λ干扰素在制备抗汉滩病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及新型干扰素一 λ干扰素 （interferon lambda，IFN-λ)在制备抗汉滩病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndromes，HFRS)临床主要特 征表现为发热、出血以及肾损害，我国是受HFRS危害最为严重的国家，HFRS患者占世界的 90%以上，其病原体主要是汉滩病毒（hantaan virus，HTNV)，人可通过气溶胶吸入、伤口、 消化道等途径感染病毒。长久以来，人们一直致力于对抗体和细胞毒性T细胞的研宄，希望 开发出疫苗遏制HTNV的感染，但未见显著突破。目前临床对HFRS治疗仍是对症治疗为主， 并结合抗病毒治疗。而抗病毒药物主要是利巴韦林，有两种治疗方案：（1)大剂量疗法，该 法可将病死率降至2%以下，用药5天可清除患者体内的病毒，但患者有可逆性骨髓抑制， 红细胞减少；(2)小剂量疗法，该方案可改善症状，降低病死率，无不良反应，但患者体内病 毒是否清除尚未证实。因此，抗病毒药物研宄具有重要的实际意义，寻找一种高效、安全、副 作用少的抗病毒药物的研宄势在必行。
[0003] 干扰素（interferon，IFN)是脊椎动物受多种因素（如微生物）诱导产生的一组 抗病毒蛋白质，主要包括双链RNA活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PKR)、2 ; -5'寡腺苷 酸合成酶（OAS)和黏病毒抵抗蛋白A GTP酶（MxA)等，可影响细胞的运动和免疫过程，具有 抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的 差异，可将干扰素分为I型（IFN- α / β )和II型（IFN- γ )。α干扰素已临床用于治疗HFRS， 但治疗剂量报道不一，从早年应用白细胞干扰素20万单位/天到近年应用重组基因工程干 扰素300万单位/天，总疗程3-7天不等。也有报道比较了干扰素联合利巴韦林与单用利巴 韦林的疗效，认为联合治疗组干扰素对HFRS早期患者虽然能缩短充血与渗血症状和肾区 叩击痛，越期率高，但并不能减少并发症、降低病死率，相反由于干扰素的毒副作用，联合治 疗组患者的平均退热时间长，头痛、肾痛症状消失慢，血小板计数恢复正常慢，故联合使用 干扰素和利巴韦林治疗HFRS的利弊仍需进一步实验研宄。最近干扰素家族增添一位新成 员JII型干扰素即IFN-λ，已发现其与其他型干扰素一样具有抗病毒作用，如：乙型肝炎病 毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、人类巨细胞病毒（HCMV)、人类免疫缺陷病毒（HIV)等，而且 IFN- λ抗HCV研宄已进入II期临床阶段，但IFN- λ抗HTNV作用经科技查新还未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供了一种λ干扰素在制备抗汉滩病毒药物以及λ干扰素在 制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物中的应用。
[0005] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
[0006] I、IFN- λ对HTNV感染靶细胞一 Α549细胞的毒性：Α549细胞加入不同浓度 (Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)的 IFN- λ 1、IFN- λ 2,培养 72h，通过 MTT 法检测 IFN- λ 1、IFN- λ 2的细胞毒性作用，选择无毒或弱毒浓度的IFN- λ 1、IFN- λ 2进行随后的 抗HTNV作用研宄。
[0007] 2、IFN- λ抗HTNV活性的测定：
[0008] (I) IFN- λ抗HTNV在Α549细胞中的感染作用效果：
[0009] I) IFN- λ I、IFN- λ 2 (100ng/mL)预处理 Α549 细胞 24h，HTNV 76-118 株感染 2h 后 用PBS洗三次，再加入含2%胎牛血清的DMEM(V/V)培养基，37°C 5% CO2 (V/V)培养；分别 于感染第1天、第4天、第7天和第10天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因 的表达，来判断IFN- λ抗HTNV作用的时间效果。
[0010] 2)不同浓度正^人1、正^人2(浓度分别为1叩/1^、10叩/1^、1001^/11^、10001^/ mL)预处理Α549细胞24h，HTNV 76-118株感染2h后用PBS洗三次，再加入含2 %胎牛血清 的DMEM(V/V)培养基，37°C 5% CO2 (V/V)培养；于感染第7天收集相应细胞，应用实时定量 RT-PCR检测HTNV S基因的表达，来判断IFN- λ抗HTNV作用的剂量效果。
[0011] (2)IFN-A处理Α549后诱导产生的抗病毒因子！IFN-λ 1、IFN-X2(100ng/mL)处 理八549细胞311、611、1211、2411，应用实时定量1?1'-?0?检测抗病毒因子(^3-1、136-56、]\^^和 MxB的表达，用以判断IFN-λ 1、IFN-λ 2预处理A549细胞以后可能发挥作用的细胞因子。
