专利名称：：人干扰素样蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有高比活性的人干扰素样蛋白及其在制备抗肿瘤和抗病毒药物中的用途。
背景技术：
：干扰素(Interferon,IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质，由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，它们在同种细胞上具有广镨的抑制病毒复制、抑制肿瘤细胞生长及调节免疫功能等多种生物活性。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为IFN-oc、IFN-P、IFN-Y，其中IFN-oc和IFN-P为I型干扰素，IFN-Y为II型干扰素。同一型内按氨基酸组成差异再分20多个亚型，如ocl、oc2、ot3等。在同一亚型内又因氨基酸的差异而细分，如oc2干扰素有三种oc2a、ct2b、oc2c。按制备方法不同，可将千扰素分为利用基因工程生产的重组干扰素和人自然干扰素两大类。临床上常用的干扰素制剂为基因工程干扰素。基因重组人干扰素oc(rHuIFNoc)广泛应用于乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类乳头瘤病毒等病毒感染。我国是乙型肝炎大国，乙肝表面抗原携带率是9.75%。乙型患者使用干扰素停药半年以后15%的患者可以E抗原血清学转换，停药一年达到27%停药一年半达到32%,停药两年可以达到43%。目前为止我国的丙肝感染人群大概占到总体人群的3.2%,感染丙肝二三十年之后20%的人会发生肝硬化，我们国家根据十五期间总结的资料来看，感染丙肝二十年之后，16.7%的人发生肝硬化，干扰素是其主要治疗药物之一。在肿瘤治疗领域，rHuIFNa已被用于白血病、骨髄瘤、肾细胞癌、黑色素瘤等多种肿瘤的治疗，并证实有助于预防术后复发、控制肿瘤进展。干扰素oc的抗肿瘤机制主要包括通过抑制内皮细胞活性来抑制肿瘤血管生成，通过增强T淋已细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)以及巨噬细胞的免疫功能，以及增强肿瘤细胞的免疫源性等方式，增强机体的抗肿瘤免疫反应。此外，干扰素a还可以通过调控细胞周期和诱导洞亡等形式发挥直接的抗肿瘤作用。为进一步提高干扰素的临床疗效，临床上常将干扰素与其他药物用于治疗病毒性疾病和肿瘤。还有一种策略是在不改变干扰素蛋白序列前提下采用现代分子生物学或蛋白质化学的方法进行修饰，增强代谢稳定性，延长半衰期，从而提高临床疗效，如聚乙二醇(PEG)化干扰素、白蛋白或免疫球蛋白Fc片段与干扰素融合表达的融合蛋白等，其中PEG化干扰素已上市用于抗病毒治疗，一周给药一次，且临床疗效较普通干扰素好。但PEG化干扰素的缺点是PEG修饰会影响干扰素与其受体结合，导致干扰素活性有明显下降，另外副作用也有增加趋势。改造千扰素的基因以发现高活性的干扰素突变体是另外一种策略。安进公司(Amgen)发明的干复津是通过对13种天然千扰素a序列进行扫描，把最保守的氨基酸转移到各个对应的位置，并对4个氨基酸作了改变以便于分子构造，再利用化学合成方法生成一个非天然的DM序列，用基因工程的方法生产。干复津与千扰素oc-2b的差异在20/166个氨基酸(相当于88%同源性)，但干复津的抗病毒和抗肿瘤细胞增殖活性提高幅度有限，临床上主要用于抗HCV。
发明内容为了克服现有技术的不足，本发明的目的是在于提供系列的多核苷酸及其编码的具有人干扰素样生物学活性的蛋白质。本发明经过广泛深入的研究，出人意料地发现其中5个具有人干扰素样活性的蛋白质，这些新蛋白质具有显著的抗肿瘤细胞增殖活性，比干扰素ot-2b的活性高IO倍以上。进一步利用经典的干扰素体外活性测定法检测，5发现其抗病毒活性得到显著提高，比活性达2.Oxl09IU/mg以上，比干扰素ot-2b的活性高IO倍以上。基于本发明的结果，本发明的一方面涉及一种蛋白质，其特征在于其氨基酸序列包含选自SEQIDNO6至SEQIDNO10的氨基酸序列，或为在上述包含选自SEQIDNO6至SEQIDNO10的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人千扰素样生物学活性的氨基酸序列。本发明的另一方面涉及一种蛋白质，其中所述的包含选自SEQIDNO6至SEQIDNO10的氨基酸序列为SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、或SEQIDNO10。优选地，本发明的蛋白质具有比普通人干扰素ct-2b(rHuIFNot-2b)更强的抗肿瘤细胞增殖活性和抗病毒活性，更优选地，所述蛋白质体外抗肺瘤细胞增殖活性比普通人干扰素oc-2b(rHuIFNa-2b)强IO倍以上，最优选IO倍以上。本发明的又一方面涉及一种核苷酸序列，其特征在于其编码具有人干扰素样生物学活性的蛋白。本发明的又一方面涉及其序列为包含选自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5的核苷酸序列。本发明的又一方面涉及其序列为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SBQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO5。本发明的另一方面涉及与上述核苷酸序列在严格条件下杂交并编码具有人干扰素生物学活性的蛋白。本发明的再一方面涉及上述蛋白质或上述核苷酸序列在制备下述药物中的用途抗肿瘤药物、抗病毒药物和抗类风湿关节炎药物，其中，优选地，所述药物为与药学上可接受的载体、辅料或赋形剂组成的纟且合物。具体地，所述的肿瘤包括肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、食管癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌；所述6的病毒包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、获得性免疫缺陷病毒、单纯疱渗病毒。本发明的另一方面涉及在于提供一种含本发明所涉及的人干扰素样蛋白的药物组合物。本发明同时也涉及包含本发明所涉及的核苷酸序列的细胞、微生物或载体，其中所述的微生物例如可以选自大肠杆菌；所述的细胞可为动物细胞(例如昆虫细胞)或植物细胞；所述的载体可为质粒。具体而言，本发明采用如下技术方案釆用分子杂交法，克隆12种人干扰素ct的cDNA，通过酶切等方法产生断点不同、长短不一的核苷酸小片段，再将这些小片段混合，经多轮PCR扩增，不同分子的同源片段就会互相替换，随机组合，从而得到大量的同源基因分子间相互杂交的新分子。采用细胞筛选技术，对数万个克隆林进行抗肿瘤细胞增殖和抗病毒活性鉴定，成功筛选出了多个高活性、具有干扰素样活性的新型蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO6-10所示，对应的碱基序列如SEQIDNO1-5所示。