原核表达重组质粒pET-IFNγ、干扰素及用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种干扰素，尤其是由重组质粒pET-IFNy制得的干扰素，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]随着水产养殖业的发展、高密度养殖技术的普及和养殖产量的迅速增加，水产养殖动物疾病的发生越来越频繁、越来越严重，由此造成的损失逐年增加。每年有1/10的养殖面积受到病害的影响，造成了巨大的经济损失。尤其是鱼类的病毒性疾病，至今都是无法有效控制的世界性难题。病毒性疾病的病原体微小，在宿主细胞内复制，潜伏期长短不一、症状复杂多变、传染性强、死亡率高。迄今已发现的鱼类病毒有70多种，流行比较严重的如草鱼出血病、鲤春病毒血症、传染性造血组织坏死病等。
[0003]草鱼作为我国最主要的经济鱼类，其产量约占我国淡水鱼类养殖产量的20%。在其养殖的过程中受到各种病害的威胁，其中以由草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病最为严重，死亡率高达90%，造成了我国淡水渔业巨大损失。目前，对于鱼类传染性疾病的防治仍然没有很有效的方案。一方面，鱼类病毒病尚无有效的防治药物，使用的化学药剂和抗生素往往会导致药物残留和耐药性的产生，甚至污染水环境。预防水产动物疾病发生流行的有效途径是免疫接种。然而，在病毒疫苗使用过程中，存在很多无法克服的障碍。鱼用疫苗可分为三种类型：第一种为减毒及灭活疫苗；第二种为重组亚单位疫苗和合成多肽疫苗；第三种是核酸疫苗。第一、二种疫苗虽然在生产实践中得到了较大程度的应用，然而在生产成本、效价稳定性、保护力等方面还存在一定的问题。疫苗免疫不适于大面积水面养殖；弱毒疫苗还有毒力返强的潜在危险。近年来，核酸疫苗虽开辟了疫苗学的一个新领域，但是由于免疫效果不稳定，以及免疫机制、安全性问题在理论上还没有解决，因此大大限制了核酸疫苗的推广应用。因此，目前预防和治疗措施仍然不能经济而有效地控制我国疫病的发展，迫切需要找到一种有效的防治措施或治疗方法。
[0004]干扰素（interferon，IFN)是最先发现的细胞因子，早在1957年，Issacs等发现，流感病毒处理的细胞产生一种因子，可抵抗病毒的感染，干扰病毒的复制，因而命名为干扰素。是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，如抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫反应等，是机体防御系统的重要组成部分。干扰素系统是目前所知的机体防御反应中出现最早的细胞功能调节系统，在病毒感染几小时之内就起作用，并几乎作用于病毒复制的每一阶段。IFN具有广泛的抑制病毒增殖的活性，既可抑制多种RNA病毒，又可抑制多种DNA病毒的增殖，但不同病毒对INF的敏感性不同，相对而言，有囊膜的病毒最敏感。干扰素抗病毒作用表现在病毒繁殖量减少以及减轻细胞的损伤。干扰素系统被激活后，使动物在1-3周时间内对其它病毒的重复感染有抵抗。IFN的抗病毒作用可体现在病毒感染的各个阶段：（1)感染初期：感染细胞IFN的释放与新病毒粒子的产生几乎同时发生，因此在体液免疫和细胞免疫作用之前，IFN反应是限制病毒繁殖和扩散的主要手段。（2)感染扩散期间：血清干扰素在几分钟内扩散到身体的各种器官，而细胞接触干扰素只需几分钟就产生抗病毒状态，并可显著降低病毒血症水平。（3)病毒感染靶器官后：在感染恢复机制中，干扰素是促进感染恢复的重要因子。数十年的研究表明，干扰素系统与免疫系统的关系十分密切，在抗病毒免疫中可互相协调、互相作用。
[0005]尽管干扰素具有抗病毒、调节免疫等诸多优点，但是目前对于干扰素的应用主要是在人类疾病上。在水产动物界干扰素的应用不常见，且水产界有关干扰素的应用研究多集中的在I型干扰素，对于II型干扰素抗病毒作用的研究几乎没有。
【发明内容】
[0006]本发明要解决上述技术问题，从而提供一种重组质粒pET-IFN y。
[0007]本发明解决上述问题的技术方案如下：
重组质粒pET-IFN y，它是通过以下方法制备的：
(1)、以草鱼RNA为模板，用反转录试剂盒进行反转录和PCR扩增，制得扩增产物；
(2)、扩增产物纯化后连接到T载体，制得连接产物；
(3)、连接产物转化至大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆产物；
(4)、阳性克隆产物进行质粒抽提，用BamHI、Hind III进行双酶切，酶切产物回收IFN y片段，插入原核表达载体pET-30a的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5a，然后抽提质粒进行酶切，得到重组质粒pET-IFN y ；
所述反转录试剂盒的引物如下：
pET-IFN y -U ：CGCGGATCCgattcttggctcaacatgat (酶切位点 BamH I )pET-IFN y -L ：CCCAAGCTTtcattgaacctttttgtg (酶切位点 Hind III)。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种干扰素蛋白。
