专利名称：一种检测干扰素诱导动物抗病毒状态的实验方法
技术领域：
本发明涉及一种检测动物抗病毒状态的实验方法，尤其涉及一种动物应用干扰素或其诱导剂之后抗病毒状态的建立和维持的检测和评价方法。
背景技术：
干扰素是动物机体非特异性免疫体系的重要组成部分，与特异性免疫体系的抗体 相比，干扰素是更早出现的抗病毒因子，病毒感染后几个小时即可产生并发挥作用。干扰素 本身对病毒没有直接的杀灭或抑制作用，而是作为一种信号分子，促使其他细胞表达抗病 毒蛋白，建立起“抗病毒状态”。干扰素与相临细胞表面上的干扰素受体(Interferon Receptors, IFNARs)结合， IFNARs在胞浆内的结构发生磷酸化以激活各种信号传递因子。在多个活化的因子结合到干 扰素激活基因(interferonstimulating genes, ISGs)的调控区后，ISGs会迅速表达。ISGs 的表达产物主要包括2' -5'寡聚腺苷酸合成酶系统(2-50AS)、双链RNA依赖的蛋白激酶 (double-stranded-RNA-dependent protein kinase,PKR)禾口 Mx 蛋白等。一旦病毒进入细 胞，病毒核酸激活2-5-0AS，2-5-0AS催化三磷酸腺苷(ATP)多聚化，形成长度不定的寡聚腺 苷酸，寡聚腺苷酸进而活化细胞中处于潜伏状态的核酸酶F，它可以特异性切开病毒mRNA 并使其降解；病毒复制时形成的dsRNA与ATP能激活PKR，活化的PKR可使病毒合成的“起 始因子2”(elf2)发生磷酸化而失去活性，从而阻断病毒蛋白的合成；Mx蛋白可通过与病毒 转录酶作用来抑制病毒基因的转录。如此，病毒在宿主细胞内的复制就受到了多环节的阻 断，从而干扰了病毒的感染。由于近年来，病毒性感染给我国畜禽、水产养殖业带来日益严重的经济损失，以干 扰素为核心的非特异性免疫技术日益受到人们重视。但在临床实践及干扰素制剂研究开 发中，一直缺乏一种方便而又科学地评价干扰素所诱导动物建立起的抗病毒状态的实验方 法。干扰素活性的测定，一般用细胞病变抑制法，测定周期长，影响因素复杂。而且，这种测 定方法不能反映干扰素进入动物体后是否能够诱导机体建立起抗病毒状态，以及抗病毒状 态持续的时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测干扰素诱导动物抗病毒状态的实验方法，它解决了 动物通过非特异性免疫体系建立抗病毒状态的快速、定量测定问题，对于评价干扰素或其 诱导剂在养殖动物的应用具有重要意义，适用于动物在应用干扰素或其诱导剂后评价其抗 病毒状态的建立及维持时间。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案实验方法的工作 过程a 动物应用干扰素或其诱导剂后一定内，提取特定组织的总RNA ；b 根据动物Mx蛋白 基因序列，设计合适的保守序列引物，以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增；c 将扩增 产物进行琼脂糖凝胶电泳，扫描电泳目的条带光密度，并进行定量分析；d 根据Mx的蛋白转录水平，判断动物抗病毒状态的建立和维持时间。本发明利用分子生物学方法快速检测动物的抗病毒状态，避免了人工感染实验及 细胞培养实验(干扰素活性测定的细胞病变抑制法)所具有的复杂性和不确定性；所涉及 到的总RNA的提取、设计的引物、PCR操作试剂、缓冲液，可以进一步整合为检测试剂盒，广 泛应用于干扰素及其诱导剂应用于防治动物病毒性感染，快速检测其抗病毒状态的建立和 维持时间。本发明具有以下有益效果解决了动物通过非特异性免疫体系建立抗病毒状态的 快速、定量测定问题，对于评价干扰素或其诱导剂在养殖动物的应用具有重要意义，适用于 动物在应用干扰素或其诱导剂后评价其抗病毒状态的建立及维持时间。
图1是本发明的工作流程图；图2是本发明大菱鲆腹腔注射POlyI :c后Mx基因的转录水平变化的示意图；图3是本发明PolyI :C对大菱鲆浸泡处理后诱导Mx基因的转录水平的示意图；图4是本发明polyI:C拌料后投喂诱导Mx基因转录水平的示意图。
具体实施例方式参看图1，本具体实施方式
采用以下技术方案实验方法的工作过程a:动物应用 干扰素或其诱导剂后一定内，提取特定组织的总RNA ；b 根据动物Mx蛋白基因序列，设计合 适的保守序列引物，以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增；c 将扩增产物进行琼脂糖 凝胶电泳，扫描电泳目的条带光密度，并进行定量分析；d 根据Mx的蛋白转录水平，判断动 物抗病毒状态的建立和维持时间。本具体实施方式
利用分子生物学方法快速检测动物的抗病毒状态，避免了人工感 染实验及细胞培养实验(干扰素活性测定的细胞病变抑制法)所具有的复杂性和不确定 性；所涉及到的总RNA的提取、设计的引物、PCR操作试剂、缓冲液等，可以进一步整合为检 测试剂盒，广泛应用于干扰素及其诱导剂应用于动物病毒性感染，快速检测其抗病毒状态 的建立和维持时间。本具体实施方式