体外实验表明，这些新型蛋白对淋巴瘤Daudi细胞的生长抑制作用是rHuIFNct-2b的200~400倍；在WISH-VSV系统上，其抗病毒比活性是rHuIFNa-2b的IO倍以上。对13林代表性人肿瘤细胞林，采用SRB法观察本发明的蛋白在体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用，结果发现本发明的蛋白对所有肿瘤细胞的抗增殖活性均明显强于rHuIFNot-2b(在10-1200倍之间)，其中对结直肠癌、肺癌等组织类型的肿瘤细胞株效果最显著。进一步进行抗肿瘤的体内试验，采用肝癌HepG2细胞、结直肠癌LS180细胞、人白血病HL-60(s)细胞和黑色素瘤A375细胞，对棵鼠进行体内抗肿瘤实验，结果显示，本发明的新型蛋白对棵鼠体内肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，呈剂量依赖性关系，且效果明显优于rHuIFNoc-2b。利用分泌HBV病毒颗粒的HepG2，2.15细胞观察系列人干扰素样蛋白的抗HBV活性。接种对数生长期的HepG2.2.15细胞于96孔板(2xl07孑L)，待细胞贴壁后各加入0.1和0.01pmol/L本发明的人干扰素样蛋白，或各加入O.l和O.01pmol/LrHuIFN-2b。之后，于37匸、5°化02的条件下培养9天。取细胞培养上清401/孔，用等量DNA提取液提取上清中的病毒DNA。吸取上清后，在余下每孔细胞中加3001核裂解液。提取HepG2.2.15细胞内基因组DNA，并用实时焚光定量PCR检测HBVDNA。结果显示，本发明的人干扰素样蛋白处理组的细胞培养上清和胞内的HBVDNA拷贝数明显低于培养液对照孔，效果明显优于rHuIFNot-2b。运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。本发明化合物或其组合物可用非胃肠道给药方式或口服方法。非胃肠道给药制剂的剂型有注射剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂、贴膜剂、乳骨剂和滴眼剂等；口服给药制剂的剂型可以是肠溶片等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备。进一步地，对于液体剂型，所用的溶剂例如选自水、乙醇、丙二醇、氯化钠；增溶剂例如选自聚山梨酯80和丙二醇；防腐剂例如为苯甲醇；緩冲液例如为乙酸铵等。对于栓剂等非液体制剂，其所用辅料例如选自十二烷基硫酸钠、甘油、三乙醇胺、羟苯乙酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、凡士林、羊毛脂等。含有本发明新型蛋白的制剂中还可含有其它辅料，例如选自赋形剂、表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等的辅料*在注射剂和栓剂等中含有本发明新型蛋白的剂量是以单元剂型中存在的蛋白质量计算的。在单元剂型中本发明新型蛋白质的一般含量为l-1000jag，优选的单元剂型含有10-100|ig。另外，本发明所述的严格的条件下指的是例如使用ECLdirectnucleicacidlabelinganddetectionsystem(AmershamPharmaciaBiotech公司制)，手册给出的条件(wash:42匸、含有0.5xSSC的primarywashbuffer)。为了更好的理解本发明的实质，下面将结合实施例对本发明进一步说明，但并不限制本发明的范围。本文中使用的主要测定仪器为PCR仪、ABI自动测序仪、细菌培养箱、细胞培养箱、超净工作台、倒置显微镜、酶标仪等。实验动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。除特殊注明外，采用的细胞培养液购自Gibco公司，Advantagew反转录试剂盒和cDNA引物(01igoDT18)(Clontech，USA)，普通Taq酶(NewEnglandBiolab,非高保真)，其余分子生物学试剂购自Invitrogen公司。图1本发明的人干扰素样蛋白Novaferonl的人工合成多核苷酸序列(A，SEQIDNO1)及其编码的氨基酸序列(B,SEQIDNO6)，与rHuIFNct-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较图2本发明的人干扰素样蛋白Novaferonl的人工合成多核苷酸序列(A，SEQIDNO2)及其编码的氨基酸序列(B，SEQIDNO7),与rHuIFNot-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较图3本发明的人干扰素样蛋白Novaferonl的人工合成多核苷酸序列(A，SEQIDNO3)及其编码的氨基酸序列(B，SEQIDNO8)，与rHuIFNoc-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较图4本发明的人千扰素样蛋白Novaferonl的人工合成多核苷酸序列(A，SEQIDNO4)及其编码的氨基酸序列(B，SEQIDNO9),与rHuIFNa-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较图5本发明的人干扰素样蛋白Novaferonl的人工合成多核苷酸序列(A，SEQIDNO5)及其编码的氨基酸序列(B，SEQIDNO10)，与rHuIFNot-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较具体实施例方式实施例l干扰素OC基因的扩增总mRNA来源于人外周血白细胞。IFNa的cDNA通过PCR方法扩增，扩增条件如下2.5jilIO倍扩增緩沖液，0.75|i1的10mMdNTPs，0.5nl25mM硫酸镁，0.25p1多聚合酶，0.75ju1mRNA，0.75ju1的5'端引物(10pM，IFNa05:5'-tggtgctcagct(a/g)caagtc-3')(SEQIDNO11)，0.75iu1的3'引物混合物(1,7pm/each;IFNct03-1:5'-aatcatttccatgttg(a/g)accag-3'(SEQIDN012);IFNa03-2:5'-aatcatttcccggttgtaccag-3'(SEQIDNO13);IFNoc03-3:5'-aatcatttccatgttgaaacag-3'(SEQIDNO14);IFNot03-4:5'-aatcatttcaagatgagcccag-3'(SEQIDNO15);IFNct03-5:5'-aatgattttcatgttgaaccag-3'(SEQIDNO16);IFNa03-6:5'-aatcattt(c/g)(c/g)atgttgaaccag-3'(SEQIDN017),IFNcc03-7:5'-atgcccctgtccttttctttac(SEQIDNO18);IFNa03-8:S'-gagtcgtttctgtgttggatcag"^)(SEQIDNO19)。