一种体外酶反应合成间苯三酚的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种体外酶反应合成间苯三酚的方法及应用，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]间苯三酚又名1，3，5-三羟基苯，是一种重要的精细化工产品，是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体。黄酮类化合物具有广泛的抗癌、抗心血管疾病的作用，越来越受到药物学家的重视。由间苯三酚合成的抗免疫缺损病毒新药，属于第二代非核苷类逆转录酶抑制剂；由间苯三酸合成的Euglobals类似物能有效抑制Epstein-Barr病毒，具有显著的抗癌作用。目前工业化生产间苯三酚的方法均为化学合成，但在化学合成方法中，因氧化及酸分解过程中产生大量的副产物，使得最终产品的分离提纯比较困难，用简单的物理和化学方法很难得到高纯度产品。
[0003]采用生物法合成间苯三酚可以改善化学法的各种弊端，包括原料来源困难、副产物较多、分离提纯困难等。随着生物学的发展，研究者开始探讨生物法合成间苯三酚可行性。在细菌界，假单胞菌(Pseudomonas sp.)是间苯三酸类化合物的来源。Achkar等对焚光假单胞菌Pf-5的2，4-DAPG合成基因簇进一步的研究表明，其产物除了 2，4-DAPG和MAPG夕卜，也能够合成间苯三酚。在PhlD基因完整的条件下，分别突变phlA、phlB和phlC，结果都是既不能检测到最终产物2，4-DAPG也不能检测到中间产物MAPG，但却能检测到间苯三酚。根据以上实验结果推测PhlD蛋白在催化间苯三酚合成过程中起了关键作用，PhlD能够催化小分子底物碳酰CoA聚酮缩合形成长链及长链环化、苯环乙酰化过程中的一系列反应，是合成间苯三酚的关键基因。2011年，Cao等构建了间苯三酚合成的工程大肠杆菌，以葡萄糖为底物通过糖酵解途径到乙酰辅酶A，乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶的作用下生成丙二酸单酰辅酶A，然后由聚酮合酶的缩合作用生成间苯三酚。并通过在大肠杆菌体内强化多重抗性激活因子marA基因和乙酰辅酶A羧化酶基因簇的表达水平，使间苯三酚在大肠杆菌内的合成得到较大的提高，达到了 3.8g/L。
[0004]尽管前人的研究已经使间苯三酚的生物合成成为可能，但是目前发酵法生产间苯三酚，由于间苯三酚本身作为一种杀菌剂，对大肠杆菌的正常生长和代谢具有严重的抑制作用，使间苯三酚的发酵浓度还较低。本研究团队采取了代谢工程手段强化间苯三酚抗性基因的表达水平来提高大肠杆菌抗性能力，使大肠杆菌对间苯三酚的抗性由2g/L提高到约3.5g/L，并采用在线发酵分离耦合的萃取方法，发酵液中间苯三酚浓度提高到约4.5g/L，但离工业化生产水平还存在一定差距。另外由于发酵过程中乙酸等副产物的生成及菌株本身生长的代谢需求等，生物发酵法合成间苯三酚的产率还较低，制约了生产成本的降低。另一方面基于传统代谢工程思路的工程菌生产间苯三酚的过程中需要采用诱导剂和抗生素等，增加了生产过程成本。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种体外酶反应合成间苯三酚的方法，所采取的技术方案如下:
[0006]本发明的目的在于提供一种体外酶反应合成间苯三酚的方法。该方法是分别构建含有乙酰辅酶A合成酶ACS基因，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accA，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accB，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accC，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accD及聚酮合成酶基因PhlD的重组载体，将重组载体分别转化到宿主菌中后过表达，利用超声波破碎菌体，分离纯化后获得酶液，按比例混合酶液和反应底物后通过体外酶反应合成间苯三酚。
[0007]所述方法的步骤如下:
[0008]I)分别将乙酰辅酶A合成酶ACS基因，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accA，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accB，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accC，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accD及聚酮合成酶基因phlD连接到质粒载体上，获得重组载体；
[0009]2)将步骤I)所得重组载体分别转化宿主菌中并过表达，获得培养液；
[0010]3)经步骤2)所得培养液经过预处理后，再利用超声波破碎培养液中的菌体，离心分离破碎菌液后保留上清液，再利用镍柱纯化上清液，获得酶液；
