专利名称：：一种改良重组猪α干扰素蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组改良猪a干扰素蛋白及其编码基因与应用。技术背景干扰素是细胞对病毒感染或各种合成及生物诱生作用反应而产生并分泌的一类天然生成的蛋白分子，分子量为15,000-21，000道尔顿。已经确定的干扰素有两大类I型和II型。I型干扰素包括IFN-a、IFN-P、IFN-"和IFN-t四个亚型，II型干扰素主要有IFN-Y。猪干扰素a、0、Y的基因序列均已报道，并在原核和真核表达系统中实现重组表达，表达产物具有抗病毒活性，为基因工程干扰素的规模化生产和应用提供了依据。1965年Goldestein等人从动物胸腺中分离到有生物活性的多肽类分子，命名为胸腺素(Thymosin)。1972年Goldestein等进一步纯化所得到的分子量在l-15KD的组分，称之为胸腺肽组分5(Thymosin,TF5)，胸腺肽组分5用于动物研究和临床观察，有补偿胸腺功能低下的作用。胸腺肽a1(Thymosina1，Ta1)是胸腺肽组分5多肽混合物中活性最强的多肽之一，具有促进T-淋巴细胞分化、成熟和增强细胞免疫的功能。目前国外已将其肽合成产品应用于临床，用于对肿瘤、乙肝、丙肝及免疫缺陷等的治疗研究，并取得了良好的效果。
发明内容本发明的目的是提供一种重组改良猪a干扰素蛋白。本发明所提供的重组蛋白，名称为PoIFN-a，具有干扰素和胸腺肽两者的生物活性，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有干扰素和胸腺肽活性的由(a)衍生的蛋白质。为了使(a)中的PoIFN-a便于纯化，可在由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的PoIFN-d可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的PoIFN-a的编码基因可通过将序列表中序列2的DM序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端连上信号肽的编码序列，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述PoIFN-ci的氨基末端添加上信号肽序列。上述重组蛋白的编码基因(尸oi7W-")也属于本发明的保护范围。所述重组蛋白基因，具体可为如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下可与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重组蛋白的DNA分子。序列表中的序列2是由615个脱氧核糖核苷酸组成，自5'端第1-612位脱氧核糖核苷酸为编码序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的DNA分子。上述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交并用该溶液洗膜。含有上述重组蛋白基因的重组表达载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种表达重组蛋白的方法。本发明所提供的表达重组蛋白的方法，是将所述的重组蛋白基因通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达重组蛋白的重组细胞，培养该重组细胞，表达得到重组蛋白。所述表达载体为pBV220、pET载体系列、pQE载体系列或pPIC9K，具体为pBV220。所述宿主细胞为大肠肝菌DH5a、TBI或BL21(DE3)，具体为大肠肝菌DH5a。所述表达可为诱导表达，诱导表达温度具体为42°C，诱导表达时间为6-8小时。本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗猪病毒感染性疾病的药物。本发明所提供的预防和/或治疗猪病毒感染性疾病的药物，它的活性成分是上述重组蛋白。所述猪病毒感染性疾病包括猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)、猪流行性腹泻、传染性胃肠炎、轮状病毒感染、猪瘟、圆环病毒II型感染、伪狂犬病、猪流感、水疱病和细小病毒病等。所述预防和/或治疗猪病毒感染性疾病的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。所述预防和/或治疗猪病毒感染性疾病药物的用量一般为40万U/头/次，连续给药或隔天给药，一般给药3-7天。本发明的重组蛋白能在大肠杆菌中高效表达，表达量达菌体总蛋白的60%以上，重组蛋白复性回收率达70%以上，远远超过目前干扰素的复性效率，而且周期短，成本低。本发明的重组蛋白对猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)、猪流行性腹泻、传染性胃肠炎、轮状病毒感染、猪瘟、圆环病毒II型感染、伪狂犬病、猪流感、水疱病、细小病毒病具有抗感染作用，可以明显提高动物免疫力，增加抗病能力。