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳分离，凝胶纯化，并根据制造商的建议方法克隆到pCRII-TOPO或pCR-4-TOPO载体中。利用ABI自动测序仪进行插入片段的DNA序列分析。克隆的所有12种人干扰素ot基因都分别与GeneBank中的序列比较，这些基因的GeneBank登录号分别为醒-024013(IFN-a1)，NM画000605(IFN-cc2)，NM-010504(IFN-ex4)，NM..010505(IFN-oc5)，NNL008335(IFN-a6)，NM隱008334(IFN-a7)，NM-008336(IFN-a8)，NM—002171(IFN-oc10)，NM—002172(IFN-a14),NM-002173(IFN-a16)，NM—021268(IFN-a17)，NM—002175(IFN-oc21)—致。实施例2构建人干扰素a基因分子杂交文库为构建穿梭(shuffling)质粒，根据每个HuIFN-ot的核苷酸序列，分别设计了5，和3，端引物，其中5，端引物带BamHI切点，3，10端引物带EcoRI切点。以上述克隆的带有干扰素oc基因的为模板，通过标准的PCR反应扩增出12种HuIFN-ot的开放阅读框(Openreadingframe,ORF)，BamHI和EcoRI酶切后，与相同酶切的大肠杆菌表达载体pBVB连接，最后进行序列分析，验证构建的带人干扰素oc基因的质粒。分别以前述构建的12种带人干扰素cc基因的质粒为模板，以BVF4:5'-agggcagcattcaaagcag-3'(SEQIDNO20)和BVR3:5'-tcagaccgcttctgcgttctg-3'(SEQIDNO21)为引物，进4亍PCR扩增，并将扩增的产物等量混合。随后按照文献(StemmerWPC.DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:Invitrorecombinationformolecularevolution.PNASvol:91:10747-10751，1994)介绍的方法进行DNaseI酶解和PCR组装。以PCR组装的产物为模板，用引物BVF:5'-gaaggctttggggtgtgtg-3'(SEQIDNO22)和BVR:5'-aatcttctctcatccgc-3'(SEQIDNO23)，进4亍二次扩增。二次扩增产物用BamHI和EcoRI与相同酶切的大肠杆菌表达载体pBVB连接，连接产物转化大肠杆菌DH5oc，即为人干扰素oc基因分子的杂交文库。在以上所有PCR扩增和PCR组装中，都使用普通的DNA聚合斷NewEnglandBiolab，USA)，而不是高保真DNA聚合酶。实施例3筛选分子杂交文库新鲜转化的大肠杆菌DH5oc直接涂布接种于含50ng/ml氨苄青霉素的LB平板上，并于37C下过夜。挑单个菌落接种于96孔板，每孔内有100nl含50ng/ml的氨爷青霉素LB培养基(LBA)，震荡培养过夜。次日，取10pl饱和生长的细菌培养物依次接种于96孔板(复制板)，每孔内有10QjalLBA培养基；原细菌培养板，暂时贮存于(储存板)。将复制板置于30C，震荡培养至OD,-O,4，然后快速升温至42'C。经过4小时的热诱导，细菌培养板直接移入-80x:冰箱，并冻融两次。然后，再细菌裂解物液稀释至所需的浓度，吸样加至Daudi细胞培养体系内测试抗肿瘤细胞增殖活性，或加至Wish细胞的培养体系内测试抗病毒活性。每一轮大约筛选10，000菌落，初步筛选出100个抗肺瘤细胞增殖或抗病毒活性最高的菌落，进入进一步验证性测试依据上述选定的活性最高的细菌培养物编号，从储存板上将保存的细菌划线接种于LBA平板，37。C下培养过夜，次日挑单菌落接种于1毫升的LBA液体培养基，30"C、250rpm震荡过夜。然后，将40ju1经培养的细菌接种在另一组试管之一中，试管中含有lml加了氨苄青霉素(50pg/ml)的LB。然后，按上文中介绍的初筛步骤，让样品经历以下步骤42X:诱导表达、收集细菌培养物、冷冻-解冻循环处理，测试每一个细菌裂解物液抗胂瘤细胞增殖活性和抗病毒活性。每一轮篩选过程中，经过验证性测试后选取约20个抗肿瘤细胞增殖或抗病毒活性最高的菌落，提取质粒，用BVBF:5'-accatgaaggtgacgctc-3'(SEQIDNO25)为引物对质粒及其插入片段进行自动DNA序列分析。在序列分析的基础上，剔除个别DM序列完全相同的克隆，然后用表达载体pBVB的多克隆位点上游和下游的侧翼序歹'J，i殳计引物BVBF:5'—accatgaaggtgacgctc—3'(SEQIDNO25)和BVR:5'-aatcttctctcatccgc-3'(SEQIDNO24)进行PCR扩增，产物用于下一轮改组文库的构建，然后重复上述筛选步骤。从上述if轮筛选中得到的5个抗病毒和抗肿瘤细胞增殖活性最高的大肠杆菌克隆，提取质粒并测序，其所带的、编码新型蛋白的多核苷酸序列(SEQIDN01-5)分别命名为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5;依据密码子表，上述多核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO6-10)相应为SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10,上述含多核苷酸序列(SEQIDNO1-5)的质粒用于下一步构建重组表达质粒和工程菌。实施例4在大肠杆菌中表达并纯化重组干扰素样蛋白将人工添加起始密码子ATG的SEQIDNO1-5的多核苷酸序列分别克隆入温度可诱导的pBVB栽体中，位于入PRPL启动子的调控之下，重组表达质粒名称分别为pBVBNFl、pBVBNF2、pBVBNF3、pBVBNF4、pBVBNF5。将重组表达质粒分别转化到大肠杆菌DH5ot中。分别挑取单个菌落，接种于2ml含50jlig/ml氨节青霉素的LB培养基中，并在30C下振荡培养8小时。然后取2ml培养的细菌，进一步用50ml含50jug/ml氨千青霉素的LB培养基中，并在30X:下振荡培养过夜。再将上述细菌按l:10~1:20的比例接种于含50jug/ml氨千青霉素的大体积的LB培养基中，并于3ox:下振荡培养。当培养物达到指数生长中期时(A55。-0.5~0.6)，将培养温度快速升高至42°0并维持4小时,以便诱导干扰素样蛋白的表达。经过4小时的热诱导后，将细菌离心并用PBS(137mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2P04,2mMKHP04)洗涤3次，然后保存在-8(TC直至进行纯化。将菌体按l:10的比例悬浮于20raMPB、0，5MNaCl、pH7.6的緩沖液中，2-8t:搅拌至全溶，进行超声破碎。