[0011]4)将步骤3)所得酶液按一定比例与反应底物混合后密封静置反应。
[0012]优选地，步骤I)所述质粒载体，是质粒pET_28a(+)。
[0013]优选地，步骤2)所述宿主菌，是大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0014]优选地，步骤3)所述预处理，是将培养液在4°C，6000rpm下离心5min后，用50mMpH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次后，再用5mL磷酸盐缓冲液重悬；所述超声破碎，是在20KHz，60W下处理20min ;所述离心分离，是在4°C，13000rpm条件下离心20min。
[0015]优选地，步骤4)所述酶液按比例混合，乙酰辅酶A羧化酶的四个亚基按照亚基accA:亚基 accB:亚基 accC:亚基 accD = (0.9-1.1): (0.918-1.122): (1.494-1.826):(0.972-1.188)的比例混合；乙酰辅酶A合成酶，乙酰辅酶A羧化酶和聚酮合成酶按乙酰辅酶A合成酶:乙酰辅酶A羧化酶:聚酮合成酶=3?7:3?7:3?7的比例混合，且乙酰辅酶A合成酶，乙酰辅酶A羧化酶和聚酮合成酶浓度为60-140 μ g/L ;步骤4)所述反应底物，ImL反应体系反应底物的种类和浓度是:10mM Tris-HCl buffer，20mM乙酸钾，30mMNaHCO3, 1mM MgCl2, 1mM KC1，ImM 生物素，20mM ATP，ImM CoA，ImM 二硫苏糖醇。
[0016]所述方法的具体步骤如下:
[0017]I)分别将乙酰辅酶A合成酶ACS基因，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accA，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accB，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accC，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accD及聚酮合成酶基因phlD连接到质粒载体pET_28a(+)上，获得重组载体；
[0018]2)将步骤I)所得的重组载体分别转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中获得，重组大肠杆菌，加入终浓度为0.25mmol的IPTG后，在20°C下培养12_18h，获得培养液；
[0019]3)将步骤2)所得的培养液在4°C，6000rpm下离心5min后，用50mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次后，再用5mL磷酸盐缓冲液重悬，利用超声波仪在20KHz，60W的条件下处理20min，再于4°C，13000rpm条件下离心20min，保留上清液，在利用镍柱纯化所得上清液后获得纯化酶液；
[0020]4)将步骤3)所得的纯化酶液中乙酰辅酶A羧化酶的四个亚基按照亚基accA:亚SaccB:亚基accC:亚基accD = 1:1.02:1.66:1.08的比例混合，再将乙酰辅酶A合成酶，乙酰辅酶A羧化酶和聚酮合成酶按照等比例混合，每种酶的浓度为100 μ g/L,混合后在于反应底物进行混合，最终形成每毫升如下的反应体系:10mM Tris-HCl buffer，20mM乙酸钾，30mM NaHCO3, 1mM MgCl2, 1mM KC1，ImM生物素，20mM ATP，ImM CoA，ImM二硫苏糖醇，在室温下静置反应5h。
[0021]所述任一方法用于生产间苯三酚及以间苯三酚为中间产物的化学品。
[0022]本发明获得的有益效果如下:
[0023]1.本发明构建的方法能够在体外利用酶反应将乙酸转化为间苯三酚；
[0024]2.利用本发明方法，精确调控各酶及辅助因子的用量，确定了在间苯三酚合成途径中的乙酰辅酶A合成酶及乙酰辅酶A羧化酶；
[0025]3.构建一个可控的调控体系，控制间苯三酚的合成，同时为细胞内的间苯三酚合成代谢调控提供依据。
[0026]4.对于解决全细胞合成体系中间苯三酚对细胞的抑制问题提供了新的解决思路。
【附图说明】
[0027]图1为间苯三酚液相图谱。
[0028]图2为酶液浓度与间苯三酚之间的关系。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0030]以下实施例中所用试剂、材料、仪器和方法，未经特殊声明，均为本领域常规试剂、材料、仪器和方法，均可以通过商业渠道获取。
[0031 ] 实施例中所用的乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶各亚基、聚酮合成酶基因分别连接到大肠杆菌表达载体上pET-28a(+)上转化至大肠杆菌BL21 (DE3);得到的阳性克隆培养至OD600为0.6?0.8，加IPTG终浓度为0.25mmol，20°C培养12?18小时获得。
[0032]实施例1
[0033]间苯三酚合成代谢相关酶的体外反应，其具体步骤如下: