一种重组水貂α-干扰素的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，特别涉及一种重组水貂α -干扰素的制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 干扰素是动物中目前所知出现最早、作用最快的第一抵御病毒体系。已对人和鼠 的干扰素进行了深入研宄，但对于水貂的干扰素研宄相对较少。
[0003] 水貂α -干扰素是由13个相关功能基因编码的蛋白质家族，亚型基因间编码框大 小一致，氨基酸同源性88. 8-98.4%。成熟的水貂α-干扰素由167个氨基酸组成，诱导其 分泌表达的信号肽由23个氨基酸组成。由于水貂的病毒性疾病种类多、危害大，因此发展 具广谱抗病毒效应的水貂干扰素具有重要意义。但干扰素的传统提取方法产量低、操作繁 琐，很难推广应用，因而寻找一种高效生产干扰素的方法成为亟待解决的问题。
[0004] 毕赤酵母表达系统是应用广泛的一种真核表达系统，可胞外表达外源蛋白。相比 于大肠杆菌等原核表达系统，它具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能，而与杆状病毒、哺 乳动物细胞相比，它又具有培养成本低、产量高、便于产物的分离纯化等优点。近年来，酵母 表达系统的研宄得到迅速发展，此系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌毕赤 酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，利于下游分离纯化操作，能大规模发 酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服传统获得干扰素方法的不足，提供一种重组水貂α -干扰素的制 备方法和应用，所述的制备方法通过高效外源表达重组水貂α-干扰素的真核表达系统实 现。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种重组水貂α -干扰素的制备方法，包 括：将水貂α 2-干扰素基因克隆至载体pGAPZa A中，实现毕赤酵母重组表达载体的构建及 筛选，并在毕赤酵母中进行诱导表达，获得重组水貂α -干扰素。
[0007] 所述的水貂α -干扰素基因序列如Seq ID NO :1所示。
[0008] 所述的水貂α -干扰素基因进行克隆时所用的引物为：
[0009] 扩增水貂α -干扰素基因特异性上游引物：
[0010] 5' -GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGA-3' ；
[0011] 扩增水貂α -干扰素基因特异性下游引物：
[0012] 5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGATTACTTCCTGCTCCGCA-3 '。
[0013] 所述的诱导表达的具体方法为：用含Zeocin 100mg/L的YTO液体培养基进行菌体 的扩增培养，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 1. 5 ;按1:100比例转接到含Zeocin IOOmg/ L的YPD液体培养基中，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 6-8, 7000rpm，4°C，离心15min，获 得含有重组水貂α-干扰素的上清液。
[0014] 本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
[0015] 所述的毕赤酵母重组表达载体的构建及筛选，包括以下步骤：
[0016] 首先将载体PGAPZa用Xh0 I和Xba I双酶切后检测回收，设计扩增水貂α-干 扰素基因特异性引物，引物上下游分别有15个碱基与上述酶切后线性载体的两端互补，回 收PCR基因片段，直接用In-Fusion HD Cloning Kit将片段和载体连接，转化DH5a感受态 细胞，经质粒PCR和双酶切鉴定阳性克隆，经验证得到插入正确的重组毕赤酵母载体，即将 基因插入PGAP启动子和a -alpha信号肽下游的Xho I /Xba I位点，构建成分泌型酵母 表达重组质粒，以Bin I酶切载体呈线性化后电击转化酵母X-33,转化子经Zeocin IOOmg/ L抗性筛选，菌落PCR鉴定分析，确定阳性菌株后作进一步的摇瓶发酵。
[0017] 上述方法制备获得的重组水貂α -干扰素在制备治疗犬瘟热疾病的药物中应用。
[0018] 上述方法制备获得的重组水貂α -干扰素在制备治疗水貂细小病毒感染疾病的 药物中应用。