在水浴条件下600W工作5s，间隔9.9s，共12min。镜检破菌率大于85%,将菌体破碎后的悬液10000rpm、25min离心，收获破菌上清液。上清液按1:25比例用1MNaCl溶液稀释，酸化调pH至3~4。4。C放置2小时后离心。0.45pm过滤，滤出液用碱调pH至7.6~8.O，上色谱柱层析。将上清液加载至PhenylSepharose6快速流动柱(GBHealthcare,US)上并通过。将含有目的蛋白组份加到POROS50D柱(AppliedBiosystem，US)柱进行纯化。最后，将收集到的干扰素样蛋白分子进一步用HiLoad26/100Superdex75pg(Amersham,Us)进行纯化，得到蛋白纯品干扰素样蛋白。将纯化的干扰素样蛋白分别命名为Novaferonl、Novaferon2、Novaferon3、Novaferon4、Novaferon5，其相应的氨基酸序列为SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10。纯化的干扰素样蛋白经过15%的SDS-PAGE检测验证，结果显示重组干扰素样蛋白均为一条带，分子量(MW)为1920KDa。等电点5.6~7.6。高分辨质谱分析表明，纯化的重组千扰素样蛋白分子纯度大于98%，分子量均为19.3KDa。实施例5重组人干扰素样蛋白(Novaferonl-5)的抗病毒活性按照《中华人民共和国药典》2005年版三部附录XC细胞病变抑制法进行测定。WISH细胞、水疱性口炎病毒(VSV)及rHuIFNct-2b标准品由中国药品生物制品检定所提供。将生长24~48h的Wish细胞(于含10%小牛血清的MEM培养基)配成细胞浓度约为3x107ml的悬液，加到96孔细胞培养板上，100ju1/孔。同时设立标准品对照孔，体积与样品相同。在含5仏02，37T孵箱中培养4~6h后，每孔加入4倍系列稀释的干扰素样蛋白(Novaferonl-5)样品100ju1，样品稀释用含7°/。小牛血清的MEM培养液，37X:培养1824h。弃上清后用含3。/。小牛血清MEM培养基稀释的VSV病毒(100TCIDs。)攻击，然后于含5°化02，37r孵箱中培养24h左右。弃掉培养板中的上清液，每孔加入40jul的结晶紫液室温染色30min，弃掉染液，用自来水冲洗残余的染液，用滤纸吸干后每孔加入100iul的脱色液脱色，在全自动酶标仪(MK3型)上于570nm波长处测定每孔的吸收值(A)。每个试验重复3次，取平均值。干扰素样蛋白(Novaferonl-5)与rHuIFNot-2b标准品在同一块板中测试。纯化的干扰素样蛋白(Novaferon1-5)在经典的WISH-VSV体系中测得的抗病毒活性分别为2.2xl09IU/mg、2.5xl09lU/mg、3.0x109IU/mg、2.5x109IU/mg、2.7x10'IU/mg。而rHuIFNot-2b标准品的抗病毒活性为2.0xl09IU/mg。实验结果表明，干扰素样蛋白(Novaferonl-5)的抗病毒活性为rHuIFNot-2b的11~15倍。实施例6重组人干扰素样蛋白(Novaferonl-5)的抗肿瘤细胞增殖活性人肿瘤细胞林如下结肠癌细胞林DLD-1、LS18Q、人前列腺癌细14胞林PC-3、DU-145、人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、人胃癌细胞林MKN-1、人黑色素瘤细胞株A375、人肺腺癌细胞林A549、人乳腺癌细胞林MCF-7、人B淋巴瘤细胞林Daudi、人T淋巴瘤细胞林CCRF-CEM、髄性白血病细胞株HL-60(S)(表l),购自中国医学科学院基础医学研究细胞库。用含10%胎牛血清的1640培养液培养，其中A375用含10%胎牛血清的DMEM培养液(高糖)。处于指数生长期的细胞经胰酶消化后，计数，稀释成适当浓度的细胞悬液，接种于96孔板，每孔10(mi，接种细胞数见表l，待细胞完全贴壁后，加入重组人干扰素样蛋白(Novaferon1-5)或rHuIFNa-2b，5(mi/孑L，Novaferon1-5的终浓度在100pmol/L~0.0001pmol/L之间，rHuIFNoc-2b的终浓度在500pmol/L0.01pmol/L之间。培养6天后，加预冷的50。/。TCA液，50W/孔，使其终浓度为10%三氯醋酸(TCA)。固定，4。Cl小时。弃固定液，用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥，每孔加入10(mi磺基罗丹明B(SRB)液，室温放置IO分钟，未与蛋白结合的SRB用ly。醋酸洗5遍，空气干燥，用150孔10mmol/LTris碱溶液(pH10.5)溶解结合的SRB，用酶标仪在540nm波长测其吸光度(A)。实验设培养液对照孔(用培养液代替重组人干扰素样蛋白或rHuIFNoc-2)，所有浓度设三个重复孔。肿瘤细胞生长抑制率(％)=(培养液对照孔A值-受试药物A值)/培养液对照孔Axl00%，再用0rigin2.94软件拟合得出半数生长抑制浓度(IC5。)。结果发现，重组人干扰素样蛋白(Novaferoal~5)均具有显著l抗肿瘤细胞增殖活性，其IC5。与普通HuIFNot-2b比较，低50倍以上，表明这些蛋白对实体瘤和血液系统肿瘤均具有显著的抑制作用(表2-表6)。15表1实验所用细胞株及接种的细胞数量细胞数/孔DLD-12謂LS1804000PC-33000DU-1452000HepG24000SMMC-77215000MKN-15000A3755000A5495000MCF-74000Daudi2000CCRF-CEM4500HL-6Q(S)4500表2Novaferonl和HuIFNa--2b抑制肿瘤细胞生长的IC,。及两者之比细胞抹IC53(pmol/L)倍数HuIFNa-2bNovaferonlHuIFNoc-2b的IC5。/Novaferonl的IC5。DLD-118.23070.0907201tst^汰230PC-359.94240.3122192DU-14548.69900.2319210HepG29.81000.0654150SMMC-77216.23380.0439142MKN-124.67380.2419102A37524.78630.1221203A54998.90090.8311119MCF-781.51430.982183Daudi7.30320.0179408CCRF-CEM23.68740.320174HL-60(S)97.47580.3271298表3Novaferon2和HuIFNoc-2b抑制肿瘤细胞生长的I"及两者之比细胞林IC5。(pmol/L)倍数HuIFNa-2bNovaferon2HuIFNoc-2b的IC5。/Novaferon2的IC5。