响。
4.采用出生5～7天的SD新生鼠，培养下丘脑脑片[Scott IM，et al.Am JPhysiol.1987；253(1 Pt 2)R71]，测定38Leu-IFNα2b突变体对下丘脑脑片PGE2释放的影响(PGE2测定试剂盒购自北京邦定生物公司)，发现38Leu-IFNα2b对前列腺素E2(PGE2)的释放无明显影响。
5.采用侧脑室埋管给药的方式，测定38Leu-IFNα2b突变体对大鼠直肠温度的变化[Zawada WM，et al.Neurochem Int，1997；30441]，发现38Leu-IFNα2b致热作用消失。
实施例2制备39Gly-IFNα2b突变体(参见图2)。39Gly-IFNα2b突变体即将IFNα2b第39位Pro残基突变为Gly残基。
合成内侧突变引物如下引物15’CTCCTCCTGCCGAAATCCAAAGTC 3’引物25’GACTTTGGATTTGGCCAGGAGGAG 3’在内侧突变引物中，引入了甘氨酸密码子GGC，以便将IFNα2b第39位Pro突变为Gly。其它操作步骤同实施例1。结果发现39Gly-IFNα2b抗病毒活性增加为天然重组人IFNα2b的130％，而阿片样镇痛作用消失，发热等毒副作用也消失。
实施例3制备122Ser-IFNα2b突变体(参见图2)。122Ser-IFNα2b突变体即将IFNα2b第122位Tyr残基突变为Ser残基。
合成内侧突变引物如下引物15’GATTCTTTGGAAGGATTTCCTCACAGC3’引物25’GCTGTGAGGAAATCCTTCCAAAGAATC3’在内侧突变引物中，引入了丝氨酸密码子TCC，以便将IFNα2b第122位Tyr突变为Ser。其它操作步骤同实施例1。结果发现122Ser-IFNα2b的阿片样镇痛作用和发热等毒副作用消失。
实施例4制备36Ser-IFNα2b突变体(参见图2)。36Ser-IFNα2b突变体即将IFNα2b第36位Phe残基突变为Ser残基。
合成内侧突变引物如下引物15’CTGGGGAAATCCAGAGTCGTCATG3’引物25’AGACATGACTCTGGATTTCCCCAGGAG3’在内侧突变引物中，引入了丝氨酸密码子TCT，以便将IFNα2b第36位Phe突变为Ser。其它操作步骤同实施例1。结果发现36Ser-IFNα2b的阿片样镇痛作用和发热等毒副作用消失。
实施例5制备38Leu-39Gly-IFNα2b突变体(参见图2)。38Leu-39Gly-IFNα2b突变体即将IFNα2b第38位Phe残基突变为Leu残基，第39位Pro残基突变为Gly残基。
合成内侧突变引物和其它操作步骤同实施例1和2。结果发现38Leu-39Gly-IFNα2b的阿片样镇痛作用和发热等毒副作用消失。
实施例6制备38Leu-122Ser-IFNα2b突变体(参见图2)。38Leu-122Ser-IFNα2b突变体即将IFNα2b第38位Phe残基突变为Leu残基，第122位Tyr残基突变为Ser残基。
合成内侧突变引物和其它操作步骤同实施例1和3。结果发现38Leu-122Ser-IFNα2b的阿片样镇痛作用和发热等毒副作用消失。
实施例7制备36Ser-38Leu-IFNα2b突变体(参见图2)。36Ser-38Leu-IFNα2b突变体即将IFNα2b第36位Phe残基突变为Ser残基，第38位Phe残基突变为Leu残基。
合成内侧突变引物和其它操作步骤同实施例1和4。结果发现36Ser-38Leu-IFNα2b的阿片样镇痛作用和发热等毒副作用消失。
实施例8制备39Gly-122Ser-IFNα2b突变体(参见图2)。39Gly-122Ser-IFNα2b突变体即将IFNα2b第39位Pro残基突变为Gly残基，第122位Tyr残基突变为Ser残基。
合成内侧突变引物和其它操作步骤同实施例2和3。结果发现39Gly-122Ser-IFNα2b的阿片样镇痛作用和发热等毒副作用消失。
实施例9制备36Ser-39Gly-IFNα2b突变体(参见图2)。36Ser-39Gly-IFNα2b突变体即将IFNα2b第36位Phe残基突变为Ser残基，第39位Pro残基突变为Gly残基。
合成内侧突变引物和其它操作步骤同实施例2和4。结果发现36Ser-39Gly-IFNα2b的阿片样镇痛作用和发热等毒副作用消失。
权利要求
1.一种α干扰素，由165或166个氨基酸残基组成，其特征在于其为由原型α干扰素的阿片样功能位点所在空间区域的第122位(或123位)Tyr、第36和38位Phe以及第39位Pro中的任何一个氨基酸残基或几个氨基酸残基突变或置换为其它氨基酸残基而成。
2.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第36位的氨基酸残基为Ser。
3.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第38位的氨基酸残基为Leu。
4.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第39位的氨基酸残基为Gly。
5.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第122位的氨基酸残基为Ser。
6.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第36位的氨基酸残基为Ser，第38位的氨基酸残基为Leu。
7.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第38位的氨基酸残基为Leu，第39位的氨基酸残基为Gly。
8.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第38位的氨基酸残基为Leu，第122位的氨基酸残基为Ser。
9.按权利要求1所述的α干扰素，其特征在于第36位的氨基酸残基为Ser，第39位的氨基酸残基为Gly。
10.权利1～9所述α干扰素用于制备治疗病毒性疾患、肿瘤和恶性血液病的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及医药生物工程技术领域,是一种新型α干扰素。它由165或166个氨基酸残基组成,其为由原型α干扰素的阿片样功能位点所在空间区域的第122位(或123位)Tyr、第36和38位Phe以及第39位Pro中的任何一个氨基酸残基或几个氨基酸残基突变或置换为其它氨基酸残基而成。α干扰素是目前临床上广泛应用的生物制品之一,主要治疗病毒性疾患,如慢性乙型肝炎、急慢性丙型肝炎、尖锐湿疣等,以及作为肿瘤和恶性血液病的辅助治疗。但在临床使用过程中有发热、厌食、痛阈提高、嗜睡、强直等一系列神经内分泌系统毒副作用,这些毒副作用与阿片受体有关。本发明通过改变α干扰素阿片样功能位点的结构,使其作用于神经内分泌系统所致的毒副作用减弱或消失。
文档编号A61P7/00GK1384116SQ02111690
公开日2002年12月11日 申请日期2002年5月16日 优先权日2002年5月16日
发明者蒋春雷, 王云霞 申请人:中国人民解放军第二军医大学