图1为琼脂糖凝胶电泳检测重组蛋白基因的PCR扩增结果图2为重组蛋白基因的拼接示意3为SDS-PAGE检测重组蛋白在大肠杆菌中表达产物结果图4为重组蛋白基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱图图5为经纯化的重组蛋白的SDS-PAGE检测结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。所有引物合成及测序工作均由北京三博远志生物公司完成。实施例l、重组蛋白基因的合成及其表达根据密码子的兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏向性，本发明设计了含大肠杆菌喜好密码子的胸腺肽al编码基因，并将其偶联于猪a干扰素基因的5'端，来构建重组蛋白PoIFN-a基因，从而提高该重组蛋白基因的表达水平，PoIFN-a的拼接示意图如图2所示。具体的实验方法和结果如下一、胸腺肽al基因的合成参照胸腺肽al基因序列(GENBANK号J02524)，重新优化序列，替换稀有密码子，调节AT含量，使其可在大肠杆菌中高效表达，并在基因的5'端引入起始密码子和￡CORI限制性内切酶酶切位点，3'端引入甘氨酸/丝氨酸连接序列和Sa/^I限制性内切酶酶切位点，交由北京三博远志生物公司采用重叠PCR方法合成优化的胸腺肽a1基因序列，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。二、猪a干扰素基因的扩增参照猪a干扰素基因序列(GENBANK号M28623)，在其成熟蛋白编码序列两端设计引物(上游5'-GGCAGATCTGGTGGCGGGGGAAGCTGTGACCTGCCTCAGACCC-3'，下游5'-CCGGATCCTTACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3'),并在基因的5'端引入甘氨酸/丝氨酸连接序列和5^711限制性内切酶酶切位点，3'端引入5adH限制性内切酶酶切位点，交由北京三博远志生物公司合成。提取猪肝脏基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系含模板1ug，上下游引物各50pmol/L，总体积50uL。反应条件为94。C、8min;94°C、lmin，54°C、lmin、72°C、lmin，30个循环；最后于72'C、10min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图l所示。其中，M为DNA分子量标准；1为PCR产物电泳结果；2为阴性对照结果。结果表明，在520bp处有条带，回收该条带与并pMD18-T载体(TaKaRa公司)连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选白斑，对PCR检测结果为阳性的克隆测序。测序结果表明，PCR扩增的猪a干扰素基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。三、PoIFN-a基因的拼接将上述获得的胸腺肽al基因和猪a干扰素基因PCR扩增后的片段分别用Ss/dil和《^/II酶切，T4DNA连接酶连接后克隆入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选白斑，对PCR检测结果为阳性的克隆测序。测序结果完全正确的克隆即为重组蛋白基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码氨基酸序列如序列表中序列1所示的PoIFN-a。将含有核苷酸序列如序列表中序列2所示的PoIFN-a基因的重组载体命名为pMD18-PoIFN-a。四、重组蛋白基因的表达及其表达产物的纯化1、含重组蛋白基因的大肠杆菌重组表达载体PoIFN-a/pBV220的构建将测序结果完全正确的含有重组蛋白基因的质粒pMD18-PoIFN-a用限制性内切酶^aMH和fcoRI双酶切后插入到pBV220原核表达载体(含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990，6(2):111116)的万a/dll和fcoRI酶切位点之间，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得阳性重组菌，将经PCR检测和酶切鉴定含有尸oi7W-"的重组载体命名为PoIFN-a/pBV220，将该重组载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞获得的含有PoIFN-a/pBV220的重组菌命名为DH5a-PoIFN-a/pBV220。将上述重组菌接种于LB培养基中，在3(TC条件下，200转/分(旋转半径为13mm)摇床上振荡培养至0D6。。值为1，一部分收集菌体，另一部分继续在42。C下诱导6小时。培养结束后，5000g离心10分钟收集菌体，将诱导后收集的菌体和未经诱导收集的菌体进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图3所示，其中，M为蛋白质分子量标准，1为未经诱导的菌体SDS-PAGE电泳结果，2为诱导后菌体的SDS-PAGE电泳结果。检测结果表明，在23kD左右处出现一条蛋白条带(箭头示)，与重组蛋白预期分子量相符。