DLD-14.22670,,0219193LS1809.07200.,0432210PC-366.68150,,3455193DU-14581.64800.,432189HepG24.52760.0343132SMMC-77213.45000.,023150MO-l31.54620.,321998A37544.56320,2321192A54995.12960.7432128MCF-782.89541.023481Daudi4.11320.0091452CCRF-CEM20.73330.329163HL-60(S)70.97490.2439291表4Novaferon3和HuIFNa--21)抑制肿瘤细胞生长的I"及两者之比细胞抹IC50(pmol/L)倍数Hu訓a-2bNovaferon3HuIFNoc—2b的IC5。/Novaferon3的IC5。DLD-14.24410.0329129LS1804.11090.0213193PC-344.79840.4392102DU-14590.08520.5493164HepG23."040.6别i2iSMMC-77211.67660.0166101MKN-142.84540.549378A37549.57260.3219154A549177.39481.3439132MCF-7109.73342.032154Daudi3.76560.0072523CCRF-CEM17.99280.321356HL-60(S)90.84600.4326210表5Novaferon4和HuIFNoc-2b抑制肺瘤细胞生长的ICs。及两<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例7重組人干扰素样蛋白(Novaferonl-5)抑制棵鼠移植人肿瘤生长试验采用人肝癌HepG2细胞、人结直肠癌LS180细胞、人白血病HL-60(s)细胞和人黑色素瘤A375细胞，移植在棵鼠皮下，观察重组人干扰素样蛋白(Novaferonl-5)的体内抗肿瘤效果。Balb/c'棵鼠，4-6周，体重14~16g，雌性，SPF级，购自中国医学科学院实验动物研究所，饲养于国家北京药物安全评价研究中心(屏障环境)。动物实验室空气定时排风，室温16~25匸，湿度40~70%，光照12小时明暗交替。每笼饲养5只动物，喂食实验动物中心专门为小鼠配制的饲料，每天上、下午定时各饲食和加消毒水1次。试验开始前，观察动物进食、活动和精神等l周。实验动物许可证号SCXK京2005-0013。实验动物使用许可证号SYXK(军)2002-016。rHuIFNct-2b注射液商品名为甘乐能，先灵葆雅(不列纳)有限公司(SP(Brinny)Company)生产。取棵鼠体内传二代的指数生长期的人肝癌细胞抹HepG2、人结直肠癌LS180细胞、人白血病HL-60(s)细胞和人黑色素瘤A375细胞，用PBS洗涤二次，配成如下细胞浓度HepG2细胞为6x106/0.3ml、LS180细胞为4x1070.3ml、HL-60(s)细胞为2x107/0.3ml、A375细胞为8x1070.3ml，接种于右下肢外侧皮下。接种后8天(瘤体积约为150咖3)后，取在接种部位可明显触及肿块的棵鼠，按肿瘤体积大小均衡的原则分组。上述荷瘤棵鼠分成以下几组才莫型对照组、Novaferonl低剂量组和高剂量组、Novaferon2低剂量组和高剂量组、Novaferon3低剂量组^高刑量组、NovaferoiH低剂量组和高剂量组，Novaferon5低剂量组和高剂量组和rHuIFNa-2b低剂量和高剂量组。低剂量和高剂量务别为20Pg/kg、100Hg/kg。每组为8~10只。每周称体重1次，按体重调整给药量。分组后当天开始给药，给药体积为0.3ml，模型对照组注射同样体积的PBS。给药途径为sc，每天给药一次，连续给药时间为21天。实验结束称体重后，釆用安死术处置小鼠，小心剥离瘤块，称瘤重。肿瘤生长抑制率(％)-(模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重)xl00。结果表明，分别接种多林人肿瘤细胞后，给予Novaferonl-5，均19能显著棵鼠皮下肿瘤细胞的生长，以对LS180细胞比较敏感，Novaferon5的作用较强，以高剂量的作用较为明显，Novaferonl-5的作用显著强于同剂量的阳性对照药物rHuIFNoc-2b(表7)。表7Novaferon(l-5)或rHuIFNct-2b抑制棵鼠移植人肿瘤细胞<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例8重组人干扰素样蛋白(Novaferonl-5)抗HBV试验利用分泌HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞观察系列人干扰素样蛋白的抗HBV活性。胰蛋白酶消化2.2.15细胞后分散成单个细胞悬液，接种于96孔板，2x1071801/孔。待细胞贴壁后加不同浓度的Novaferonl-5或rHuIFNct-2b，浓度分别为O.1、0.01p迈ol/L，201/孔。每个浓度2个复孔，设细胞对照孔和培养液对照孔。3了x:、5°化02孵育9d。培养至3天和6天时分别换含药物的培养液各1次。取上述细胞培养上清401/孔，加等量DNA提取液吹匀。沸水浴10分钟(误差不超过1分钟)，转至41C静置8~12小时以保证病毒颗粒充分裂解。10，000rpm离心5分钟，取上清保存DNA于41C备用。吸取上清后，在余下每孔细胞中加300l核裂解液。吹打均勻至细胞充分裂解，同一浓度的两孔合转移至一个1.5mlEP管中合并。加31RNA酶，颠倒3-5次，37X:,15-30min,室温冷却5min。加2001蛋白沉淀液，涡旋20秒，水浴5min。离心16000g,4min(可见蛋白沉淀成白色球状)。小心吸上清至另一含6001室温异丙醇的1.5mlEP管中，轻轻颠倒数次至DNA呈线状物质出现。离心16000g，4min(DNA呈白色针点状物质出现)，小心用吸水纸吸去上清。加70%室温乙醇600l，轻轻颠倒洗DNA，离心16000g，lmin，室温。小心用吸水纸吸去上清。室温，置于吸水纸上，风干，10~15min，加100mlDNA再水合液。65X:，lh，期间，间隔轻敲EP管底部，离心，6000rpm，数秒。检测DNA浓度后，保存DNA于-20X:。以上基因组DNA在核酸蛋白检测仪上测0D綱计算相应的DNA浓度。并根据测得的浓度取其101将其稀释至同一浓度。取21HBV上清DNA(或21稀释至同一浓度的基因组DNA)，加入HBVDNAPCR荧光检测试剂盒中的PCR反应管中(已加入HBVDM特异性引物、一条HBVDNA特异性荧光探针、耐热TaqDNA聚合酶、四种核苷酸单体(dNTPs)、PCR反应液)。同时取试剂盒中自带阳性标准品，10倍稀释设5(4)个浓度梯度，分别对应于HBVDNA拷贝数1卞1&8,1xl07，1xt^6，lx105，1乂1&4。加入PCR反>^#中，曲线进行质量控制，最低检测限为1x103基因拷贝/反应。6，000rpm离心数秒，放入ABI7000实时定量PCR仪中。反应条件按照试剂盒说明书。结果显示，Novaferonl-5的高、中浓度都有抑制HepG2.2.15上清和细胞中HBVDM拷贝数的效果，高浓度效果优于低浓度。rHuIFNoc-2b高浓度也有抑制作用，但低浓度作用比较弱(表8)。