[0009]干扰素蛋白，它是通过以下方法制备的：
诱导表达：上述重组质粒PET-IFNY转化大肠杆菌，涂布于含抗生素的平板上，培养至平板上出现单克隆菌落，挑取单克隆菌落接种于含抗生素的培养基，培养；得到含有pET-IFNy质粒的大肠杆菌菌种；
重组干扰素蛋白的纯化：将含有pET-IFNy质粒的大肠杆菌菌种接种于含抗生素的培养基，培养，加入IPTG，诱导表达；离心收集菌体，洗涤后，重悬菌体，并加入溶菌酶，超声至液体清亮，离心，分离沉淀和上清，溶解沉淀，然后经Ni-NTA亲和层析获得纯化的融合蛋白。
[0010]本发明的再一个目的是提供上述干扰素蛋白的用途。
[0011]干扰素蛋白的用途，上述干扰素蛋白在鲤科鱼类的免疫保护方面的应用。
[0012]本发明的最后一个目的是提供一种降低鲤科鱼类死亡率的方法。
[0013]降低鲤科鱼类死亡率的方法，将上述纯化的融合蛋白注射于鲤科鱼类腹腔。
[0014]作为上述技术方案的优选，纯化的融合蛋白注射量为0. 5?10Pg/g鱼体重。
[0015]作为上述技术方案的优选，纯化的融合蛋白注射量为0. 5?5Pg/g鱼体重。
[0016]作为上述技术方案的优选，纯化的融合蛋白注射量为1?3Pg/g鱼体重。
[0017]本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种草鱼干扰素原核表达质粒，还提供了一种干扰素蛋白；
2、本发明还通过试验验证了该干扰素蛋白的有效性：为确定IFNy重组蛋白在草鱼体内诱导ISG表达的效果，本技术用2l^g/g鱼体重的IFNy重组蛋白腹腔注射免疫草鱼，并通过实时荧光定量PCR方法检测草鱼肝、脾、肾、肠等4种组织中的ISG，包括IFN、IRF1、IRF7、PKR、STAT3、Mx等基因的转录水平的变化情况；经重组干扰素刺激后，与对照组相比较，这些ISG基因在4种组织中均被强烈诱导表达，其中大多数ISG基因在24 h达到最高水平，在72h内回落到正常水平。这从另一个方面证实IFNy重组蛋白的抗病毒效果。
【附图说明】
[0018]图1是本发明的重组质粒pET-IFNy构建图（A)及酶切鉴定图（B);
图2是本发明的重组质粒pET-IFNy诱导表达电泳图；
图3是本发明草鱼干扰素重组蛋白纯化效果图；
图4是本发明IFNy重组蛋白对CO细胞的抗病毒活性效果图；
图5是本发明经不同剂量IFNy蛋白免疫草鱼抗GCRV的累计死亡率分析图；
图6是本发明腹腔注射IFNy重组蛋白对草鱼IFN刺激基因表达情况的影响图（肝脏和脾脏）;
图7是本发明腹腔注射IFNy重组蛋白对草鱼IFN刺激基因表达情况的影响图（肾脏和肠)。
【具体实施方式】
[0019]以下结合附图对本发明进行进一步的解释说明。
[0020]本【具体实施方式】仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的修改，只要在权利要求的范围内，都将受到法律的保护。
[0021]一、草鱼II型干扰素IFNy基因克隆健康草鱼以5ML/g鱼体重的Poly I:C (lmg/mL)腹腔注射草鱼，诱导3 d后取脾脏组织lOOmg，提取脾脏组织的总RNA，用TRizol (Takara，大连）提取总RNA，实验操作依据说明书进行。提取的RNA用Nanodrop 2000 (Thermo，USA)测定浓度及纯度，用反转录试剂盒SMART? MMLV Reverse Transcriptase (TAKARA，大连）进行反转录和 PCR 扩增，引物如下：pET-IFN y -U ：CGCGGATCCgattcttggctcaacatgat (酶切位点 BamH I )pET-IFN y -L ：CCCAAGCTTtcattgaacctttttgtg (酶切位点 Hind III)
扩增产物采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (爱思进，USA)进行纯化，然后再连接到T载体（Takara，大连)，具体操作步骤均按照说明书所示。连接产物转化至大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆进行测序鉴定，转化和鉴定方法参照《分子克隆实验指南》进行。
[0022]二、草鱼干扰素原核表达载体的构建上述阳性克隆采用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (爱思进，USA)试剂盒进行质粒抽提，然后用BamH I、Hind III (Takara，大连）进行双酶切，酶切产物用AxyPrep DNA GelExtraction Kit (爱思进，USA)回收IFN y片段，插入原核表达载体pET_30a的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5a，然后抽提质粒进行酶切和测序鉴定，重组质粒构建图及酶切鉴定图如图1所