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行鉴定，结果如图4所示，表明重组蛋白肽图的主峰与猪干扰素a吻合，证明重组蛋白基因(尸o77^-")在大肠杆菌中正确表达。经薄层凝胶扫描仪确定表达产物在全菌蛋白中所占比例为65%。2、重组蛋白的发酵生产1)重组菌DH5a-PoIFN-a/pBV220种子库的制备将重组表达菌DH5a-PoIFN-a/pBV220按1%的体积比接种于20ml含100微克/毫升Amp(氨苄青霉素)的LB液体培养基中，30°C、200r卿振荡培养8-10h。升温至42TH秀导培养4h，划平板，挑取5-10个单菌落制备种子库挑取5-10个单菌落于LB液体培养基中培养至0D,值为0.5左右，按750ul菌液加250ul50%甘油的比例混合，-2(TC保存备用。2)重组菌DH5a-PoIFN-a/pBV220发酵种子液制备将-20。C保存的重组菌DH5a-PoIFN-a/pBV220按0.05%体积的量接种于200ml2承YT培养液(蛋白胨16克/升、酵母粉10、氯化钠5克/升)中，30°C、220rpm培养10-12h，制得发酵种子液。3)重组菌DH5a-PoIFN-a/PBV220发酵生产a、菌体培养阶段发酵培养基(克/升)蛋白胨5、酵母粉5、KH2P042、K2HP044、Na2HP0412H207、(NH4)2S041.2、NH4C10.2、MnS045H200.001、CoCl26H200.004、Na2Mo042H200.002、ZnCl20.002、CuS045H200.001、H3B040.005、FeS047H200.02、CaCl2H200.02、MgS04，7H200.3、消泡剂0.2。该发酵培养基用水配制。高温灭菌后，每升培养基中加入lmL100mg/ml的Amp，按5-10%体积量接入种子液，35。C通气搅拌培养4小时，4小时后降温至3(TC继续培养。培养过程中随着菌体的生长，培养基中的碳源逐渐消耗，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧回升(上升30%)，此时开始流加补料培养基。该补料培养基的组成为甘油150ml/L、蛋白胨30g/L、酵母粉30g/L、MgS047H205.5mg/L，余量为水。流加速度由溶氧(DO)控制(设定D0=30%，当D0大于30y。，打开流加泵流加培养基，DO逐步下降，当00下降到30%以下流加泵关闭)，大约每小时流加26-35ml培养基，培养过程中用3MNaOH和10%磷酸维持pH值7.2。溶氧维持在30%以上，3(TC培养2-3小时，准备诱导。b、诱导表达阶段继续流加补料培养基，升温至42"C诱导表达目的蛋白，诱导7小时后停止培养。3、重组蛋白的纯化取5L上述发酵液，5000g离心10分钟收集菌体，经PBS缓冲液(NaCl137mmol/L，KC12.7mmol/L,Na2HP044.3mmol/L，KH2P041.4mmol/L，pH8.0)洗涤后重悬，超声(OIO探头，超声7秒，间隔5秒)30分钟使菌体破壁，4。C条件下，10000g离心10分钟收集沉淀，PBS缓冲液洗涤沉淀，然后用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，2mmol/LEDTA，50mmol/LTrisHC1，10mmol/LDTT，pH8.5)溶解沉淀，4。C条件下，10000g离心10分钟收集上清，即得到变性蛋白溶液，将变性蛋白溶液缓慢加入到复性缓冲液(0.5mol/LL-Arg;2mmol/LEDTA，20%甘油;0.9raraol/LGSSG，0.lraol/LTrisHC1，pH8.0)中，4。C静置48小时，4。C条件下，10000g离心20分钟收集上清，即为含有重组蛋白的溶液。采用Bradford法测定重组蛋白溶液的蛋白浓度，计算复性回收率。计算公式为复性蛋白溶液浓度*体积/变性蛋白质量，结果显示重组猪a干扰素的复性回收率可达70%。将上述获得的含有重组蛋白的溶液用Na0H调节pH值至7.4，过阴离子交换层析柱(HiTrapQFF，AmershamBiosciences)，将样品以0.3ml/分钟的速度加入层析柱中，用pH7.4的PBS缓冲液和1M的NaCl以lml/分钟的速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在280nm波长下进行检测，收集目标洗脱峰。用0.22um的滤膜过滤除菌。对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示，其中，泳道M为低分子量蛋白标准，泳道l为纯化的蛋白样品。结果表明，纯化的蛋白样品在23kD附近出现一条蛋白条带，与预期结果相符。实施例2、重组蛋白的抗病毒生物学活性测定生物学活性测定参照2005年《中华人民共和国药典》三部附录XC细胞活性抑制法，用PK15细胞(ATCCNumber:CCL-33)—水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)(ATCCNumber:VR-1238AF)系统，采用CPE(细胞致病变效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检品仍能保护半数细胞(50%)免受病毒攻击的最高稀释度的倒数为1个干扰素活性单位。具体方法为取PK15细胞在96孔板中培养至全部贴壁后，去除培养液，分为两组一组以干扰素a(购自四川世红生物技术有限公司产品，农生药字(2003)437730)作为标准品，按说明书将干扰素ct稀释至1000U/ral，每孔加入0.1ml4倍(4。、41、42、43、44……411)倍比稀释液；另一组每孔加入O.lml4倍(4。、41、42、43、44……411)倍比稀释的实施例1获得并纯化的重组蛋白(供试品)溶液。用100TCIDs。剂量的水疱性口炎病毒(VSV)进行攻毒，同时设立阴性对照(只加经4倍倍比稀释的标准品或重组蛋白，不加病毒)、阳性对照(不加标准品和重组蛋白，只加病毒)和空白对照(不加标准品和重组蛋白，不加病毒)，在倒置显微镜下观察1U/ml的标准品出现50%病变的时候判断结果。染色后在570nm波长处测定吸光度，采用四参数回归计算法进行处理，并按下式计算干扰素生物学活性。实验设3次重复。供试品生物学活性寸rX[(DsXEs)+(DrXEr)]式中Pr为干扰素a标准品生物学活性；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为干扰素ci标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于干扰素a标准品半效量的稀释倍数；Er为干扰素a标准品半效稀释倍数。结果表明，得到的重组蛋白活性为1.6X107U/mg±0.5X107U/mg(平均值土标准差)。实施例3、重组蛋白的胸腺肽生物学活性测定采用玫瑰花结法测定胸腺肽生物学活性，胸腺肽可激活新鲜猪胸腺中的脱E受体胸腺细胞，使它与绵羊细胞形成玫瑰花结。1)采集新鲜猪胸腺，制备淋巴细胞悬液；2)45'C温浴lh(每隔5分钟振摇一次)，洗涤细胞并调整浓度至3-5Xl(f个/ml，放置于测试管中，每管0.2ml;3)在上述测试管中加入O.lml浓度为1X10—3、1X10—4、1X10—5、IX10,1X1(Tmg/ml的重组蛋白，空白对照加入O.lml的无菌水，37°(3温浴lh;4)将绵羊红细胞洗涤后调整细胞浓度至3-5X107个/ml，每一测试管加0.2ml，摇匀，600g离心2分钟，4i:放置过夜；5)次日弃去上清液，每管加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴，摇匀，静置15分钟后计数；6)计算显微镜视野里16个方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成数(结合3个以上绵羊红细胞的胸腺细胞)，求得形成百分率，取其平均数，即为样品和对照品读数。按下面公式计算胸腺肽生物学活性。胸腺肽生物学活性=待测样品E玫瑰花结百分率一空白对照E玫瑰花结百分率测定结果如表2所示。表2重组蛋白胸腺肽生物学活性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4、重组蛋白的安全性实验取体况健康的21日龄大约克仔猪和5月龄大约克育肥猪(批号分别为20060602，20060125，购自山东省农业科学院良种猪场)各20头(雌雄各半)，分别随机分为2组，每组10头，共4组(仔猪I组、仔猪II组、育肥猪I组、育肥猪II组)。按照如下方法进行单剂量一次接种、单剂量重复接种及超剂量一次接种的安全试验。单剂量一次接种组仔猪I组和育肥猪I组按照颈部肌肉注射途径接种1个剂量(10511/头)实施例l获得并纯化的重组蛋白，连续观察2周。单剂量重复接种组将经单剂量一次接种的仔猪I组和育肥猪I组，于接种2周后以相同方法再接种一次，继续观察2周。超剂量一次接种组仔猪II组和育肥猪II组按照颈部肌肉注射途径接种50个剂量(2X107U/头)实施例l获得并纯化的重组蛋白，连续观察2周。实验期间，每天观察试验动物临床症状变化，包括精神、活动、呼吸、采食、饮水、注射部位有无炎症反应、排泄情况，每天测量体温，记录动物异样反应。如有死亡，对死亡猪进行剖检，观察病理变化，分析原因。经过2周和4周连续观察，对注射重组蛋白前后猪的临床症状进行比较，发现单剂量一次接种组、单剂量重复接种组和超剂量(50个剂量)一次接种组均饮食正常，精神状态无不良变化，呼吸及排泄未见异常，注射部位无肿胀和发炎现象，实验期间没有发现动物有任何不良反应。整个实验期间，未见有猪死亡。注射后每天测量动物体温发现，大部分猪接种后体温正常，维持在39.1-39.7t:之间的范围，偶尔会在接种的第二天出现体温升高现象，但持续时间不超过2天。结果表明，实施例l制备的重组蛋白对猪的安全性很高，以超剂量(50倍正常剂量)注射，无显著毒副作用，是一种安全的新型抗病毒制剂。实施例5、重组蛋白的临床试用1、猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)的治疗取经临床鉴定为患有猪繁殖与呼吸综合征的21日龄大约克仔猪、70日龄杜洛克保育猪、5月龄大约克育成猪各10头(批号分别为20060302，20060120，20051001，购自山东省农业科学院良种猪场)，分为治疗组和对照组，每组每种猪5只，每组共15只。治疗组每天按5X104U/头的剂量注射实施例1获得的重组蛋白，对照组只注射相同体积的生理盐水(安慰剂)，连续注射三天，每天观察并对临床症状进行评分，具体评分规则如表3所示，结果如表4所示。