一种能专门识别重组猪干扰素ɑ的单克隆抗体及ELISA试剂盒制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种能专门识别重组猪干扰素ɑ的单克隆抗体及ELISA试剂盒制备方法，利用本发明技术生产的重组猪干扰素ɑ单克隆抗体可特异地检测重组猪干扰素ɑ产品。所述该剂盒由抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞株所分泌单克隆抗体制备的ELISA检测试剂盒，其检测重组猪干扰素ɑ产品具有灵敏度高、特异性强、操作简便和诊断快速等优点。
【专利说明】—种能专门识别重组猪干扰素α的单克隆抗体及ELISA试剂盒制备方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及一种针对重组猪干扰素α蛋白的单克隆抗体和用于检测重组猪干扰素α产品的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪干扰素为一种广谱的抗病毒制剂，主要是通过与细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，进而抑制猪瘟、口蹄疫等病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。猪干扰素在畜牧业生产上的应用已受到高度关注。最早在国内应用于兽医临床的是猪白细胞干扰素，由于这种干扰素存在工艺成本高等问题。而基因工程技术的发展为猪干扰素大量生产提供了新的平台。我室采用基因工程技术获得了一种重组猪干扰素α (重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804)，临床试用结果表明其可有效治疗猪病毒性腹泻等疾病。但目前市场上尚无重组猪干扰素α产品的检测试剂盒，阻碍了其广泛应用，因此有必要研制重组猪干扰素α相应检测试剂盒，确立检测方法，供实验室和市场上对重组猪干扰素α产品的鉴定和验证用。
【发明内容】
[0003]本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种重组猪干扰素α蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒制备方法。
[0004]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0005]一种能专门识别重组猪干扰素α的单克隆抗体，包括以下步骤:
[0006](I)将纯化的重组猪干扰素α蛋白免疫Balb/c小鼠，分4次免疫，以间接ELISA检测小鼠血清中重组猪干扰素α抗体的效价，效价高者选为下一步细胞融合的对象；
[0007](2)取经最后强化免疫的Balb/c小鼠，收集血清，消毒。无菌取出小鼠脾脏、分离脾细胞，与新鲜制备、生长良好的小鼠骨髓瘤细胞融合，HAT培养基稀释融合细胞悬液，加入已预先铺有饲养细胞的96孔板中，100 μ I/孔，于培养箱中培养，筛选单克隆抗体杂交瘤细胞，共筛选得2株杂交瘤细胞，编号为BI和D6 ；
[0008](3)取D6、BI杂交瘤细胞培养上清，采用SIGMA公司单克隆抗体亚型检测试剂盒检测，编号为D6和BI抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株株所分泌抗体的亚型分别为IgGl和IgG2a ；
[0009](4)腹腔内注射液体石蜡，6~8d后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞悬液；7~IOd后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸-饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析纯化单抗，-80°C保存。
[0010]一种ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求书I的单克隆抗体制备得到抗重组猪干扰素α单克隆抗体包被酶标反应板和酶标记物、标本稀释液、洗涤液、底物液、阴性质控品、阳性质控品和终止液；
[0011]所述的标本稀释液为:含10%小牛血清和2%抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；
[0012]所述的洗涤液为:含有0.05% Tween20的0.01mol/L ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液(PBST)；
[0013]所述的底物液为=TMB-H2O2尿素溶液；
[0014]所述的终止液为:2mol/L H2SO4溶液；
[0015]所述的阴性质控品为:0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；
[0016]所述的阳性质控品为:lmg/ml重组猪干扰素α蛋白；
[0017]所述的酶标记物的制备包括以下步骤:
[0018]取编号为BI抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶的酶标记物，以饱和硫酸铵沉淀法进行纯化。纯化检测后，加入终浓度为50%的甘油、0.1%的硫柳汞置_20°C保存；
[0019]所述的抗重组猪干扰素α单克隆抗体包被酶标反应板的制备包括以下步骤:
[0020]取96孔酶标板一块，包被编号为D6的抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体IOOng/孔，4°C过夜，取包被板加200 μ I PBS稀释的10%小牛血清37°C封闭1.5小时，得到抗重组猪干扰素α单克隆抗体包被酶标反应板；
[0021]所述的ELISA检测试剂盒，所述的检测重组猪干扰素α含量的临界值为50ng/ml。
[0022]本发明的优点:
[0023]建立了一种快速、准确，利用高通量检测重组猪干扰素。产品的检测方法，为兽药管理部门提供一套实用有效的试剂盒产品。
[0024]说明书附图:
[0025]图1为抗重组猪干扰素α单克隆抗体杂交瘤细胞染色体计数(X 1000)；
[0026]图2为Western-blot检测抗重组猪干扰素α单克隆抗体特异性；其中
[0027]M:蛋白markerl:BL21工程菌对照2:重组猪干扰素α蛋白样品。
【具体实施方式】
[0028]实施例1
[0029]1、试剂的制备
[0030](I)包被液(0.05mol/L, ρΗ9.6的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液)=Na2CO3L 5g,NaHC032.9g, Na2N30.2g，加双蒸水至 1000ml，调至 ρΗ9.6。
[0031](2)标本稀释液(即 PBS 缓冲液):NaC18.0g、KH2PO40.2g、Na2HP04.12Η202.9g、KC10.2g，硫柳汞0.lg，加双蒸水至1000ml，调至ρΗ7.4，即得。
[0032](3)封闭液:(10% 小牛血清 /PBS 溶液)小牛血清 100ml，IXPBS (ρΗ7.4) 900ml。
[0033](4)洗涤液(PBST，ρΗ7.4):NaC18.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4.12H202.9g、KC10.2g、Tween200.5ml、硫柳萊 0.lg、加双蒸水至 1000ml,调至 ρΗ7.4。
[0034](5 )底物液(TMB-H2O2尿素溶液):
[0035]①底物液A (3、3 ‘、5、5 ‘一四甲基联苯胺，TMB):TMB200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml。[0036]②底物液B缓冲液(0.lmol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0~
5.4):Na2HP0414.60g,梓檬酸9.33g, 0.75%过氧化氢尿素6.4ml,加双蒸水至1000ml,调至pH5.0 ~5.4。
[0037]③将底物液A和B按1:1混合，即成TMB-H2O2尿素溶液。
[0038](6)终止液:(2mol/L H2SO4溶液):双蒸水600ml，浓硫酸100ml (缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
[0039]2、抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞系的建立
[0040]将纯化的重组猪干扰素α蛋白免疫Balb/c小鼠,分4次免疫后以间接ELISA检测小鼠血清中重组猪干扰素α抗体的效价，效价高者选为下一步细胞融合的对象。
[0041]取经最后强化免疫的Balb/c小鼠，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，消毒。无菌取出小鼠脾脏、分离脾细胞，与新鲜制备、生长良好的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞株)融合，HAT培养基稀释融合细胞悬液，加入已预先铺有饲养细胞(免疫小鼠的腹腔巨噬细胞)的96孔板中，100 μ I/孔，于培养箱中培养。次日后连续观察细胞生长状态，防止发生污染，并进行后续管理，筛选单克隆抗体杂交瘤细胞，共筛选得2株杂交瘤细胞，编号为BI和D6。
[0042]杂交瘤细胞系染色体检查:在细胞培养基中加入秋水仙素使大部分细胞停留在有丝分裂中期，37°C继续培养2h，常规染色体标本制备方法固定、染色，镜下检查并进行染色体计数。杂交瘤细胞的染色体计数达106条，高于两亲本的染色体数目，表明杂交瘤细胞确实为SP2/0与小鼠脾细胞的融合细胞。
[0043]以Western-blot测 定杂交瘤细胞培养上清液的抗体特异性，2株抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞培养上清液均有特异性识别重组猪干扰素α蛋白能力。
[0044]3、抗重组猪干扰素α单克隆抗体亚型鉴定
[0045]取D6、BI杂交瘤细胞培养上清，采用SIGMA公司单克隆抗体亚型检测试剂盒检测(Lot072K4849)，编号为D6和BI抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株株所分泌抗体的亚型分别为 IgGl 和 IgG2a。
[0046]4、抗重组猪干扰素α单克隆抗体的制备
[0047]腹腔内注射0.5ml液体石蜡，第7d后每只小鼠腹腔注射I X 107/ml杂交瘤细胞悬液0.5ml ;7~IOd后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸-饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析纯化单抗，其纯度可达90%以上，_80°C保存。间接ELISA检测其效价1:106。
[0048]5、酶标记物的制备
[0049]编号为BI的抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶的酶标记物，以饱和硫酸铵沉淀法进行纯化。纯化检测后，加入终浓度为50%的甘油、0.1%的硫柳汞置_20°C保存。
[0050]6、重组猪干扰素aELISA检测试剂盒的组装
[0051]取96孔酶标板一块，包被编号为D6的抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体IOOng/孔，4°C过夜，取包被板加200 μ I PBS稀释的10%小牛血清37°C封闭1.5小时，得到抗重组猪干扰素α单克隆抗体包被酶标反应板；
[0052]重组猪干扰素aELISA检测试剂盒由上述抗重组猪干扰素a单克隆抗体包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、酶标记物、底物液、阴性质控品、阳性质控品和终止液构成。