预试验结果发现，Novaferon和rHuIFNoc-2blFNot-2b对2.2,15细胞抹的HBsAg和HBeAg分泌影响不明显，文献报道也如此，故本研究不测细胞培养上清中HBV抗原的水平。此结果表明，Novaferonl-5有显著的抑制HBVDNA复制的活性。表8Novaferonl-5对HepG2.2.15细胞HBVDNA拷贝数的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注抑制率-(细胞对照中HBVDNA的拷贝数-样品中HBVDNA的拷贝数)/细胞对照中HBVDNA的拷贝数x100。/0。序列表<110〉杰华生物技术(北京)有限公司<20〉人干扰素样蛋白及其用途<130〉2008-12-24〈170>Patentlnversion3.3<210〉SEQIDNO1<211>498<212〉DNA<213〉人工序列<400〉1tgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacag60atgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgactttgaatttccccag120gaggagtttgatggcaaccagttccaaaaggctgaaaccatccctgtcctccatgagatg180atccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgct.tgggatgagacc240ctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtg300atacaggaggUggggtggaagagactcccctgatgaatgcggactccatcctggctgtg360aagaaatacttccaaagaatcactctttatctgatggagaagaaatacagcccttgtgcc420tgggaggttgtcagagtagaaatcatgagatccctctctttttcaacaaacttgcaaaaa480agattaagggggaaggat498<210>SEQIDNO2<211〉498<212>DNA<213>人工序列<400>2tgtaatctgtctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacag60atgaggagaatctctcUttctcctgcttgaaggacagacatgactttgaatttccccag120gaggagtttgatggcaaccagttccaaaaggctgaaaccatccctgtcctccatgagatg180atccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagacc240ctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtg300atacagggggtgggggtgacagagactcccctgatgaaggcggactccatcctggctgtg360aagaaatacttccaaagaatcactctttatctgatggagaagaaatacagcccttgtgcc420tgggaggttgtcagagtagaaatcatgagatccctctctttttcaacaaacttgc犯aaa480agattaagggggaaggat498〈210〉SEQIDNO3〈211〉498〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉3tgtaatctgtctcaaacccacagcctgggtagcaagaggaccttgatgctcctggcgcag60atggggaaaatctcccttttctcctgcctgaaggacagacatgactttgaatttccccag120gaggaatttgatggcaaccagttccagaaagctgaaaccatccctgtcctccatgagatg180atccagcagatcttcaatctcttxagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagacc240ctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtg300atacagggggtgggggtgacag卿ctcccctgatgaaggaggactccattctggctgtg360aggaa自cttcc犯卿atcactctttatctgatggagaagaaatacagcccttgtgcc420tgggaggttgtcagagtagaaatcatgagatccctctctttttc肌caaacttgcaaaaa480卿ttaagggggaaggat498<210〉SEQIDNO4<211〉498〈212〉腿〈213〉人工序列<400〉4tgtaatctgtctcaaacccacagcctgggtagcaagaggaccttgatgctcctggcgcag6024atggggaaaatctcccttttctcctgcctgaaggacagacatgactttgaatttccccag120gaggaatttgatggcaaccagttccagaaagctcaagccatctctgtcctccatgagctg180atccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggaatcatctgctgcttgggatgagggc240ctcctagacaaattccgcaccgaactctaccggcagctaaatgacttggaagcctgtatg300atacagggggtgggggtgacagagactxccctgatgaaggaggactccattctggctgtg360aggaaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaataceigcccttgtgcc420tgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaa480agattaagggggaaggat498〈210〉SEQIDNO5<211〉498<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉5tgtaatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaagaggaccttgatgctcctggcgcag60atgaggaaaatctcccttttctcctgcctg肌ggacagacatgactttgaatttccccag120gagg犯tttgatggcaaccagttccagaaagctcs肌ccatctctgtcctccatgagctg180atccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggaatcatctgctgcUgggatgagggc240ctcctagacaaattccgcaccgaactctaccggcagctaaatgacttggaagcctgtatg300atacaggaggttggggtgacagagactcccctgatgaaggcggactccatcctggctgtg360aagaaatacttccaaagaatcactctttatctgaaagagaagaaatacagcccttgtgcc420tgggaggttgtcagagtagaaatcatgagatccttttctttttcaacaaacttgcaagaa480agattaagggggaaggaa498〈210〉SEQIDNO6<211〉166<212>PRT<213>人工序列<400〉6CysAspLeuProGinThrHisSerLeuGlySerArgArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGinMetArgArglieSerLeuPheSerCysLeuLysAsp202530ArgHisAspPheGluPheProGinGluGluPheAspGlyAsnGinPhe354045GinLysAlaGluThrlieProValLeuHisGluMetlieGinGinlie505560PheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluThr65707580LeuUuAspLysPheTyrThrGluLeuTyrGinGinUuAsnAspLeu859095GluAlaCysVallieGinGluValGlyValGluGluThrProLeuMet100105110AsnAlaA印SerlieLeuAlaValLysLysTyrPheGinArglieThr115120125LeuTyrLeuMetGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgValGlulieMetArgSerLeuSerPheSerThrAsnLeuGinLys145150155160ArgLeuArgGlyLysAsp165<210〉SEQIDNO7〈211>166<212〉PRT<213>人工序列<400〉7CysAsnLeuSerGinThrHisSerLeuGlySerArgArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGinMetArgArglieSerLeuPheSerCysLeuLysAsp202530ArgHisAspPheGluPheProGinGluGluPheA印GlyAsnGinPhe354045GinLysAlaGluThrlieProValLeuHisGluMetlieGinGinlie505560PheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluThr65707580LeuLeuAspLysPheTyrThrGluLeuTyrGinGinLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysVallieGinGlyValGlyValThrGluThrProLeuMet100105110LysAlaAspSerlieLeuAlaValLysLysTyrPheGinArglieThr115120125LeuTyrLeuMetGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgValGlulieMetArgSerLeuSerPheSerThrAsnLeuGinLys145150155160ArgLeuArgGlyLysAsp165<210>SEQIDNO8<211>166<212>PRT<213>人工序列<400>8CysAsnLeuSerGinThrHisSerL.euGlySerLysArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGinMetGlyLyslieSerLeuPheSerCysLeuLysAsp202530ArgHisA印PheGluPheProGinGluGluPheA印GlyAsnGinPhe354045GinLysAlaGluThrlieProValLeuHisGluMetlieGinGinlie505560PheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluThr65707580LeuLeuAspLysPheTyrThrGluLeuTyrGinGinLeuAsnAspLeu85恥95GluAlaCysVallieGinGlyValGlyValThrGluThrProLeuMet28100105110LysGluAspSerlieLeuAlaValArgLysTyrPheGinArglieThr115120125LeuTyrLeuMetGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgValGlulieMetArgSerLeuSerPheSerThrAsnLeuGinLys145150155160ArgLeuArgGlyLysAsp165<210〉SEQIDNO9<211〉166<212>PRT.<213>人工序列<400〉9ArgLysTyrPheGinArglieThrLeuTyrLeuLysGluLysLysTyr151015SerProCysAlaTrpGluValValArgAlaGlulieMetArgSerPhe202530SerLeuSerThrAsnLeuGinGluArgLeuArgGlyLysAsplieGin354045GinThrPheAsnLeuPheSerThrLysGluSerSerAlaAlaTrpAsp505560GluGlyLeuLeuAspLysPheArgThrGluLeuTyrArgGinLeuAsn65707580AspLeuGluAlaCysMetlieGinGlyValGlyValThrGluThrPro859095LeuMetLysGluAspSerlieLeuAlaValCysAsnLeuSerGinThr100105110HisSerLeuGlySerLysArgThrLeuMetLeuLeuAlaGinMetGly115120125LyslieSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGluPhe130135140'ProGinGluGluPheAspGlyAsnGinPheGinLysAlaGinAlalie145150155160SerValLeuHisGluLeu165<210〉SEQIDNO10<211>166<212>PRT<213〉人工序列<400>10CysAsnLeuProGinThrHisSerLeuGlySerLysArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGinMetArgLyslieSerLeuPheSerCysLeuLysAsp202530ArgHisA印PheGluPhePrcTGlnGluGluPheAspGlyAsnGinPhe354045<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula><221〉misc—feature<222〉(13)..