解决了动物通过非特异性免疫体系建立抗病毒状态的快速、定量 测定问题，对于评价干扰素或其诱导剂在养殖动物的应用具有重要意义，适用于动物在应 用干扰素或其诱导剂后评价其抗病毒状态的建立及维持时间。实施例1 1. 1材料与方法取大菱鲆40尾，腹腔注射PolyI:C(干扰素诱导剂)，分别 于注射药物后0、12、48、72、96、120小时剖取大菱鲆脾脏(每次6尾)，液氮保存备用。 从脾脏提取总RNA，反转录合成cDNA作为模板，以大菱鲆Mx蛋白保守序列设计引物 CTGTTCTGTGCCTTTGTC和CATCGCCGTGATTGGAG，选择59°C为退火温度，33个循环，然后将扩增 产物用含GeneFinder的琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像分析系统成像，并利用软件 GeneTools对目的条带进行分析定量。1.2结果大菱鲆腹腔注射PolyI :C后，24小时内，Mx蛋白的转录水平没有明显变 化，48-96小时，Mx蛋白的转录水平则明显高于对照，至第120小时，则又降低到基础水平。说明，PloyI:C腹腔注射后，诱导大菱鲆的抗病毒状态可从注射后48小时持续到96小时。实施例2:2. 1材料与方法取大菱鲆40尾，将PolyI :C(干扰素诱导剂)溶于海水中药浴1 小时，分别于应用药物后O、12、48、72、96、120小时剖取大菱鲆脾脏(每次6尾)，液氮保存 备用。从脾脏提取总RNA，反转录合成cDNA作为模板，以大菱鲆Mx蛋白保守序列设计引物 CTGTTCTGTGC CTTTGTC和CATCGCCGTGATTGGAG，选择59 °C为退火温度，33个循环,然后将扩 增产物用含GeneFinder的琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像分析系统成像，并利用软 件GeneTools对目的条带进行分析定量。 2. 2结果大菱鲆药浴使用PoIyI C后，24小时内，Mx蛋白的转录水平没有明显变 化，48-120小时，Mx蛋白的转录水平则明显高于对照。说明，PloyI = C药浴处理大菱鲆后， 诱导大菱鲆的抗病毒状态可从用药后48小时持续到120小时。实施例3 3. 1材料与方法取大菱鲆40尾，将PolyI :C(干扰素诱导剂)拌入饵料中投喂， 分别于应用药物后0、12、48、72、96、120小时剖取大菱鲆脾脏(每次6尾)，液氮保存备 用。从脾脏提取总RNA，反转录合成cDNA作为模板，以大菱鲆Mx蛋白保守序列设计引物 CTGTTCTGTGC CTTTGTC和CATCGCCGTGATTGGAG，选择59°C为退火温度，33个循环，然后将扩 增产物用含GeneFinder的琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像分析系统成像，并利用软 件GeneTools对目的条带进行分析定量。3. 2结果大菱鲆拌饵投喂使用PoIyI C后，24小时内，Mx蛋白的转录水平没有明 显变化，48-120小时，Mx蛋白的转录水平则明显高于对照。说明，PloyI:C拌饵投喂大菱鲆 后，诱导大菱鲆的抗病毒状态可从用药后48小时持续到120小时。
权利要求
一种检测干扰素诱导动物抗病毒状态的实验方法，其特征在于它的工作过程为a动物应用干扰素或其诱导剂后一定内，提取特定组织的总RNA；b根据动物Mx蛋白基因序列，设计合适的保守序列引物，以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增；c将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扫描电泳目的条带光密度，并进行定量分析；d根据Mx的蛋白转录水平，判断动物抗病毒状态的建立和维持时间。
2.根据权利要求1所述的一种检测干扰素诱导动物抗病毒状态的方法，其特征在于 它利用分子生物学方法快速检测动物的抗病毒状态，避免了人工感染实验及细胞培养实验 (干扰素活性测定的细胞病变抑制法)所具有的复杂性和不确定性；所涉及到的总RNA的 提取、设计的引物、RT-PCR操作试剂、缓冲液，可以进一步整合为检测试剂盒，广泛应用于干 扰素及其诱导剂应用于动物病毒性感染，快速检测其抗病毒状态的建立和维持时间。
全文摘要
一种检测干扰素诱导动物抗病毒状态的方法，它涉及一种检测动物抗病毒状态的方法。它的工作过程为a动物应用干扰素或其诱剂后一定时间内，提取特定组织的总RNA；b根据动物Mx蛋白基因序列，设计合适的保守序列引物，以提取的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增；c将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扫描电泳目的条带光密度，并进行定量分析；d根据Mx的蛋白转录水平，判断动物抗病毒状态的建立和维持时间；适用于动物在应用干扰素或其诱导剂后评价其抗病毒状态的建立及维持时间。
文档编号C12Q1/68GK101805786SQ20091021574
公开日2010年8月18日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘宗柱 申请人:青岛农业大学