[0019] 上述应用的一种优选配方为50~100万IU重组水貂α -干扰素：1ml止血敏： 0. 8ml安乃近注射液。
[0020] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0021] 本发明采用常规的PCR方法获得水貂α-干扰素基因编码区，克隆入毕赤酵母分 泌型表达载体中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分 泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白，蛋白浓度最高可达3. 593mg/mL。另外，本发明 通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组重组蛋白的抗病毒活性。
【附图说明】
[0022] 图1是毕赤酵母-X33培养上清多克隆抗体检测MiIFN-α蛋白表达结果图，其中 Α:克隆菌株1培养上清；Β:克隆菌株2培养上清；C:克隆菌株3培养上清；D:克隆菌株4 培养上清；Ε:克隆菌株5培养上清；F:克隆菌株6培养上清；G:克隆菌株7培养上清；Η: 阴性对照；MK:分子量标准。
[0023] 图2是表达产物纯化结果图，其中Α:诱导IFN-α蛋白表达产物（6 μ g) ;Β:未诱 导IFN- α蛋白表达产物（6 μ g)，MK:分子量标准。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0025] 实施例1毕赤酵母重组表达载体的构建
[0026] 1)水貂α -干扰素13个亚型基因序列扩增及多态性分析
[0027] 外周血淋巴细胞诱导及总RNA的提取：
[0028] 无菌采取健康水紹外周5mL，置于加有抗凝剂（38g/L梓檬酸钠）的灭菌容器中， 然后在无菌条件下加入RPMI1640培养液1 :1稀释。取5mL人用淋巴细胞分离液上，室温下 2000r/min水平转子离心40min。用折弯的灭菌长针头小心将白细胞层移于另一试管中（约 ImL)中，加2倍体积的RPMI1640培养液混匀后，2000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物再 加入等量RPMI1640,相同方法洗涤2次，弃去上清液，沉淀细胞用含lOOOOU/mL双抗、IOOmL/ L小牛血清的RPMI1640培养液悬浮。取10 μ L细胞悬液计数，按计数结果稀释至I X IO7/ mL，置于24孔细胞培养板中，37°C 50mL/LC02培养箱中静置培养2h后，加入TCID 5Q为10 _6 5 新城疫弱毒株Lasota 100 μ 1诱导物培养24h〇
[0029] 收集诱导24h后的淋巴细胞于15mL离心管中，2000r/min离心10min，弃上清液， 将沉淀用ImL TRIzol Reagent重悬，冻存于-70°C备用。
[0030] 取出装有淋巴细胞的冻存管，室温融化，加 l/5Trizol体积的氯仿，充分混匀后静 置3min，12000r/min离心15min，将沉淀用750mL/L的乙醇缓慢洗涤2遍，倒置控干后用 lmL/L DEPC处理的灭菌水9. 5 μ L溶解沉淀，即获得淋巴细胞总RNA。
[0031] 2) 13个亚型基因通用引物的设计与合成
[0032] 应用Primer 5. O基因分析软件，参照GenBank登陆的犬、狐、猫、猪、羊、牛、人及 禽类的α-干扰素基因序列，分析其核苷酸同源性，设计扩增水貂α-干扰素基因引物，弓丨 物序列如下：
[0033] 扩增水貂α -干扰素基因上游引物：5' -ATGGCCCTGCCCTGCTCCT-3' ；
[0034] 扩增水貂α -干扰素基因下游引物：5' -TCACTTCCTGCTCCGCAATCT-3'。
[0035] 采用RT-PCR方法扩增目的基因。操作步骤：在9. 5 μ L的RNA溶液中加入1 μ L 01igo(dT)15引物（50pmol/yL)，混匀后于70°C水浴作用5min，立即冷却，依次加入 lOmmol/L dNTP 5 μ L，AMV 缓冲液 4 μ L，RNA 酶抑制剂 0. 5 μ L，AMV 1 μ L 充分混匀，42°C反 应lh，95°C 3min灭活反转录酶，冷却后直接用于PCR反应。PCR反应体系：10XEx Taq缓冲 液2.5 4 1^，2.5臟〇1/1/^1^(1阶132 4 1^，25口111〇1/^1^上、下游引物各14 1^，25口111〇1/1丁&9〇嫩 聚合酶0. 125 μ L，加入灭菌去离子水至25 μ L。将25 μ L反应液混匀后，于PCR仪上进行扩 增，循环参数为：95°C预变性 5min ;94°C 45s，52. 5°C lmin，72°C lmin，32 个循环后，72°C延 伸6