(13)<223>n为a,c,g,ort<400〉11tggtgctcagctncaagtc19<210〉SEQIDNO12<211>22<212>隱<213〉人工序列〈220〉<221〉variation<222>(17)..(17)<223>n=a/g<220><221〉misc—feature<222〉(17)..(17)<223〉n为a,c'g，ort<400〉12aatcatttccatgttgnaccag22〈210〉SEQIDNO13<211〉22<212〉腿<213〉人工序列<400>13aatcatttcccggttgtaccag22<210>SEQIDNO14<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<400>14aatcatttccatgttgaaacag"<210>SEQIDNO15<211>22<212>DNA<213>人工序列〈400〉15aatcatttcaagatgagcccag<210>SEQIDNO.16<211>22<212>DNA<213〉人工序列<400>16aatgattttcatgttgaacc<210>SEQIDNO17<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<220>〈221>vsriation<222〉(9)..(9)<223>n=c/g<220〉<221>misc—feature<222〉(9)..(10)<223>n为a，c，g,ort<220〉<221〉variation<222〉(IO)..(IO)<223〉n=c/g<400〉SEQIDNO17aatcatttnnatgttgaaccag说明书第30/32页2222<210〉18<211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<400〉18atgcccctgtccttttctttac22<210〉SEQIDNO19<2il〉23<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉19gagt.cgtttctgtgttggatcag23<210>SEQIDNO20<211〉19<212〉DNA<213〉人工序列<400>20agggcagcattcaaagcag19<210>SEQIDNO21<211〉21〈212〉DNA<213>人工序列<400>21tcagaccgcttctgcgttctg21<210>22<211〉19<212〉DNA<213〉人工序列<400>22gaaggctttggggtgtgtg19<210〉SEQIDNO23<211〉17<212>腿<213〉人工序列<400>23aatcttctctcatccgc<210>SEQIDNO24<211>17<212〉DNA<213>人工序列<400〉24aatcttctctcatccgc<210〉SEQIDNO25<211〉18<212〉DNA<213>人工序列<400>25accatgaaggtgacgctc说明书第32/32页17173权利要求1.蛋白质，其特征在于其氨基酸序列包含选自SEQIDNO6至SEQIDNO10的氨基酸序列，或为在所述包含选自SEQIDNO6至SEQIDNO10的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人干扰素样生物学活性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述的包含选自SEQIDNO6至SEQIDNO10的氨基酸序列为SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、或SEQIDNO10。3.核苷酸序列，其特征在于其编码权利要求1-2中任一项所述的蛋白质。4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其序列为包含选自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其序列为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO5，或为在序列。6.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或权利要求3-5中任一项所述的核苷酸序列在制备下述药物中的用途抗肺瘤药物、抗病毒药物和抗类风湿关节炎药物，其中，优选地，所述药物为与药学上可接受的栽体、辅料或赋形剂组成的组合物。7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的肿瘤包括肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、食管癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌。8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的病毒包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、获得性免疫缺陷病毒、单纯疱渗病毒。9.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或权利要求3-5中任一项所述的核苷酸序列以及任选的药学上可接受的栽体。10,—种微生物，其包含权利要求3-5中任一项所述的核苷酸序列。全文摘要本发明涉及系列高活性重组人干扰素样蛋白(SEQIDNO6-10)及其在抗肿瘤和抗病毒药物的应用。利用人干扰素α的基因，通过基因改组技术获得新型的、但与人天然干扰素α高度同源的核苷酸序列(SEQIDNO1-5)，通过大肠杆菌表达并纯化得到的新型蛋白，其抗肿瘤细胞增殖活性和抗病毒活性较普通的重组人干扰素α-2b显著增强。文档编号C07K14/56GK101475636SQ20091007717公开日2009年7月8日申请日期2009年1月19日优先权日2009年1月19日发明者刘龙斌,吕秋军,孙俭波,杨子义,王敏荣,王海涛申请人:杰华生物技术(北京)有限公司