结果表明，治疗组和对照组临床症状统计学评分存在明显差异，实施例l制备的重组蛋白可以有效地治疗猪繁殖与呼吸综合征，治疗过的发病猪病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热、呕吐、腹泻症状消失；而注射安慰剂的对照组症状无改善。表4中的分数为三天的平均值。表3.临床症状评分规则<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>按照上表对治疗组和组猪进行打分，分数越高，表明体况越差，满分20分时，代表猪死亡。表4.治疗猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)的临床症状评分统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2、猪流行性腹泻的治疗取经临床鉴定为患有猪流行性腹泻的21日龄大约克仔猪、70日龄杜洛克保育猪、5月龄大约克育成猪各10头(批号分别为20060302，20060120，20051001，购自山东省农业科学院良种猪场)，分为治疗组和对照组，每组每种猪5只，每组共15只。治疗组每天按5乂1041]/头的剂量注射实施例1获得的重组蛋白，对照组只注射等体积的生理盐水(安慰剂)，连续注射三天，每天观察并对临床症状进行评分，具体评分规则如表3所示，结果如表5所示。结果表明，治疗组和对照组临床症状统计学评分存在明显差异，实施例l制备的重组蛋白可以有效地治疗猪流行性腹泻病毒感染，治疗过的发病猪病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热、呕吐、腹泻症状消失；而注射安慰剂的对照组症状无改善。表5中的分数为三天的平均值。表5.治疗猪流行性腹泻的临床症状评分统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表〈160〉4〈210>1〈211〉204〈212〉PRT<213〉人工序列<400>1SerLysSerHisPhe65LeuGluAlaGinGlu145TyrCysSerAspGluGlyThr50SerGlyMetAlaGin130GlyPheAlaArgAlaLysGly35ArgCysGlyLeuTrp115LeuThrHisTrpAsn195AlaVal5LysGlu20GlyGlyAlaLeuLeuAspAsnGin85GinGin100AspGluArgAspProLeuArgLeu165Glulie180LeuGinAspValSerArgHis70ValThrSerLeuLeu150ThrValAspThrSerValGluCysAsp40LeuLeu55ArgArgGinLysPheGinLeuLeu120GluAla135GluGluLeuTyrArgAlaArgLeu200SerGlu25!LeuAlaAspAlaLeu105HisCysAspLeuGlu185ArgGlu10AlaProGinPheGin90PheGinValSerGin170ValLyslieGluGinMetGly75AlaSerPheMetlie155GluMetLysThrAsnThrArg60PheMetThrCysGin140LeuLysArgGluThrGlyHis45ArgProAlaGluThr125GluAlaSerSerLysGly30SerlieGinLeuGly110GlyAlaValTyrPhe190AspLeu15GlyGlyLeuAlaSerProGluAla80ValHis95SerAlaLeuAspGlyLeuArgLys160SerPro175SerSer<210>2<211>615<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉2agtgacgcggctgtggatactagctctgagattaccaccaaagatctgaaagagaaaaaa60gaagttgtcgaagaagctgaaaacggcgggggtggatctggtggcgggggaagctgtgac120ctgcctcagacccacagcctggctcacaccagggccctgaggctcctggcacaaatgagg180agaatctcccccttctcctgcctggaccacagaagggactttgggttcccccaagaggcc240ttggggggcaaccaggtccagaaggctcaagccatggctctggtgcatgagatgctccag300cagacctixcagctcttcagcacagagggctcggctgctgcctgggatgagagcctcctg360caccagttxtgcactggactggatcagcagctcagggacctggaagcctgtgtcatgcag420gaggcggggctggaagggacccccctgctggaggaggactccatcctggctgtg鄉aaa480tacttccacEigactcaccctctatctgcaagagaagagctacagcccctgtgcctgggag540atcgtcagggcagaagtcatgagatccttctcttcctcca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