[0053]具体分为:
[0054](I)标本稀释液:含10%小牛血清和2%抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；
[0055](2)洗涤液:含有 0.05% Tween20 的 0.01mol/L ρΗ7.4 的磷酸盐缓冲液(PBST)；
[0056](3 )底物液=TMB-H2O2尿素溶液；
[0057](4)终止液:2mol/L H2SO4 溶液；
[0058](5)阴性质控品:0.01M ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；
[0059](6 )阳性质控品:lmg/ml重组猪干扰素。蛋白
[0060]7、利用上述试剂盒采用ELISA法检测重组猪干扰素α产品
[0061](I)将阳性质控品用样品稀释液按 1:10、1:50、1:200、1:1000、1:5000、1:20000)倍比稀释 6 个浓度(浓度分别为 0.lmg/ml>20 μ g/ml>5 μ g/ml>I μ g/ml、0.2 μ g/ml、50ng/ml)，加入稀释后的阳性质控品、阴性质控品和待检样品100μ I/孔。37°C孵育lh，洗涤液洗板3次，350 μ I/孔，甩干；
[0062](2)加酶标记物100 μ I/孔，37°C孵育40min，洗涤液洗板3次，350 μ I/孔，甩干；
[0063](3)显色:用洗涤液洗板后每孔加入底物液100μ 1，37°C或室温避光显色15分钟；
[0064](4)每孔加入终止液50 μ I,终止反应；
[0065](5)测定:450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。测定应在加终止液后15min以内进行。
[0066](6)计算结果:
[0067]定性检测结果分析:将待检标本血清平均OD值(P)除以阴性质控品平均OD值(N)，求得P/N值，P/N≥2.1为阳性，Ρ/Ν〈2.I为阴性。
[0068]定量检测结果分析:在Excel工作表中，以根据阳性质控品稀释的6个不同浓度血清标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。本试剂盒的检测灵敏度为50ng/ml。
[0069]8、重组猪干扰素aELISA检测试剂盒特异性检测
[0070]取100份已知含重组猪干扰素a蛋白产品检测，结果98份为阳性，阳性率为98%，取40份不含重组猪干扰素a蛋白产品标本检测结果，40例全为阴性。总一致率为98.57%。[0071 ] 表1重组猪干扰素aELISA检测试剂盒性能分析
【权利要求】
1.一种能专门识别重组猪干扰素α的单克隆抗体，其特征在于包括以下步骤: (1)将纯化的重组猪干扰素α蛋白免疫Balb/c小鼠,分4次免疫，以间接ELISA检测小鼠血清中重组猪干扰素α抗体的效价，效价高者选为下一步细胞融合的对象； (2)取经最后强化免疫的Balb/c小鼠，收集血清，消毒；无菌取出小鼠脾脏、分离脾细胞，与新鲜制备、生长良好的小鼠骨髓瘤细胞融合，HAT培养基稀释融合细胞悬液，加入已预先铺有饲养细胞的96孔板中，100 μ I/孔，于培养箱中培养，筛选单克隆抗体杂交瘤细胞，共筛选得2株杂交瘤细胞，编号为BI和D6 ； (3)腹腔内注射液体石蜡，6-8d后每只小鼠腹腔注射B1、D6杂交瘤细胞悬液；7~10d后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸-饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析纯化单抗，_80°C保存。
2.—种ELISA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求书I的单克隆抗体制备得到抗重组猪干扰素α单克隆抗体包被酶标反应板和酶标记物、标本稀释液、洗涤液、底物液、阴性质控品、阳性质控品和终止液； 所述的标本稀释液为:含10%小牛血清和2%抗人IgG的0.01M ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)； 所述的洗涤液为:含有0.05% Tween 20的0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBST); 所述的底物液为=TMB -H2O2尿素溶液； 所述的终止液为:2 mol/L H2SO4溶液； 所述的阴性质控品为:0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)； 所述的阳性质控品为:lmg/ml重组猪干扰素α蛋白； 所述的酶标记物的制备包括以下步骤: 取编号为BI抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶的酶标记物，以饱和硫酸铵沉淀法进行纯化，纯化检测后，加入终浓度为50%的甘油、0.1%的硫柳汞置_20°C保存； 所述的抗重组猪干扰素α单克隆抗体包被酶标反应板的制备包括以下步骤: 取96孔酶标板一块，包被编号为D6的抗重组猪干扰素α杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体100 ng/孔，4°C过夜，取包被板加200μ I PBS稀释的10%小牛血清37°C封闭1.5小时，得到抗重组猪干扰素α单克隆抗体包被酶标反应板。
3.根据权利要求2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于所述的检测重组猪干扰素α含量的临界值为50ng/ml。
【文档编号】G01N33/577GK103588879SQ201310526078
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】赵俊, 王明丽, 刘君 申请人:赵俊, 王明丽