[0012] (4)用过表达MxB的慢病毒载体，包装成慢病毒后，感染Α549细胞，用嘌呤霉素筛 选出稳定细胞系A549-Ctrl (对照组）、A549-MxB (MxB过表达组）。HTNV 76-118株感染稳 定细胞系2h，后用PBS洗三次，再加入含2 %胎牛血清的DMEM (V/V)培养基，37°C 5 % CO2 (V/ V)培养；分别于感染第4天和第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的 表达，判断抗病毒作用。
[0013] (5)用沉默MxB的shRNA的慢病毒质粒，包装成慢病毒后，感染A549细胞，用 潮霉素B筛选出稳定细胞系A549-shCtrl (对照组）、A549-shMxB-l (MxB沉默组之一）、 A549-shMxB-2 (MxB 沉默组之二）。IFN- λ 1、IFN- λ 2 (100ng/mL)预处理稳定细胞系 24h， HTNV 76-118株感染2h，后用PBS洗三次，再加入含2%胎牛血清的DMEM(V/V)培养基， 37 °C 5 % CO2 (V/V)培养；分别于感染第4天和第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测 HTNV S基因的表达，判断抗病毒作用。
[0014] (6) IFN-λ 2对HTNV感染BALB/c乳鼠具有治疗作用。IFN-λ 1、IFN-λ 2均为水溶 性药物且两者间氨基酸同源性达81 %，因此动物实验只选取了 IFN- λ 2进行抗病毒实验。 HTNV感染后24h给药，随着药物剂量的增加，感染乳鼠死亡率显著降低，平均生存时间明显 延长。
[0015] (7) IFN- λ 2在乳鼠体内能抑制HTNV复制。感染后24h给药，能显著减轻感染组织 (肾、脑）病理改变，降低HTNV核酸表达水平。
[0016] 通过上述研宄，本发明发现λ干扰素能诱导多种抗病毒因子产生，其在体外和体 内均能抑制汉滩病毒感染，且无毒副作用。λ干扰素在体外能保护细胞免受汉滩病毒的感 染，在体内能提高汉滩病毒感染动物的生存率及延长平均生存天数，减轻组织病理损害，降 低病毒核酸水平。基于此，λ干扰素可用于制备抗汉滩病毒的药物，同时也可用于制备治 疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物。
[0017] 本发明与现有抗病毒干扰素相比，具有以下优点和效果：
[0018] 1、抗病毒作用时间快，HTNV感染后第7天，IFN-λ 1、IFN-λ 2 (100ng/mL)抑制病 毒复制和感染的效果最佳；随着药物浓度的增加（从Ing/mL到lOOOng/mL)，IFN- λ抑制病 毒复制作用相应增加。
[0019] 2、IFN-λ抗HTNV病毒作用具有多种途径，可诱导多种抗病毒因子的产生尤其是 MxB蛋白对HTNV感染的Α549细胞有明显抑制作用，表明IFN-λ可用于HTNV感染的治疗。
[0020] 3、在体内IFN-λ对HTNV感染具有明显的治疗作用，且无明显毒副作用。
【附图说明】
[0021] 图1是MTT法检测IFN- λ I、IFN- λ 2的细胞毒性结果图。
[0022] 图2是RT-PCR检测HTNV感染IFN- λ预处理的Α549细胞后不同时间点的HTNV S 基因的表达结果图，*表示P < 〇· 05,林表示P < 0· 01，林*表示P < 0· 001。
[0023] 图3是RT-PCR检测HTNV感染不同浓度IFN- λ预处理的Α549细胞后的HTNV S 基因的表达结果图，*表示P < 〇· 05,林表示P < 0· 01，林*表示P < 0· 001。
[0024] 图4是RT-PCR检测IFN- λ预处理的Α549细胞后的抗病毒因子OAS-1、ISG-56、 MxA和MxB的表达结果图，*表示P < 0· 05, #表示P < 0· 01，表示P < 0· 001。
[0025] 图5是RT-PCR检测HTNV感染MxB过表达Α549细胞后的HTNV S基因的表达结果 图，MxB过表达组（Α549-ΜχΒ)与对照组（A549-Ctrl)比较，*表示Ρ〈0. 05 表示Ρ〈0. 01。
[0026] 图6是RT-PCR检测HTNV感染MxB被沉默表达的Α549细胞后HTNV S基因的表达 结果图，MxB沉默组（shMxB-l、shMxB-2)与对照组（shCtrl)比较，#表示Ρ〈0. 01。
[0027] 图7是不同处理组BALB/c乳鼠颅内接种HTNV 28天的存活率结果图。
[0028] 图8是不同处理组BALB/c乳鼠颅内接种HTNV 14天后脑、肾组织的病理切片。
[0029] 图9是RT-PCR检测不同处理组BALB/c乳鼠颅内接种HTNV后脑、肾组织HTNV S基 因的表达结果图，*表示p〈〇. 05vs安慰剂对照组（Pla)、**表示Ρ〈0· 01，林*表示Ρ〈0· 001。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指 明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0031] IFN-λ 1、IFN-λ 2均为含178个氨基酸、分子量19. 8kDa的蛋白质，其制备参见文 献（Kotenko SV，Gallagher G，Baurin VV，et al. Nat Immunol, 2003, 4(1): 69-77)，且其已 商品化，下述实施例中所用IFN- λ I、IFN- λ 2购于P印roTech公司，SDS-PAGE和HPLC分析 其纯度达98%以上。
[0032] 实施例1MTT法检测IFN- λ 1/ λ 2的细胞毒性作用
[0033] DMEM(含10%胎牛血清，V/V)培养的Α549细胞用胰酶消化后稀释成1~3Χ IO5个 /mL，每孔100 μ L接种于96孔板。细